Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN

Chia sẻ: Lan Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc chọn lựa phương pháp ly trích tùy thuộc vào nhiều yếu tố: Việ chọn lự pháp trích tù thuộ và nhiề yế tố – Nguồn ADN: từ máu, niêm mạc, VK, TV, ĐV Nguồ từ máu, mạ TV, – Mục đích sử dụng của ADN được ly trích: PCR, cắt bằng Mục đí sử dụng củ được trích: PCR, bằ Enz. cắt giới hạn, Cloning... giớ hạ – Loại ADN: DNA trong nhân (genomic DNA), ty thể, lạp thể Loại thể lạ thể – Số lượng ADN cần thu được, số mẫu cần ly trích ượng cầ được, cầ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN

Acid Nucleic Các kỹ thuật phân tích ADN 1. Kỹ thuậ thuật ly trí trích ch ADN 2. Sự cắt nố nối ADN 3. KT điệ điện di ADN 4. KT PCR 1
Acide Deoxyribo Nucleic (ADN) Base Purine (2 vò vòng nhân): Adenine, Adenine, Guanine Base Pyrimidine (1 vò vòng): Thymine, Cytosine Đường + base nitơ = Đườ Nucleoside Nucleoside + acide P = Nucleotide Tóm lược về sự sao chép ADN Sao chép ADN trong TB (in vivo): Mở xoắn mạch kép Tạo con mồi (primer) Kết nối các Nu. tự do Hoàn chỉnh mạch và đóng xoắn Sao chép ADN trong ống nghiệm (in vitro): Mở xoắn mạch kép : nhiệt độ Tạo con mồi (primer) : con mồi tổng hợp Kết nối các Nu. tự do : Taq Polymerase Đóng xoắn : nhiệt độ Kỹ thuật PCR (công nghệ gien) 2
Kỷ thuật ly trích ADN Ly trích ADN – Phương pháp nào ? Việ Việc chọ chọn n lự lựa phương pháp pháp ly trí trích ch tù tùy thuộ thuộc và vào nhiề nhiều yế yếu tố tố: – Nguồ Nguồn ADN: từ từ máu, máu, niêm mạmạc, VK, TV,TV, ĐV – Mục Mục đíđích sử sử dụng dụng củ của ADN đượđượcc ly trí trích: ch: PCR, PCR, cắt bằ bằng Enz. cắt giớ giới hạ hạn, Cloning... – Loại Loại ADN: DNA trong nhân (genomic DNA), ty thể thể, lạ lạp thể thể – Số lượng ượng ADN cầ cần thu đượ được,c, số mẫu cầ cần ly trí trích ch 3
Các bước cơ bản của qui trình ly trích ADN 1. Phá vở vách TB và màng nguyên sinh chất phóng thích các thành phần của TB. 2. Ức chế các Enz. phân hủy DNA và ARNm (DNases, RNases). 3. Tách nucleic acid (ADN, ARN) ra khỏi các thành phần khác của TB. • PP Tách ly/kết tủa • PP hấp phụ (Adsorption) • PP ly tâm dựa trên sự khác nhau về tỉ trọng 4. Thu nhận ADN: hòa tan//kết tủa 5. Bảo quản ADN: hòa tan trong H2O hay TE 6. Kiểm tra số lượng và chất lượng ADN Vật liệu - hóa chất sử dụng Phá vở cấu trú trúcc TB: + Cố Cối/chà máy xay phương pháp i/chày, máy pháp vậ vật lý lý + Nitơ Nitơ lỏng lỏng + Cá Các enzymes (Pectinase, (Pectinase, Cellulase, Cellulase, Protease) + NaOH NaOH + nhi nhiệệt độ độ Loại Loại bỏ bỏ các các mả mảnh vởvở, cá các thà thành nh phầ phần khá khácc trong TB: + Dishwashing detergent + Phenol/Chloroform Thu nhậ nhận ADN qua kế kết tủ tủa + Isopropyl alcohol + Ethanol 100% 4
Phá vở cấu trúc TB bằng cơ học Yêu cầu: - Thao tác nhanh - Không quá ‘thô bạo’ - Có sự hiện diện của buffer ly trích (chất ức chế Dnase) - Thự Thực hiệ hiện trong điề điều kiệ kiện lạ lạnh (Ức chế chế hoạt hoạt độ động củ của Enz.) Nước tNy (rữa bát) có tác dụng gì ? • Mỗi TB được bao bọc bởi màng TB (phospholipid) • ADN nằm trong nhân, và cũng được bao bọc bởi màng nhân Phải phá vở màng TB để phóng thích ADN 5
N ước tNy (rữa bát) có tác dụng gì ? N ước tNy có tác dụng phá vở màng TB vì tấn công vào lipid (chất béo) và protein trong cấu tạo màng Không chỉ có màng TB và màng nhân bị phá vở, mà màng của tất cả các bào quan (ty thể, lạp thể) cũng bị phá vở. Vậy, thành phần nào còn lại ? • Protein • Carbohydrate (Đường) • DN A 6
PP Tách ly/Kết tủa N guyên tắ tắc: dự dựa và vào mứ mức độ độ hòa hòa tan khá khácc nhau củ của các các phân tử tử để phân tá tách PP Tách ly/Kết tủa Bước 3: Tách ly bằng dung môi hữu cơ Mix thoroughly with Aqueous an equal volume of organic solvent Centrifuge Collect aqueous phase e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Interphase Organic Perform additional extractions for increased purity Hổn hợp dịch Phần ddịch nước chưa các phân tử hòa trích sau khi phá vỡ màng TB, bao tan trong nước bao gồm cả acid nucleic. gồm acid nucleic Phần dung môi hữu cơ chứa protein, và các thành phần lipid. N hững thành phần không hòa tan khác của TB (các mãnh vở TB) sẽ nằm ở phần solid (ở giữa 2 phần ddịch) 7
PP Tách ly/Kết tủa Bước 4: Thu nhận ADN (kết tủa) Before After Bước 5: bảo quản ADN Supernatant 70% EtOH Centrifuge Wash Centrifuge Pellet Dissolve pellet (H2O, TE, etc.) Thêm cồn và • Pellet down nucleic acids. muối vào để làm • Wash pellet with 70% ethanol to remove kết tủa tù ddịch residual salts and other contaminants. nước thu ở bước 3 • Discard ethanol and allow pellet to dry. Vai trò của các hóa chất được sử dung trong phương pháp ly trích 8
Phenol/Chloroform = Tinh khiết DN A Phenol: làm biến tính protein, các thành phần không hòa tan hình thành ở phần solid giữa 2 phần ddịch Chloroform: có tác dụng gia tăng độ nhớt của phần dung môi hữu cơ (+ làm biến tính protein) Isoamyl alcohol: có tác dụng ngăn cản sự trộn lẫn giữa 2 phần ddịch Tác dụng của Enz. Protease? - Enz. Protease có tác dụng phân hủy các protein liên kết với ADN , đòng thời phân hủy các Enz. trong TB chất co tác dụng làm toornhaji ADN (VD: DN ase). - Xử ly với Protease trong quá trình ly trích làm gia tăng hàm hượng ADN nguyên vẹn thu được. 9
Tác dụng của muối trong ddịch ly trích ? - Trong ddịch đệm của protease đã có chứa sẳn thành phần muối. - N a+ (trong muối N aCl) liên kết với gốc phosphate của ADN , làm trung hòa điện tích của phân tử ADN . - Sự hiện diện của N aCl giúp các phân tử ADN có thể nhóm lại với nhau, thay vì đNy nhau ra do điện tích của chúng sự kết tủa ADN dễ dàng hơn khi cồn được thêm vào. Kết tủa ADN bằng cồn Cồn có tác dụng tách nước khỏi ADN : • Cho phép các cations liên két với gốc phosphat của ADN • Giảm lực đNy nhau giữa các phân tử ADN • Làm cho các phân tử ADN tập trung với nhau kết tủa 10
Tại sao cần sử dụng cồn lạnh ? - DN A không hòa tan trong cồn. - Thêm cồn lạnh sẽ làm cho các phân tử ADN kết lại thành khối và kết tủa. - Phân tử DN A kết tủa dưới dạng chùm sợi như ợi bông gòn. - Các bọt khí nhỏ trong ddịch liên kết với nhau, khi ADN kết tủa hình thành các bọt khí lớn, nổi lên, sẽ kéo theo ADN từ phần ddịch nước nổi lên phần dung môi hữu cơ ở phia trên. CTAB: CTAB Chất tNy chứa Cation CH3 CH3 N+ Br- CH3 C16H33 (MC 6.61-6.62) (low ionic conditions) 11
Kỹ thuật Cắt (Digestion) và nối (Ligation) ADN Enz. DN A nuclease -A-C-G-A-A-T-T-C-C-A Exonuclease | | | | | | | | | | Cắt cầu nối -T-G-C-T-T-A-A-G-G-T phosphodiester ở đầu mút -A-C-G-A-A- A G T Không sử dụng để T C A cloning | | | | | C T G | -T-G-C-T-T- A -A-C-G-A-A-T-T-C-C-A Endonuclease | | | | | | | | | | Cắt cầu nối -T-G-C-T-T-A-A-G-G-T phosphodiester ở giữa phân tử ADN -A-C-G-A-A T-T-C-C-A Được sử dụng trong | | | | | | | | | | KT cloning -T-G-C-T-T A-A-G-G-T 12
Enz. endonucleases chuyên biệt và không chuyên biệt Endonuclease không chuyên biệt: (loại I, III) Vị trí cắt ngẫu nhiên Không sử dụng trong cloning Endonuclease chuyên biệt: (loại II) Cắt ở vị trí nhận diện rất chuyên biệt Được sử dụng trong cloning Điểm nhận diện (Recognition site) của Enz. cắt giới hạn loại II Điểm nhận diện thường có trình tự ‘đối xứng’ (palindromic): “Able was I, ere, I saw Elba” 5’-GGATCC-3’ Bam H1 site: 3’-CCTAGG-5’ 13
Một số Enz. cắt giới hạn (6EBL) Aat II GACGTC AsiS I GCGATCGC Acc65 I GGTACC Ava I CYCGRG Acc I GTMKAC Avr II CCTAGG Aci I CCGC Bae I AC(N 4)GTAPyC Acl I AACGTT BamH I GGATCC Afe I AGCGCT Ban I GGYRCC Afl II CTTAAG Ban II GRGCYC Afl III CRYGT Bbs I GAAGAC Age I ACCGGT Bbv I GCAGC Ahd I GACN N N N N GTC BbvC I CCTCAGC Ale I CACN N N N GTG Bcc I CCATC Alu I AGCT BceA I ACGGC Alw I GGATC Bcg I CGAN N N N N N TGC AlwN I CAGN N N CTG BciV I GTATCC Apa I GGGCCC Bcl I TGATCA ApaL I GTGCAC Bfa I CTAG Apo I RAATTY BfrB I ATGCAT Asc I GGCGCGCC BfuA I ACCTGC Ase I ATTAAT BfuC I GATC Isoschizomer Isoschizomers: các enz. cắt giới hạn khác nhau, nhưng có cùng trình tựu điểm nhận diện (VD: MboI và Sau3A là nhữnhững Isochizomer, vì có cùng cùng trì trình tự tự điểm nhận diện GATC) Complete Isoschizomers: Cùng điểm nhận diện (recognized site) Cùng điểm cắt (cleaved sites) VD: Hpa II và Msp I (C↓CGG tạo đầu dính (cohensive ends) Incomplete Isoschizomers: Cùng điểm nhận diện (recognized site) Khác nhau ở điểm cắt (cleaved sites) VD: Sma I (CCC↓GGG tạo đầu bằng (blunting ends) Xma I (C↓CCGGG tạo đầu dính (cohensive ends) 14
Các dạng đầu cắt tạo ra bởi Enz. cắt giới hạn 5’ protruding ends 3’ protruding ends Đầu dính (Cohensive ends) SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC-OH + p -GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG- p OH-CCC-5’ Đầu bằng (blunting ends) Tần suất cắt của Enzyme giới hạn (Ước Ước lượng ượng dựa theo qui luậ luật tổ tổ hợp) 4 nucleotide (A, T, C, G) + Giả định: + 4 N u. hiện diện với số lượng bằng nhau (tần số ¼) + 4 N u. sắp xếp ngẫu nhiên trong genome (qui luật tổ hợp) Ví dụ: Trình tự đoạn nhận diện (recognition site) AT Tần suấ suất = 1/4 A x 1/4 T = 1/16 1/16 AT (1/4)2 ATT Tần suấ suất = 1/4 A x 1/4 T x 1/4 T = 1/64 1/64 AT (1/4)3 ATTGCG Tần suấ suất = 1/4096 1/4096 ATTGCG (1/4)6 n N u. Tần suấ suất = (1/4)n Độ Độ dài dài đoạn oạn nhậ nhận diệ diện ↑ Khoảng Khoảng cách cách giữ giữa các các điể điểm cắt ↑ Số Số lượng ượng điể điểm cắt ↓ 15
Bản đồ cắt bởi Enz. giới hạn (Restriction Map) Restriction Map = Bản đồ vị trí cắt của các enz. giới hạn trên 1 đoạn ADN cho trước Công cụ hổ trợ để xác định Restriction Map = các chương trình vi tính chuyên dụng cho phân tích ADN (VD: BioEdit, CLC Free Workbech) Ứng dụng của Restriction map: + Xác định vị trí cắt của 1 Enz giới hạn trên đoạn ADN khảo sát + Ước lượng số lượng và kích thước của các đoạn ADN sẽ nhận được khi sử dụng 1 hay nhiều Enz. giới hạn để cắt 1 đoạn ADN khảo sát Lưu ý !!! Hiệu quả của Enz. giới hạn phụ thuộc: + Độ sạch của ADN + Buffer thích hợp + N hiệt độ thích hợp + Tỉ lệ: số lượng ADN /số lượng Enz. giới hạn + Tính chất của Enz. giới hạn 16
N ối ADN (DN A ligation) N ối ADN (DN A ligation) = hình thành cầu nối phospodiester giữa 2 mạch ADN , nếu đầu 5’ có gốc Phosphat. Enz Ligase: Ligase của phage T4 Co-factor: ATP sử dụng cho cả đầu dính và đầu bằng Ligase của E. coli Co-factor: N AD+ chỉ sử dụng cho đầu dính Đầu của 2 đoạn ADN cần ‘tương thích’ để nối thành công G-A-T-C-C-N-N- -N-N-G A-A-T-T-C-N-N- -N-N-G | | | | | | | | | | | | | | | | G-N-N- -N-N-C-T-T-A-A G-N-N- -N-N-C-T-T-A-A Compatible cohesive ends Non-compatible cohesive ends ‘tương thích’ : + dạng đầu giống nhau + có thể tạo l/kết bổ sung -N-N-A-G C-T-N-N- -N-N-G C-T-N-N- | | | | | | | | | | | | | | | -N-N-T-C G-A-N-N- -N-N-C-T-T-A-A G-A-N-N- Compatible blunt ends Non-compatible cohesive/blunt ends 17
Kỹ thuật điện di (Electrophoresis) Điện di ADN (DN A Electrophoresis) N guyên tắc • Gốc phosphate của của ADN ADN mang điệ điện tí tích âm phân tử tử ADN sẽ sẽ di chuyể chuyển về về cực dương trong môi trườ trường ng điệ điện. • Điệ Điện tí tích âm đượ đượcc phân bố bố đều đều dọ dọc phân tử tử ADN tốc độ di chuyể chuyển của của ADN ADN phụ phụ thuộ thuộc và vào kích kích thướ thướcc của của chúng. chúng. • Tốc độ độ di chuyể chuyển còn còn phụ phụ thuộ thuộc và vào môi trườ trườngng gel sử sử dụng. dụng. Kích Kích thướ thướcc ADN nhỏ nhỏ hoặ hoặc khá khácc biệ biệt về về k/th k/thước ước củ của cá các phân tử tử ADN rấ ất r n nhỏ hỏ = gel polyacrylamide Kích Kích thướ thướcc ADN lớlớn hoặ hoặc khá khácc biệ biệt về về k/th k/thước ước củ của cá các phân tử tử ADN lớ lớn = gel agarose 18
Kỹ thuật điện di ADN Phân loạ loại: + Điệ Điện di trên gel agarose + Điệ Điện di trên gel Polyacrylamide Các bước tiến hành Bước ước 1: ChuN ChuNn bị bị mẫu điệ điện di Bước ước 2: ChuN ChuNn bị bị gel và và điệ điện di Bước ước 3: N huộ huộm mẫ mẫu đọ đọc kế kết quả quả Chọn Chọn gel thí thích ch hợ hợp Đối Đối tượ tượng ng ADN điệ điện di và và mục mục tiêu nghiên PP nhuộ nhuộm mẫ mẫu thí thích ch hợ hợp cứu 19
(Pulse Field Gel Electrophoresis) ‘Độ phân giải’ của gel Agarose Gel Electrophoresis 20