Ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên và sức đề kháng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kháng bệnh gan thận mủ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu là nhằm đánh giá ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và đồng thời tăng cường sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên và sức đề kháng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kháng bệnh gan thận mủ

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO Haematococcus pluvialis LÊN HỆ MIỄN DỊCH TỰ NHIÊN VÀ SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) KHÁNG BỆNH GAN THẬN MỦ Võ Minh Sơn1, Văn Thị Thuý1 TÓM TẮT Astaxanthin không những ứng dụng dùng làm chất bổ sung vào thức ăn giúp tăng cường màu sắc của cá cảnh, tăng hàm lượng astaxanthin trong thịt cá hồi mà còn là một trong những chất tăng cường hệ miễn dịch cho các động vật thủy sản. Mục đích của nghiên cứu là nhằm đánh giá ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và đồng thời tăng cường sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Các thông số đáp ứng miễn dịch tự nhiên (hoạt động thực bào, sản sinh oxy hoạt hoá, ly- sozyme), tính mẫn cảm với E. ictaluri và màu sắc thịt của cá tra được xác định sau khi cho ăn thức ăn trộn H. pluvialis (HP) với hàm lượng 0,5% và 1% HP trong 28 ngày. Kết quả thu được tỉ lệ thực bào (PA) của cá tra được ăn với thức ăn trộn HP (0,5% và 1%) cao khác biệt có ý nghĩa (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Peptidoglucan, lipopolysaccharide,..); dịch chết Tế bào bạch cầu (leucocyte) của cá rất từ động-thực vật (Ete, Hde, Glycyrrhizin...); đa dạng bao gồm monocyte, macrophage, chất dinh dưỡng (vitamin C và E); hormone granulocyte và đóng góp trong hệ miễn dịch và cytokine (lactoferrin, interferon, growth không đặc hiệu của cá (Secombes, 1996). Tế bào hormone...); polysaccharide (chitin, chitosan, thực bào bao gồm (neutrophil và macrophage) oligosaccharide...), beta-caroten và astaxanthin đóng vai trò quan trọng như là bức tường đầu được tách chiết từ vi tảo Haematococcus tiên ngăn chặn lại các tấn công của các vi sinh pluvialis (Lorenz và Cysewski, 2000). vật gây bệnh (Ellis, 1999). Astaxanthin hay ketocarotenoid là một Respiratory burst được định nghĩa như là sự trong những chất chiếm ưu thế trong các động bùng nổ oxy hoá (oxidative burst) là quá trình vật thuỷ sản sống trong môi trường biển, chúng sản sinh các chất oxy hoạt hoá ROS (reactive là nguồn nguyên liệu tạo màu đỏ hồng cho thịt oxygen species) bởi tế bào thực bào phagocyte các loài cá (salmon, trout, red sea bream), cá (hay tế bào bạch cầu, leucocyte) có tác dụng tiêu cảnh và nhiều loài giáp xác khác (Cysewski diệt mầm bệnh trong suốt quá trình thực bào, và và Lorenz, 2004). Các loài động vật thủy sản đó là một cơ bảo vệ vật chủ xảy ra thường xuyên không có khả năng tổng hợp astaxanthin trong nhằm chống lại khả năng xâm nhiễm của mầm tế bào, do đó chúng hấp thu astaxanthin từ thức bệnh. Tuy nhiên, sự hoạt động quá mức của các ăn (Goodwin, 1984). Trong môi trường biển, chất oxy hóa mạnh (superoxide anion production astaxathin được sinh tổng hợp từ các loài vi tảo O2-, hydroxyl peroxide H2O2, hydroxy free hay thực vật phù du. Astaxanthin được ứng dụng radical OH-, hypoharous acids OCl-) dẫn xuất từ nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ oxygen (reactive oxygen intermediates, ROIs) sung vào thức ăn nhằm mục đích cung cấp sắc có thể gây hại và độc cho tế bào vật chủ (Dalmo tố, cải thiện sức đề kháng, tăng khả năng sinh và ctv., 1997; Ellis, 1999). Do đó, tế bào vật sản, tăng trưởng, thành thục cho các động vật chủ có cơ chế bảo vệ và chuyển hóa các chất thuỷ sản (Cysewski và Lorenz, 2004). độc (như superoxide radicals) được tạo ra từ Trong nuôi trồng thủy sản, astaxanthin quá trình ROIs bằng các enzyme chống oxy được ứng dụng phổ biến và dùng làm thức hóa (antioxidants) như Superoxide dismutase ăn cho các trang trại nuôi cá hồi, cá dìa và cá (SOD) chuyển hóa O2- thành H2O2, glutathione cảnh nhằm tăng cường màu sắc thịt và ngoại peroxidase (GPx) và catalase (CAT) chuyển hóa hình (Lorenz và Cysewski, 2000). Astaxanthin H2O2 thành nước có lợi cho tế bào (Sampaio và và beta-carotene (100-200 mg/kg thức ăn) từ ctv., 2008; Scandalios, 2005). tảo Dunaliella salina và nấm men đỏ Phaffia Lysozyme là enzyme đóng vai trò rất rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn quan trọng trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên dịch tự nhiên của cá hồi (Oncorhynchus mykiss và nó được phân bố ở động vật có xương và Walbaum) (Amar và ctv., 2004). Cùng tác giả không xương sống (Magnadóttir và ctv., 2005). Amar và ctv. (2000, 2001) cũng nghiên cứu sử Lysozyme được tìm thấy ở dịch nhầy (mucus), dụng beta-carotene và astaxanthin tổng hợp có mô lymphoid, huyết thanh, tế bào trứng, và trong khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên dịch của cơ thể ở động vật thuỷ sản nước ngọt trên cá hồi. Mới đây một nghiên cứu chứng và mặn (Magnadóttir và ctv., 2005; Yano, 1996). minh rằng astaxanthin có khả năng tăng cường Lysozyme là enzyme có khả năng diệt khuẩn, hệ miễn dịch tự nhiên và tăng sức đề kháng của nó phân cắt nối β (1,4) giữa N-acetylmuramic cá bơn Nhật bản (Paralichthys olivaceus) kháng acid và N-acetylglucosamine là hai phân tử cấu bệnh gây ra bởi Edwardsiella tarda (Kim và thành tế bào peptidoglycans của vi khuẩn gram ctv., 2012). dương (Ellis, 1999) và còn có khả năng phân 86 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 giải vi khuẩn gram âm, ký sinh trùng và nấm thức ăn bằng dầu mực (5% v/w lượng thức ăn). (Dalmo và ctv., 1997; Saurabh và Sahoo, 2008). Thức ăn đối chứng sử dụng dầu mực với lượng Do đó việc ứng dụng các hoạt chất sinh học có thể tích tương đương với thức ăn thí nghiệm. khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên của 2.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh các loài động vật thuỷ sản đã nhận được sự quan Vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri Gly09M tâm của các nhà khoa học. được nuôi trên môi trường thạch máu (bổ sung Mục đích của nghiên cứu này là làm sáng 5% máu cừu), ủ 28oC trong 30-36 giờ. Dùng tỏ ảnh hưởng của Haematococcus pluvialis lên tăm bông gạt khuẩn lạc và huyền phù trong đáp ứng hệ miễn dịch tự nhiên bao gồm các dung dịch đệm PBS (10mM sodium phosphate, thông số như hoạt động thực vào (phagocytic 150mM sodium chloride, pH 7,2). Sau đó dựa activity), sản sinh oxy hoạt hoá (superoxide vào đường chuẩn để xác định mật độ vi khuẩn. anion production), lysozyme; và sức đề kháng 2.2.3 Phương pháp xác định LD50 của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi E. Xác định mật độ vi khuẩn E. ictaluri gây ictaluri. Đồng thời ảnh hưởng của HP lên màu chết 50% (LD50) cá tra dựa trên phương pháp sắc thịt của cá tra. của Reed và Muench (1938). Khảo sát tỉ lệ II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU chết của cá sau khi gây nhiễm với vi khuẩn 2.1 Vật liệu E. ictaluri Gly09M (tiêm vào xoang bụng) Tảo Haematococcus fluvialis (HP) chứa 2% với mật độ: 1x103, 1x104, 1x105, 1x106 cfu/cá hàm lượng astaxanthin, được cung cấp từ phòng (trọng lượng trung bình 18g/cá). Từ đó xác định Công nghệ tảo, Viện Công nghệ Sinh học, liều gây chết gấp 2xLD50 cho thí nghiệm cảm Viện Nghiên cứu KHCN Việt Nam. Vi khuẩn nhiễm (Newaj-Fyzul và ctv., 2007). gây bệnh gan thận mủ (Edwardsiella ictaluri 2.2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng lên hệ Gly09M) trên cá tra nhận từ Trung Tâm Quốc miễn dịch tự nhiên và cảm nhiễm Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Cá có trọng lượng trung bình 18,7±2,1 g/ Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ. con được thuần 2 tuần trong bể composite 20 Cá tra giống Pangasianodon hypophthalmus m3, cho ăn bằng thức ăn Green Feed. (18,7±2,1 g/con) được chuyển từ Trung Tâm Giai đoạn cho cá ăn thức ăn bổ sung HP Quốc Gia Giống Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ. trong 28 ngày: Thí nghiệm được tiến hành trong Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu bể kính 100 lít (dung tích 150 lít), mỗi bể chứa Nuôi trồng Thủy sản 2 30 cá, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần với nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu thức đối chứng dương (thức ăn không bổ sung 2.2.1 Chuẩn bị thức ăn thí nghiệm HP), nghiệm thức bổ sung 0,5% HP (w/w) và Thức ăn tổng hợp Green Feed (protein 28%, 1% HP, và nghiệm thức đối chứng âm (thức ăn chất béo 5%, tro 12%, chất xơ 7%, độ ẩm 10%) bổ sung 1% HP). Cá được cho ăn theo tỉ lệ 5% được sử dụng làm thức ăn cho tất cả các thí trọng lượng thân, cho ăn 2 lần/ngày. Nước thay nghiệm. Tảo khô Haematococcus pluvialis được 20-30%/tuần. Sau 28 ngày cho ăn, cá được phân trộn vào thức ăn với hàm lượng 0,5% (tương bổ lại trong bể với 15 con/bể, dùng phương pháp đương astaxanthin 100 mg/kg thức ăn) và 1% tiêm vào xoang bụng tiêm 0,2ml dịch vi khuẩn (tương đương astaxanthin 200 mg/kg thức ăn) (7,65x104 cfu/ml) tương đương với 1,53x104 cfu/ bằng cách hòa tan trong nước muối sinh lý NaCl cá cho nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm 0,85%, trộn đều, sau đó trộn vào thức ăn và để thức thử nghiệm, riêng nghiệm thức đối chứng khô trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó áo âm được tiêm NaCl 0,85% thay cho dịch vi khuẩn gây bệnh. Hàng ngày đếm số cá chết trong mỗi TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 87
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 bể và thu mẫu cá vừa chết kiểm tra vi khuẩn gây thể, dịch tế bào bạch cầu thận trước (500 µl của bệnh trong thận và gan. Thí nghiệm kết thúc khi 2x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15) được hút cá trong cá nghiệm thức không chết trong vòng 3 vào đĩa nhựa nuôi cấy tế bào 12-giếng, và được ngày liên tục. Xác định tỉ lệ bảo hộ RPS (relative ly tâm 400×g khoảng 20 phút ở 4oC. Loại bỏ tế percentage of survival) theo công thức sau: bào không dính bằng cách rửa 3 lần với L-15. RPS = [1 – (số cá chết ở nghiệm thức cho Nhỏ 500 µl dịch Fluorescent latex beat (mật ăn thức ăn thí nghiệm/số cá chết ở nghiệm thức độ hạt 2x107 hạt/ml trong dung dịch L-15) vào cho ăn thức ăn đối chứng)] x 100 giếng chứa tế bào bạch cầu và ủ 2 giờ ở 28oC. 2.2.5 Phương pháp đo các thông số miễn Tiếp tục rửa 3 lần với PBS để loại bỏ các hạt dịch không được thực bào bởi tế bào bạch cầu. Sau đó cố định các tế bào bằng dung dịch formalin Các thông số miễn dịch tự nhiên của cá tra (10%) khoảng 30 phút, sau đó rửa lại 3 lần với sau khi cho ăn bằng thức ăn có trộn HP được PBS. Tế bào cố định được nhuộm với 0,1% xác định tại thời điểm bắt đầu thí nghiệm và sau propidium iodide (81845, Fluka) trong bóng tối. 28 ngày cho ăn. Các tế bào bạch cầu có màu đỏ và hạt latex có Máu của mỗi con cá được lấy bằng ống màu xanh. Phần trăm của tế bào thực bào (PA) tiêm 3ml (24-Gauge) để riêng biệt. Mẫu máu được tính toán trên 100 tế bào dưới kính hiển vi được để nhiệt độ phòng khoảng 30 phút và sau huỳnh quang (Olympus IX50, Tokyo, Japan) và đó giữ ở nhiệt độ 4oC. Thu huyết thanh bằng chỉ số thực bào (PI) được định nghĩa như là số cách ly tâm ở 4000 ×g khoảng 15 phút ở 4oC lượng trung bình của các hạt được thực bào bởi sau 2 giờ ủ đông, sau đó giữ trong tủ lạnh -80oC một tế bào. cho đến khi sử dụng. Huyết thanh được dùng để 2.2.5.3 Sản sinh oxy hoạt hóa (superoxide đo lysozyme. anion production) 2.2.5.1 Phương pháp tách tế bào bạch cầu Hoạt động oxy hoạt hóa (respiratory burst Thận trước (head kidney) của cá tra được activity or superoxide anion production) được thu và rửa bằng L-15 (L1518, Sigma) hai lần và sản sinh từ tế bào bạch cầu của thận trước được nghiền trong 3ml dung dịch L-15. Dịch nghiền phân tích theo phương pháp Cook và ctv. (2001) của thận được lọc qua lưới (100µm) và nhỏ từ từ như đã mô tả nghiên cứu trước đây bởi Yeh và vào ống ly tâm gradian tỉ trọng với 37% và 51% ctv. (2008) bằng cách khử nitroblue tetrazolium Pecoll (P4937, Sigma), ly tâm 400 ×g khoảng (NBT) tạo thành formazan để đo hàm lượng 30 phút ở 4oC. Tế bào bạch cầu (Leucocyte) superoxide. Tóm tắt như sau: dung dịch tế bào được thu hoạch ở khoảng giữa hai lớp Percoll bạch cầu thận trước (100 µl với mật độ 2x106 tế và rửa lại hai lần bằng L-15 ở 2000 rpm khoảng bào/ml trong dung dịch L-15) được cho vào dĩa 10 phút ở 4oC. Tế bào sống được kiểm tra bằng nhựa (96-giếng, Flat bottom, Nunclon surface, dung dịch 0,1% trypan blue (T6146, Sigma), Denmark) đã được phủ trước với 0,2% poly-L- tế bào sống sẽ không nhuộm màu xanh, tế bào lysine (P2636, Sigma) để cải thiện sự bám dính chết nhuộm màu xanh. Mật độ tế bào được điều tế bào lên bề mặt giếng. Đĩa được ly tâm 700 chỉnh 2x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15 và ×g khoảng 20 phút ở 4oC. Sau đó những loại được dùng tất cả các thông số đo như hoạt động bỏ những tế bào không bám dính và rửa lại với thực bào, oxy hoạt hóa (Yeh và ctv., 2008). HBSS (H6648, Sigma). Zymozan (100 µl của 2.2.5.2 Hoạt động thực bào (phagocytic 0,1% zymozan trong dung dịch HBSS) được activity) cho vào giếng để cho phản ứng xảy ra khoảng Phương pháp xác định PA và PI được mô tả 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó rửa zymozan bởi nghiên cứu trước bởi Yeh và ctv. (2008). Cụ bằng 100 µl dung dịch HBSS. Sau đó tế bào 88 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 được nhuộm với 100 µl 0,3% NBT (N5514, Cá ở các nghiệm thức đối chứng và nghiệm Sial) khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng. NBT thức bổ sung 0,5% và 1% HP vào thức ăn sau được loại bỏ và dừng phản ứng bằng 100 µl khi cho ăn 28 ngày, chọn 6 con cho mỗi nghiệm 100% methanol. Fomazan được hòa tan bằng thức tiến hành phi lê và đo màu sắc của thịt. 120 µl dung dịch 2M KOH và 140 µl dung dịch Mỗi con cá được đo tại 2 vị trí ở phần gần đầu DMSO (D2650, Sigma). Sau đó đo độ hấp thu và phần gần đuôi. Xác định màu bằng thiết bị ở bước sóng 630 nm bằng máy ELISA reader. NIPPON DENSHOKU NR 300. Các giá trị đo Oxy hoạt hóa (RBA) được tính như sau: RBA được thể hiện bằng hệ màu L*, a*, b* (CIE, = OD 630 mẫu kích thích (bổ sung zymosan) – 1976) trong đó L* biểu thị độ sáng (lighness) OD 630 mẫu trắng (không bổ sung zymosan). với thang đo từ màu đen đến màu trắng (0-100), 2.2.5.4 Hoạt tính lysozyme a* biểu thị tọa độ màu trên trục đỏ với giá trị Hoạt động lysozyme (serum lysozyme dương (+) và lục với giá trị âm (-), b* tọa độ activity) trong huyết thanh được diễn tả bởi màu trên trục màu vàng với giá trị dương (+) và Ellis (1990) và Obach và ctv. (1993). Phương xanh với giá trị âm (-). pháp cụ thể được trình bày trong nghiên cứu 2.3 Xử lý số liệu trước bởi Yeh và ctv. (2008). Tóm tắt, 10 µl của Multiple comparation (Tukey’s test) được huyết thanh cá được trộn với 200 µl dung dịch sử dụng để kiểm tra sự khác biệt có ý nghĩa giữa Micrococcus luteus (M3770, Sigma) (0,2mg/ml các nghiệm thức bằng phần mềm SPSS 13.0 trong dung dịch đệm 0,05M sodium phosphate, (SPSS Inc., 1989-2004). Số liệu phần trăm (tỉ pH 6,2). Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 27oC và lệ sống và tỉ lệ thực bào) được chuẩn hóa bằng giá trị OD được đo sau 1 và 6 phút ở bước sóng hàm acrsin trước khi xử lý bằng SPSS. Mức 530nm bằng cách sử dụng ELISA reader. Một khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là đơn vị lysozyme được định nghĩa như là lượng p < 0,05. enzyme làm giảm độ hấp thu OD 0,001/phút/ml III. KẾT QUẢ huyết thanh. Hàm lượng lysozyme được tính dựa 3.1 Ảnh hưởng của HP lên hệ miễn dịch vào đường chuẩn của lysozyme (L4631, Sigma). tự nhiên 2.2.6 Phương pháp đo màu sắc của thịt cá tra 3.1.1 Hoạt động thực bào Hình 1. Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn HP sau 28 ngày. Mỗi cột biểu thị số trung bình của 3 lần lặp lại và sai số chuẩn (SE). Số liệu ở cùng thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05). TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 89
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hoạt động thực bào (PA) của tế bào bạch Sản sinh oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu cầu (leucocyte) của cá tra được cho ăn với thức của cá tra sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung HP ăn có bổ sung tảo HP với hàm lượng 0,5% và ở nồng độ 1% tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p 1% tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so < 0,05) và tăng 1,84 lần so với đối chứng (Hình với đối chứng sau 28 ngày cho ăn, và tăng 3,78 2A). Tuy nhiên, hoạt động oxy hoạt hóa của tế và 3,29 lần so với đối chứng (Hình 1A), theo bào bạch cầu ở các nghiệm thức có bổ sung HP thứ tự. Tuy nhiên, PA của các nghiệm thức có khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05). bổ sung HP (0,5% và 1%) khác biệt không có ý 3.1.3 Hoạt tính lysozyme (Lysozyme nghĩa (p > 0,05). Chỉ số thực bào (PI) của cá tra activity) ăn thức ăn có bổ sung HP khác biệt không có ý Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh của nghĩa giữa các nghiệm thức (Hình 1B). cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ sung HP khác 3.1.2 Sản sinh oxy hoạt hóa (superoxide biệt không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức anion production) (Hình 2B). Hình 2. Sản sinh oxy hoạt hoá (A) và hoạt tính lysozyme (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn HP sau 28 ngày. Mỗi cột biểu thị số trung bình của 3 lần lặp lại và sai số chuẩn (SE). Số liệu ở cùng thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0.05). 3.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá tra giống bằng phương pháp tiêm Bảng 1. Liều gây chết 50% (LD50) của cá tra sau khi gây nhiễm với E. ictaluri Liều gây nhiễm Tổng số cá Tổng số cá Tổng số cá Tổng số cá Tỉ lệ chết cộng (cfu/cá) chết sống chết cộng dồn sống cộng dồn dồn (%) 103 23 22 23 32 41,8 104 38 7 61 10 85,9 105 43 2 104 3 97,2 106 44 1 148 1 99,3 PD 0,81446 LD50 1,53x103 CFU/cá 90 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Sau khi cảm nhiễm E. ictaluri ở nồng độ nước muối sinh lý) có tỉ lệ sống 100% sau 8 10 , 104, 105, 106 cfu/cá (trọng lượng trung bình 3 ngày (Hình 3). Tất cả cá ở những nghiệm thức 18,7g/con). Kết quả cho thấy liều gây chết 50% có tiêm E. ictaluri sống sót 100% sau 2 ngày. (LD50) của E. ictaluri là 1,53x103 cfu/cá sau 8 Tuy nhiên, bắt đầu vào ngày thứ 3, cá chết được ngày cảm nhiễm (Bảng 1). Do đó liều vi khuẩn ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng dương và gây bệnh E. ictaluri dùng cho thí nghiệm cảm nghiệm thức bổ sung 200 mg/kg thức ăn. Từ nhiễm chính thức gấp 2 lần LD50, cụ thể là ngày thứ 6 đến thứ 8, tỉ lệ sống của cá tra ở 1,53x104 cfu/cá. nghiệm thức bổ sung 0,5% HP (86,7 ± 3,3%) 3.3 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh và 1% HP (83,3 ± 3,3%) khác biệt có ý nghĩa gan thận mủ (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Bảng 2. Màu sắc của thịt cá tra phi lê sau khi cho ăn thức ăn bổ sung HP (0,5% và 1%) sau 28 ngày Màu sắc thịt của cá tra phi lê sau 28 ngày cho ăn với HP Nghiệm thức L* a* b* Đối chứng 49,4 ± 2,4b 8,6 ± 2,2a 11,0 ± 2,5a 100 mg/kg 54,3 ± 3,4a 9,1 ± 2,1a 13,3 ± 3,2a 200 mg/kg 51,1 ± 2,9b 8,4 ± 3,3a 11,0 ± 1,5a IV. THẢO LUẬN hoạt hoá không khác biệt giữa các nghiệm thức Nhiều nghiên cứu chứng minh β-carotene (Amar và ctv., 2001). Kết quả tương tự khi sử và astaxanthin có khả năng kích thích hệ miễn dụng carotenoid tự nhiên (β-carotene từ tảo dịch tự nhiên của động vật thuỷ sản. Amar và biển Dunaliella salina và astaxanthin từ nấm đỏ ctv. (2001) nghiên cứu ảnh hưởng carotenoid Phaffia rhodozyma) dùng làm thức ăn bổ sung tổng hợp (sử dụng riêng lẻ astaxanthin, cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss Walbaum) canthaxanthin, β-carotene với hàm lượng 100 (Amar và ctv., 2004). Theo nghiên cứu gần đây mg/kg) lên hệ miễn dịch cá hồi (Oncorhynchus nhất của Kim và ctv. (2012) khi sử dụng bột mykiss, 140g) và cho ăn trong 9 tuần, kết quả astaxanthin trộn vào thức ăn cho cá bơn Nhật cho thấy 3 loại carotenoid có khả năng tăng hoạt bản (Paralichthys olivaceus) trong 15 ngày. động thực bào (PA) nhưng khác biệt không có Kết quả cho thấy sản sinh oxy hoạt hoá của tế ý nghĩa so với đối chứng. Trong khi đó chỉ có bào bạch cầu của cá sau khi cho ăn 3 giờ và 24 β-carotene có khả năng tăng cường chỉ số thực giờ giảm khác biệt không có ý nghĩa so với đối bào (PI) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. chứng, nhưng sau thời gian cho ăn 6 giờ và 12 Cùng tác giả Amar và ctv. (2004) khi nghiên cứu giờ thì tăng khác biệt có nghĩa so với đối chứng. bổ sung β-carotene (tảo biển Dunaliella salina) Trong nghiên cứu này, sản sinh oxy hoạt hóa của và astaxanthin (từ nấm đỏ Phaffia rhodozyma) tế bào bạch cầu của cá tra sau khi cho ăn thức với hàm lượng 100 mg/kg và 200 mg/kg khoảng ăn có bổ sung HP ở nồng độ 1% (tương đương 9 tuần cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss, 50g). astaxanthin 200 mg/kg) tăng cao khác biệt có ý Kết quả cho thấy hoạt động thực bào (PA) và nghĩa (p < 0,05) so với đối chứng. Điều này có chỉ số thực bào (PI) tăng ở nghiệm thức bổ sung thể giải thích rằng ảnh hưởng kích thích hệ miễn β-carotene và astaxanthin khác biệt có ý nghĩa dịch tự nhiên của astaxanthin tuỳ thuộc vào vật so với đối chứng. Điều này cũng được chứng chủ, trọng lượng, loại carotenoid và nguồn gốc, minh trong nghiên cứu này, hoạt động thực hàm lượng, thời gian cho ăn và thời gian thu bào tăng gấp 3,78 và 3,29 lần (0,5% và 1% HP mẫu sau khi cho ăn. tương đương với astaxanthin 100 mg/kg và 200 Amar và ctv. (2004) sử dụng carotenoid tự mg/kg) khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. nhiên (β-carotene 34,5% từ tảo biển Dunaliella Tuy nhiên, chỉ số thực bào (PI) của tế bào bạch salina; và astaxanthin 0,5% và xanthophyll cầu cá tra khác biệt không có ý nghĩa giữa các 0,87% từ nấm đỏ Phaffia rhodozyma) dùng nghiệm thức. làm thức ăn bổ sung cho cá hồi (Oncorhynchus Carotenoid tổng hợp (sử dụng riêng lẻ mykiss Walbaum, 125g) cho ăn trong 9 tuần, có astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene với hàm khả năng tăng hàm lượng lysozyme ở nghiệm lượng 100 mg/kg) được trộn vào thức ăn cho thức bổ sung β-carotene khác biệt có nghĩa so cho cá hồi (Oncorhynchus mykiss, 140g) ăn với đối chứng. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trong thời gian 9 tuần, kết quả cho thấy oxy chứng minh lysozyme không ảnh hưởng khi 92 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 bổ sung β-carotene/astaxanthin. Hoạt tính (Supamattaya và ctv., 2005) khác biệt có ý lysozyme tăng ở các nghiệm thức bổ sung nghĩa so với đối chứng, với RPS đạt 25%. Kết β-carotene (40-400mg/kg thức ăn) nhưng khác quả tương tự khi tiêm astaxanthin cho tôm càng biệt không có ý nghĩa so với đối chứng sau khi xanh (Macrobrachium rosenbergii) làm tăng tỉ bổ sung vào thức ăn cho cá hồi (Oncorhynchus lệ sống khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng mykiss) cho ăn 12 tuần (Amar và ctv., 2000). sau khi cảm nhiễm với với vi khuẩn gây bệnh Theo Thompson và ctv. (1995) nghiên cứu bổ Lactococcus garvieae với RPS đạt 35%. Điều sung astaxanthin và vitamin A vào thức ăn cho này phù hợp trong nghiên cứu này, khi sử dụng cá hồi (Oncorhynchus mykiss) khoảng 4 tháng, Haematococcus pluvialis trộn vào thức ăn cho kết quả cho thấy lysozyme huyết thanh không bị cá tra ăn 28 ngày làm tăng cường miễn dịch tự ảnh hưởng. Tuy nhiên, khi nghiên cứu sử dụng nhiên đồng thời tăng tỉ lệ sống của cá khác biệt kết hợp giữa astaxanthin và vitamin cho kết quả có ý nghĩa so với đối chứng sau khi cảm nhiễm dương tính lysozyme. Amar và ctv. (2001) thử với E. ictaluri và đạt RPS 58% ở nghiệm thức nghiệm bổ sung các loại carotenoid tổng hợp như 1% HP (200 mg astaxanthin/kg thức ăn) và 67% astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene (100mg/ ở nghiệm thức 0,5% HP (100 mg astaxanthin/ kg) và vitamin A, C, E cho cá hồi (Oncorhynchus kg) thức ăn. mykiss) ăn trong 9 tuần. Kết quả cho thấy Nghiên cứu ảnh hưởng carotenoid lysozyme huyết thanh ở nghiệm thức có bổ sung (β-carotene, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin, vitamin và astaxanthin/β-carotene tăng cao khác astaxanthin) lên màu sắc của da và thịt phi lê, biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên ở nồng độ carotenoid trong thịt của cá nheo Mỹ nghiệm thức sử dụng astaxanthin/ β-carotene (Ictalurus, punctatus) trong khoảng 12 tuần không bổ sung vitamin, lysozyme huyết thanh cho ăn. Kết quả cho thấy cá nheo Mỹ có thể khác biệt không có nghĩa so với đối chứng. tích luỹ sắc tố vàng (lutein và zeaxanthin), sắc Tăng cường hệ miễn dịch và đồng thời tố đỏ hay tím (canthaxanthin và astaxanthin) tăng cường tỉ lệ sống vật chủ sau khi cảm trong thịt và cho màu vàng (Li và ctv., 2007). nhiễm với các vi khuẩn gây bệnh thông qua Trong nghiên cứu này, khi thức ăn trộn với bổ sung các chất tăng cường hệ miễn dịch Haematococcus pluvialis 0,5% và 1% (với hàm (immunostimulator) trong đó có nhóm vitamin lượng astaxanthin 100 và 200 mg/kg thức ăn) B, vitamin C, vitamin E (Galaz và ctv., 2010; cho cá tra ăn trong thời gian 4 tuần không ảnh Sakai, 1999) và β-carotene, astaxanthin (Kim hưởng đến màu sắc của thịt cá tra. Điều này có và ctv., 2012; Supamattaya và ctv., 2005). Theo thể thời gian cho ăn ngắn nên cá tra chưa tích nghiên cứu gần đây nhất của Kim và ctv. (2012) luỹ được màu của astaxanthin. khi sử dụng bột astaxanthin trộn vào thức ăn V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ cho cá bơn Nhật bản (Paralichthys olivaceus) Sử dụng Haematococcus pluvialis với trong 15 ngày, kết quả cho thấy astaxanthin liều lượng 0,5% và 1% (100 mg và 200 mg có khả năng tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên astaxanthin/kg thức ăn) có khả năng tăng cường và tăng sức đề kháng của cá bơn Nhật bản hệ miễn dịch tự nhiên như tăng hoạt động thực (Paralichthys olivaceus) kháng bệnh gây ra bởi bào gấp 3,78 và 3,29 lần so với đối chứng theo Edwardsiella tarda (Kim và ctv., 2012). Một thứ tự, hoạt tính sản sinh oxy hoạt hóa của cá nghiên cứu khác sử dụng dịch chiết tảo biển tra được cho ăn 1% HP tăng 1,84 lần và khác Dunaliella (chứa hàm lượng β-carotene 2%) biệt có ý nghĩa so với đối chứng và đồng thời trên tôm sú (Penaeus monodon) có khả năng tỉ lệ sống của cá tra tăng 26,6% và 23,3% cao tăng cường sức đề kháng và tỉ lệ sống của tôm hơn so với đối chứng theo thứ tự, sau khi cảm kháng virus gây hội chứng đốm trắng WSSV nhiễm với E. ictaluri. Ngoài ra sử dụng tảo H. TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 93
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 pluvialis ảnh hưởng đến màu sắc (đỏ và vàng) Publication No. 15. Colorimetry. Commission sau khi cho ăn 28 ngày. Tóm lại, H. pluvialis có International de l’Eclairage. Paris. tiềm năng dùng làm chất tăng cường hệ miễn Cook, M. T., Hayball, P. J., Hutchinson, W., Nowak, B., and Hayball, J. D., 2001. The efficacy of a dịch tự nhiên và tăng cường sức đề kháng của commercial β-glucan preparation, EcoActiva™, cá tra kháng bệnh gan thận mủ. on stimulating respiratory burst activity of head- Cần tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời kidney macrophages from pink snapper (Pagrus gian cho ăn, tần suất cho ăn lên chất lượng thịt auratus), Sparidae. Fish & Shellfish Immunology 11, 661-672. cá tra. Cysewski, G. R., and Lorenz, R. T., 2004. Industrial PHẦN CẢM ƠN production of microalgal cell-mass and secondary Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ products-species of high potential Haematococcus. kinh phí từ đề tài ″Nghiên cứu công nghệ nuôi In: Richmond, A. Handbook of microalgal culture: Biotechnology and applied phycology. Blackwell vi tảo Haematococcus pluvialis và công nghệ Science Ltd, USA. pp: 1-566 chiết xuất astaxanthin″ cấp Bộ Nông Nghiệp Dalmo, R. A., Ingebrigtsen, K., and Bøgwald, và Phát Triển Nông Thôn thuộc chương trình J., 1997. Non-specific defence mechanisms công nghệ sinh học thuỷ sản năm 2010-2012. in fish, with particular reference to the Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Sinh học thực reticuloendothelial system (RES). Journal of Fish Diseases 20, 241-273. nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các bạn bạn đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi Ellis, A., 1990. Lysozyme assay. p: 101-103. In: Stolen J.S., D.P. Fletcher, B.S. Anderson, and B.S. trong quá trình thực hiện đề tài. Robertson (eds). Techniques in fish immunology. USA: SOS Publication. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ellis, A. E., 1999. Immunity to bacteria in fish. Fish & Amar, E. C., Kiron, V., Satoh, S., Okamoto, N., and Shellfish Immunology 9, 291-308. Watanabe, T., 2000. Effects of dietary β-carotene Reed, L. J., and Muench, H., 1938. A simple method on the immune response of rainbow trout of estimating fifty percent endpoints. American Oncorhynchus mykiss. Fisheries Science 66, Journal of Epidemiology 27, 493-497. 1068-1075. Galaz, G. B., Kim, S. S., and Lee, K. J., 2010. Effects Amar, E. C., Kiron, V., Satoh, S., and Watanabe, T., of different dietary vitamin E levels on growth 2001. Influence of various dietary synthetic performance, non-specific immune responses, carotenoids on bio-defence mechanisms in and disease resistance against Vibrio anguillarum rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). in parrot fish (Oplegnathus fasciatus). Asian- Aquaculture Research 32, 162-173. Australasian Journal of Animal Sciences 23, Amar, E. C., Kiron, V., Satoh, S., and Watanabe, 916-923. T., 2004. Enhancement of innate immunity in Goodwin, T. W., 1984. In: The Biochemistry of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) carotenoids. Volume I & II. Chapman & Hall, associated with dietary intake of carotenoids from London. natural products. Fish & Shellfish Immunology Kim, S.-S., Song, J.-W., Kim, K.-W., and Lee, K.- 16, 527-537. J., 2012. Effects of Dietary Astaxanthin on Anderson, D. P., 1992. Immunostimulants, adjuvants, Innate Immunity and Disease Resistance against and vaccine carriers in fish: application to Edwardsiella tarda in Olive Flounder Paralichthys aquaculture. Anual Review of Fish Diseases 2, olivaceus. The Israeli Journal of Aquaculture - 281-307. Bamidgeh 740. Bricknell, I., and Dalmo, R. A., 2005. The use of Li, M. H., Robinson, E. H., Oberle, D. F., and immunostimulants in fish larval aquaculture. Fish Zimba, P. V., 2007. Effects of Various Dietary & Shellfish Immunology 19, 457-472. Carotenoid Pigments on Fillet Appearance and CIE, 1976. Official Recommendations on Uniform Pigment Absorption in Channel Catfish, Ictalurus Color Space, Color Difference Equations punctatus. Journal of the World Aquaculture and Metric Color Terms. Suppl. No. 2 to CIE Society 38, 557-563. 94 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Lorenz, R. T., and Cysewski, G. R., 2000. Commercial Scandalios, J. G., 2005. Oxidative stress: molecular potential for Haematococcus microalgae as perception and transduction of signals triggering a natural source of astaxanthin. Trends in antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Biotechnology 18, 160-167. Medical and Biological Research 38, 995-1014. Magnadóttir, B., Lange, S., Gudmundsdottir, S., Secombes, C. J., 1996. The non-specific immune system: Bøgwald, J., and Dalmo, R. A., 2005. Ontogeny cellular defenses. In: Iwama, G. and Nakanishi, T. of humoral immune parameters in fish. Fish & (eds) The fish immune system organism, pathogen, Shellfish Immunology 19, 429-439. and environment (Fish physiology). p: 63-103. , Newaj-Fyzul, A., Adesiyun, A. A., Mutani, A., San Diego: Academic Press Inc. Ramsubhag, A., Brunt, J., and Austin, B., 2007. Supamattaya, K., Kiriratnikom, S., Boonyaratpalin, M., Bacillus subtilis AB1 controls Aeromonas and Borowitzka, L., 2005. Effect of a Dunaliella infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, extract on growth performance, health condition, Walbaum). Journal of Applied Microbiology 103, immune response and disease resistance in black 1699-1706. tiger shrimp (Penaeus monodon). Aquaculture Obach, A., Quentel, C., and Bandin, L. F., 1993. 248, 207-216. Effects of alpha-tocopherol and dietary oxidized Thompson, I., Choubert, G., Houlihan, D. F., and fish oil on the immune response of sea bass Secombes, C. J., 1995. The effect of dietary vitamin Dicentrarchus labrax. Disease of Aquatic A and astaxanthin on the immunocompetence of Organisms 15, 175-185. rainbow trout. Aquaculture 133, 91-102. Sakai, M., 1999. Current research status of fish Yano, T., 1996. The non-specific immune system: immunostimulants. Aquaculture 172, 63-92. humoral degense. In: Iwama, G. and T. Nakanishi Sampaio, F. G., Boijink, C. L., Oba, E., dos Santos, (eds). The fish immune system organism, L. B., Kalinin, A. L., and Rantin, F. T., 2008. pathogen, and environment (Fish physiology), Antioxidant defenses and biochemical changes in Academic Press, 105-157. pacu (Piaractus mesopotamicus) in response to Yeh, S.-P., Chang, C.-A., Chang, C.-Y., Liu, C.-H., single and combined copper and hypoxia exposure. and Cheng, W., 2008. Dietary sodium alginate Comparative Biochemistry and Physiology Part administration affects fingerling growth and C: Toxicology & Pharmacology 147, 43-51. resistance to Streptococcus sp. and iridovirus, and Saurabh, S., and Sahoo, P. K., 2008. Lysozyme: an juvenile non-specific immune responses of the important defence molecule of fish innate immune orange-spotted grouper, Epinephelus coioides. system. Aquaculture Research 39, 223-239. Fish & Shellfish Immunology 25, 19-27. THE EFFECTS OF Haematococcus pluvialis ON INNATE IMMUNE AND RESISTANCE OF STRIPPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) AGAINST TO BACILLARY NECROSIS Vo Minh Son1, Van Thi Thuy1 ABSTRACT Astaxanthin is not only using as supplemented diatary for enhancing pigmentation of ornamental fish, increasing astaxanthin in Rainbow trout flesh but also enhancing immune responses of aquatic animal. The aim of this study is to evaluate the effects of Haematococcus pluvialis on innate im- mune response (phagocytic activity, superoxide anion production, lysozyme activity) and disease resistance of Stripped catfish to Bacillary necrosis caused by Edwardsiella ictaluri. Non-specific TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013 95
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 immune parameters of Stripped catfish fingerling, its susceptibility to E. ictaluri and flesh color were determined when the fish were fed diets containing Haematococcus pluvialis at 0% (control), 0,5% and 1% for 4 weeks. Results showed that phagocytic activity (PA) of fish fed 0,5% and 1% of Haematococcus pluvialis diets were significantly higher than those of fish fed the control diet after 4 weeks of feeding, and increased 3,78 and 3,29-fold, respectively, compared to the control group. Howerver, phagocytic indexes (PI) were not significantly different between the groups. Superoxide anion production of head kidney leucocytes of fish fed diet containing 1% HP was significantly higher than those of fish fed the control diet and increased 1.84-fold, compared to control group. However, lysozyme activity of fish was not significant difference between groups. Fish fed 0,5% and 1% HP containing diets had significantly higher survival rates than those of fish fed the control diet after challenge with E. ictaluri, and increased by 26,6% and 23,3%, respectively, compared to control group. Furthermore, there was no effect of HP on flesh fish color after fish fed diets contain- ing HP for 4 weeks. We therefore recommend dietary Haematococcus pluvialis administration at 0,5% and 1% to enhance immunity and resistance against. Key words: Haematococcus pluvialis, innate immune, Bacillary Necrosis of Pangasius, astaxanthin, Ed- wardsiella ictaluri Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 6/6/2013 Ngày thông qua phản biện: 26/6/2013 Ngày duyệt đăng: 8/7/2013 1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No2 Email: sonvm.ria2@mard.gov.vn 96 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 1 - THAÙNG 7/2013