Ảnh hưởng của chế độ cho ăn đến hoạt động enzym tiêu hóa ở ấu trùng cá giò (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ CHO ĂN ĐẾN HOẠT ĐỘNG ENZYM<br /> TIÊU HÓA Ở ẤU TRÙNG CÁ GIÒ (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766)<br /> EFECTS OF FEEDING REGIME ON ACTIVITY OF INTESTINAL DIGESTIVE<br /> ENZYMES IN COBIA (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) LARVAE<br /> Nguyễn Quang Huy1, Elin Kjørsvik2<br /> Ngày nhận bài: 30/7/2017; Ngày phản biện thông qua: 11/8/2017; Ngày duyệt đăng: 25/9/2017<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Enzym từ ruột ấu trùng cá giò gồm alkaline phosphatase (AP), leucine aminopeptidase (LAP) và<br /> leucine-alanine peptidase (leu-ala) xuất hiện ngay từ khi ấu trùng ăn thức ăn ngoài (2 ngày tuổi) và hoạt tính<br /> của chúng tăng mạnh cùng với sự tăng trưởng của cá. Hoạt tính chuyên biệt (specific activity) của enzym màng<br /> thành ruột (bbm) AP tăng từ ngày 23 đến 26 ngày tuổi ở cá sử dụng hoàn toàn thức ăn sống (LF) (P < 0,05)<br /> và tăng từ 26 đến 30 ngày tuổi (P < 0,05) ở cá sử dụng thức ăn công nghiệp (L-MD) từ 17 ngày tuổi. Sự thay<br /> đổi về hoạt tính chuyên biệt của enzym bbm LAP có xu hướng tăng tương tự như bbm AP nhưng không sai khác<br /> trong cùng một nghiệm thức (P> 0,05). Chỉ số trưởng thành (chỉ số phát triển đầy đủ) của ruột ấu trùng cá (gut<br /> maturation index), là tỉ lệ giữa hoạt tính cá thể (individual activity) của enzym màng thành ruột bbm AP hoặc<br /> bbm LAP với enzym nội bào leu-ala, tăng lên cùng với gia tăng hoạt tính của enzym bbm AP ở mỗi nghiệm<br /> thức. Kết quả thí nghiệm này cho thấy ruột ấu trùng cá giò trưởng thành ở 26 ngày tuổi tại nghiệm thức LF<br /> và muộn hơn ở 30 ngày tuổi tại nghiệm thức L-MD. Ấu trùng cá sử dụng thức ăn công nghiệp từ 17 ngày tuổi<br /> giảm chỉ số trưởng thành của ruột và tỉ lệ sống của cá ở nghiệm thức L-MD so với cá ở nghiệm thức LF.<br /> Từ khóa: Cá giò, Rachycentron canadum, alkaline phosphatase, leucine aminopeptidase, leucine-alanine<br /> peptidase<br /> ABSTRACT<br /> Intestinal enzymes of cobia larvae including alkaline phosphatase (AP), leucine aminopeptidase (LAP)<br /> and leucine-alanine peptidase (leu-ala) were detected at first feeding and increased exponentially with larval<br /> growth. Specific activity of brush border memberane (bbm) AP increased from 23 to 26 days post hatch (dph)<br /> in larvae fed exclusively live feed (LF) (P < 0.05), and increased from 26 to 30 dph (P < 0.05) in larve co-fed<br /> with micro diet (L-MD) from 17 dph. The specific activity of bbm LAP had the same trend as for bbm but no<br /> significance was detected within each treatment (P> 0.05). Gut maturation index, defined as ratio of individual<br /> activity of bmm AP or bbm LAP and cytosolic enzyme leu-la, increased as incensement in activity of bbm AP in<br /> each treatment. This study showed that maturation of larval intestine occurred on 26 dph in the LF, and later<br /> on 30 dph in the L-MD treatment. Weaning cobia larvae from 17 dph delayed gut maturation and associated<br /> with a lower survival compared to those fed live feed.<br /> Keywords: Cobia, Rachycentron canadum, Alkaline phosphatase, Leucine aminopeptidase,<br /> Leucine-alanine peptidase<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 1, Email : nguyen.huy@ria1.org<br /> Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Nauy<br /> <br /> 42 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Số 3/2017<br /> quan trọng để hiểu nhu cầu dinh dưỡng và khả<br /> <br /> Cá giò Rachycentron canadum là loài cá<br /> <br /> năng tiêu hóa của cá khi sử dụng thức ăn tổng<br /> <br /> rất thích hợp cho phát triển nuôi biển, do chúng<br /> <br /> hợp. Trong nghiên cứu này chúng tôi tìm hiểu<br /> <br /> có tốc độ tăng trưởng nhanh, giá trị thương<br /> <br /> sự phát triển ba enzyme trong ruột ấu trùng cá<br /> <br /> phẩm cao [1], [7], [9].Tuy nhiên, sản xuất giống<br /> <br /> giò là AP, LAP and leu-ala, đồng thời đánh giá<br /> <br /> cá giò ổn định về chất lượng và sản lượng để<br /> <br /> ảnh hưởng của việc sử dụng thức ăn tổng hợp<br /> <br /> phục vụ nuôi thương phẩm vẫn còn là vấn đề.<br /> <br /> sớm từ 17 ngày tuổi (dph) đến quá trình trưởng<br /> <br /> Trong hệ thống sản xuất giống thâm canh, Holt<br /> <br /> thành ruột ấu trùng cá giò.<br /> <br /> và cs (2007) cho rằng có thể nâng cao tỉ lệ<br /> sống và tăng trưởng của ấu trùng cá giò nếu có<br /> <br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> thể luyện chúng sử dụng thức ăn công nghiệp<br /> <br /> 1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu<br /> <br /> sớm để thay thế Artemia. Dạ dày của ấu trùng<br /> <br /> Nghiên cứu được tiến hành trên ấu trùng<br /> <br /> cá giò đã bắt đầu hình thành và hoạt động<br /> <br /> cá giò (Rachycentron canadum), giai đoạn<br /> <br /> chức năng trong khoảng 12 đến 20 ngày tuổi.<br /> <br /> từ 0 đến 33 ngày tuổi. Thí nghiệm được thực<br /> <br /> Hoạt tính của enzym tiêu hóa tuyến tụy cũng<br /> tăng trong thời gian này, gợi ý rằng ấu trùng<br /> cá có thể sử dụng thức ăn công nghiệp ở thời<br /> điểm này [5]. Tuy nhiên, khả năng tiêu hóa của<br /> ấu trùng cá giò không chỉ phụ thuộc vào phát<br /> triển của dạ dày mà còn phụ thuộc vào quá<br /> trình trưởng thành của tế bào ruột enterocytes<br /> (intestinal cells). Quá trình trưởng thành của tế<br /> bào ruột được xác định khi ấu trùng cá chuyển<br /> từ hình thức tiêu hóa của ấu trùng sang hình<br /> thức tiêu hóa của cá trưởng thành [11]. Ở ấu<br /> trùng cá, quá trình phát triển đầy đủ của ruột cá<br /> dường như xảy ra trong khoảng thời gian ngắn,<br /> đặc trưng bởi gia tăng đột ngột về hoạt tính<br /> chuyên biệt (specific activity) của enzym màng<br /> tế bào ruột (brush boder membrane, bbm) như<br /> enzym alkaline phosphatase (AP) và leucine<br /> aminopeptidase (LAP), trùng với quá trình<br /> <br /> hiện tại Phân viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy<br /> sản Bắc Trung bộ, thị xã Cửa Lò, Nghệ An.<br /> Phân tích enzym được tiến hành tại phòng thí<br /> nghiệm của Đại học Khoa học và Công nghệ<br /> Nauy, Trondheim, Nauy. Thời gian tiến hành thí<br /> nghiệm từ 4/2008-12/2009.<br /> 2. Bố trí thí nghiệm<br /> Ấu trùng cá giò được ấp nở từ trứng thụ<br /> tinh của cùng 1 cá giò mẹ bằng phương pháp<br /> cho đẻ tự nhiên trong bể (72 m3). Ấu trùng cá<br /> giò được ương nuôi trong hai bể composite<br /> 500 L đáy chóp. Mật độ nuôi ban đầu là 45 ấu<br /> trùng/L. Trong bể thứ nhất (nghiệm thức LF),<br /> ấu trùng được cho ăn rotifer làm giàu từ khi<br /> mới mới miệng (2 ngày tuổi) đến ngày thứ 12<br /> (3 - 8 rotifer/mL, 2 lần/ngày), và nauplius artemia<br /> Vĩnh Châu Artemia franciscana (AF) từ 7 - 8<br /> <br /> giảm hoạt tính liên tục theo thời gian của các<br /> <br /> ngày tuổi (dph), sau đó là nauplii artemia Great<br /> <br /> enzym nội bào ở tế bào ruột là leucine-alanine<br /> <br /> Salt Lake (EG) A. franciscana (INVE Thailand<br /> <br /> peptidase (leu-ala). Quá trình trưởng thành này<br /> <br /> Ltd., Thái Lan) cho đến khi kết thúc thí nghiệm<br /> <br /> chịu ảnh hưởng bởi thành phần dinh dưỡng<br /> <br /> vào 33 ngày tuổi (mật độ cho ăn 1 - 3 con/mL,<br /> <br /> trong thức ăn của ấu trùng cá [11]. Từ trước<br /> <br /> 1 - 4 lần/ngày). Ở bể thứ 2 (nghiệm thức L-MD),<br /> <br /> đến nay chưa có nghiên cứu nào về phát triển<br /> <br /> ấu trùng được nuôi với chế độ cho ăn tương<br /> <br /> enzym ở ruột ấu trùng cá giò. Hiểu biết tốt hơn<br /> <br /> tự như bể thứ nhất đến 17 dph. Từ thời điểm<br /> <br /> về sinh lý tiêu hóa của ấu trùng cá giò là yếu tố<br /> <br /> này chúng được cho ăn kết hợp với thức ăn<br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 43<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> tổng hợp Otohime microdiet (Marubeni Nisshin<br /> Feed Co. Ltd, Indonesia) cỡ từ 200 - 900 µm<br /> trong 10 ngày, sau đó chỉ cho ăn thức ăn tổng<br /> hợp đến 33 dph. Trong quá trình ương, vi tảo<br /> biển Nanochloropsis oculata được cho vào<br /> trong cả hai bể từ ngày 1-15 dph với mật độ<br /> 12-15x104 tế bào/mL. Nhiệt độ nước giai động<br /> trong khoảng 26 - 300C, độ mặn 28 - 33‰,<br /> oxy hòa tan 5,4 ± 0,3 mg/L, pH trong khoảng<br /> 7,6 - 8,0. Ammonia-nitrogen tổng số thấp hơn<br /> 0,1mg/L. Chế độ thay nước trong bể ương<br /> tăng từ 5%/ngày ở 1 dph tăng dần đến 150%/<br /> ngày tại 20 dph và trên 200%/ngày đến khi kết<br /> thúc thí nghiệm.<br /> <br /> (individual activity) là U/larva. Chỉ số trưởng<br /> thành của ruột (gut maturation index) được xác<br /> định là tỉ lệ giữa hoạt tính cá thể của enzym tế<br /> bào màng thành ruột: bbm AP hoặc bbm LAP<br /> với enzym nội bào leu-ala [4].<br /> <br /> 3. Thu và phân tích mẫu<br /> Mẫu ấu trùng cá dùng phân tích enzym<br /> tiêu hóa được thu vào buổi sáng, trước khi cho<br /> cá ăn, vào các thời điểm 2, 4, 7, 13, 17, 23,<br /> 26, 30 và 33 dph cho ấu trùng ở nghiệm thức<br /> LF để nghiên cứu phát triển enzym tiêu hóa ở<br /> ruột cá, và từ ngày 23 - 33dph ở nghiệm thức<br /> L-MD. Ba mẫu ấu trùng/cá con được thu trong<br /> mỗi bể. Số lượng ấu trùng/cá con cho mỗi mẫu<br /> dao động từ 5-20 con, giảm dần theo ngày tuổi.<br /> Sau khi thu, ấu trùng được cho ngay vào ni tơ<br /> lỏng, sau đó bảo quản trong tủ đông ở nhiệt<br /> độ -800C trước khi phân tích. Ấu trùng được<br /> rã đông trên đá lạnh và giải phẫu để lấy phần<br /> ruột dưới kính hiển vi. Ở ấu trùng từ 2 - 4 dph,<br /> phần ruột bao gồm cả phần cơ lưng được lấy.<br /> Đối với ấu trùng lớn hơn 4 dpd, chỉ phần ruột<br /> được giải phẫu tách ra để phân tích enzym.<br /> Các enzym từ tế bào màng thành ruột (brush<br /> border memberane, bbm) chỉ được phân tích<br /> từ ngày 23 dph, khi ruột đã có thể hình thành<br /> các tế bào màng ruột. Phân tích các enzym AP,<br /> LAP, leu-ala, bbm AP, bbm LAP được thực hiện<br /> theo các phương pháp phân tích của Cahu và<br /> Zambonino Infante (1994).<br /> Hoạt tính của enzym được trình bày ở<br /> hai hình thức: hoạt tính chuyên biệt (specific<br /> activity) là mU/mg protein, hoặc hoạt tính cá thể<br /> <br /> ban đầu.<br /> <br /> 44 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Mẫu đo tăng trưởng ấu trùng cá cũng được<br /> thu vào các ngày lấy mẫu phân tích enzym.<br /> Thu 30 con/bể, riêng tại thời điểm kết thúc thí<br /> nghiệm (33 dph) thu 120 con/bể. Chiều dài tiêu<br /> chuẩn (Standard length, SL) được sử dụng. Tỉ<br /> lệ sống của cá được xác định tại thời điểm 10<br /> và 20 dph (bằng cách lấy mẫu) và khi thúc thí<br /> nghiệm (đếm số con còn lại). Tỉ lệ sống (%)<br /> = 100 x (số cá còn lại + số cá lấy mẫu)/số cá<br /> 4. Xử lý số liệu<br /> Phân tích ANOVA một nhân tố và kiểm<br /> định Student-Newman-Keuls (SNK) được sử<br /> dụng để đánh giá sự sai khác mức độ hoạt<br /> động enzym giữa các lần thu mẫu trong cùng<br /> một nghiệm thức. Student’s t-test được sử<br /> dụng để đánh giá sự khác biệt về tăng trưởng,<br /> hoạt tính của enzym giữa hai nghiệm thức<br /> dựa vào các lần lặp mẫu thu từ các nghiệm<br /> thức. Số liệu được thể hiện là giá trị trung<br /> bình ± SE. Số liệu sai khác có ý nghĩa khi<br /> P < 0,05. Phần mềm SPSS 16.0 được sử<br /> dụng để xử lý thông kê và SigmaPlot 10.0<br /> được sử dụng để vẽ đồ thị.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Tăng trưởng và tỉ lệ sống<br /> Hầu hết ấu trùng ở nghiệm thức cho ăn<br /> kết hợp (L-MD) có thể ăn thức ăn viên vào<br /> ngày 26dph (18,6 ± 0,7mm) trước khi giai đoạn<br /> cho ăn kết hợp dừng lại vào 28dph. Ấu trùng<br /> tăng trưởng từ cỡ 3,1 ± 0,02mm tại thời điểm<br /> nở đến cỡ 20,6 ± 0,6mm ở nghiệm thức cho<br /> ăn hoàn toàn thức ăn sống (LF) và cỡ 21,3 ±<br /> 0,6mm ở nghiệm thức L-MD tại thời điểm kết<br /> thúc nghiệm 33dph (Hình 1).<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> là 19,8%, cao hơn gấp 2 lần cá ở nghiệm<br /> thức L-MD (9,6%). Ấu trùng cá giò sử dụng<br /> thức ăn công nghiệp sớm (từ 16 ngày tuổi)<br /> làm giảm tỉ lệ sống khoảng 40% so với cá<br /> sử dụng hoàn toàn thức ăn sống cũng được<br /> thông báo bởi Faulk và cs (2007). Kết quả<br /> tương tự cũng thấy ở cá vược châu Âu<br /> (Dicentrachus labrax) khi luyện thức ăn công<br /> nghiệp giai đoạn sớm [2].<br /> <br /> Hình 1. Tăng trưởng chiều dài tiêu chuẩn (SL)<br /> của ấu trùng cá giò sử dụng hoàn toàn thức ăn sống<br /> (LF) và ấu trùng cá giò sử dụng thức ăn tổng hợp<br /> từ 17 dph (L-MD)<br /> <br /> Chiều dài của ấu trùng cá ở nghiệm thức<br /> LF cao hơn cá ở nghiệm thức L-MD từ ngày 13<br /> đến 17 dph, trong khi đó xu hướng ngược lại<br /> được thấy từ 26 dph trở đi nhưng sự khác biệt<br /> này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Tỉ<br /> lệ sống của ấu trùng cá tại thời điểm 10 và 20<br /> ngày tuổi không có sự khác biệt giữa hai nghiệm<br /> thức (P> 0,05) nhưng tại thời điểm kết thúc thí<br /> nghiệm tỉ lệ sống của cá ở nghiệm thức LF<br /> <br /> 2. Phát triển enzym tiêu hóa và ảnh hưởng<br /> của chế độ ăn tới sự trưởng thành của ruột<br /> ấu trùng cá giò<br /> Tất cả enzym tiêu hóa của ruột ấu trùng<br /> cá xuất hiện từ 2 dph, khi cá chuẩn bị sử dụng<br /> thức ăn ngoài. Hoạt tính của các enzym AP,<br /> LAP và leu-ala tăng theo tăng trưởng về chiều<br /> dài của cá (Hình 2a, 2b, 2c). Phát hiện này<br /> cũng tương tự kết quả nghiên cứu của Faulk<br /> (2007) khi nghiên cứu enzym tiêu hóa ở tuyến<br /> tụy (pancreas) ở ấu trùng cá giò. Hoạt tính<br /> chuyên biệt của enzym nội bào leu-ala tăng<br /> liên tục từ 2 dph đến 7 dph, sau đó giảm dần<br /> theo tuổi cá ở nghiệm thức LF (Hình 2d).<br /> <br /> Hình 2. Hoạt tính của enzym alkaline phosphase (AP) (a), leucine aminopeptidase (LAP)<br /> (b), leucine-alanine peptidase (leu-ala) (c) và hoạt tính của enzym leu-ala (d) của ấu trùng ở nghiệm thức LF và L-MD<br /> Các chữ khác nhau trên cùng một đường đồ thị thể hiện giá trị khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05). Các biểu tượng khác<br /> nhau (* và ¤) thể hiện sự khác giữ các số liệu nhau trong cùng ngày lấy mẫu giữa hai nghiệm thức<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 45<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Hoạt tính của enzym AP và LAP ở ấu trùng<br /> thuộc nghiệm thức L-MD cao hơn ở ấu trùng<br /> nghiệm thức LF từ ngày 30 dph trở đi, trong khi<br /> đó hoạt tính của enzym leu-ala ở nghiệm thức<br /> L-MD cao hơn LF thể hiện từ 26 dph (Hình 2).<br /> Hoạt tính của enzym tế bào màng thành<br /> ruột bbm AP tăng mạnh (gấp 2 lần) từ 23 dph<br /> đến 26 dph ở nghiệm thức LF (P < 0,05), sau<br /> đó hoạt độ của enzym này duy trì đến 30 dph<br /> <br /> Số 3/2017<br /> trước khi giảm xuống ở 33 dph (Hình 3a). Ở<br /> nghiệm thức L-MD, gia tăng hoạt tính của bbm<br /> AP muộn hơn (tăng khoảng 2,5 lần; P < 0,05)<br /> từ 26 dph đến 30 dph, sau đó hoạt tính của<br /> enzym này có xu hướng giảm xuống ở 33 dph<br /> (Hình 3a). Hoạt tính chuyên biệt của bbm AP ở<br /> nghiệm thức LF cao hơn ở nghiệm thức L-MD<br /> vào ngày 26 dph nhưng thấp hơn vào ngày 33<br /> dph (P < 0,05).<br /> <br /> Hình 3. Hoạt tính của enzym màng tế bào thành ruột alkaline phosphase (bbm AP) (a) và leucine aminopeptidase<br /> (bmm LAP) (b) của ấu trùng ở nghiệm thức LF và L-MD<br /> Các chữ khác nhau trên cùng một đường đồ thị thể hiện giá trị khác nhau có ý nghĩa (P< 0,05). Các biểu tượng khác<br /> nhau (* và ¤) thể hiện các giá trị khác nhau trong cùng ngày lấy mẫu giữa hai nghiệm thức<br /> <br /> Sự thay đổi hoạt độ của enzym bbm LAP<br /> tương tự như bbm AP ở cả hai nghiệm thức (Hình<br /> 3b). Tuy nhiên không có sự sai khác hoạt độ<br /> <br /> của enzym này từ 23-33 dph ở trong cùng<br /> một nghiệm thức và giữa hai nghiệm thức<br /> (P > 0,05).<br /> <br /> Hình 4. Tỉ lệ hoạt độ của bbm alkaline phosphate (AP) (a) và bbm leucine aminopeptidase (LAP) (b) ở màng tế<br /> bào thành ruột (bbm) với hoạt độ của enzym nội bào leucine-alanine peptidase (leu-ala) ở nghiệm thức sử dụng<br /> thức ăn sống (LF) hoặc cho ăn kết hợp với thức ăn viên tổng hợp (L-MD)<br /> Số liệu là giá trị TB ± SE (n = 3). Số liệu trong cùng một ngày tuổi (dph) với kí hiệu chữ (a, b) khác nhau, và các giá trị<br /> của cùng một nghiệm thức với các biểu tượng khác nhau (¤, *) là sai khác có ý nghĩa thống kê (P