Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 Các phương pháp nghiên cứu protein/ enzyme, cung cấp cho người học những kiến thức như: Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme; Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp; Cải biến protein/ enzyme; Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng. Mời các bạn cùng tham khảo!
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ protein và enzyme: Chương 3 - TS. Nguyễn Xuân Cảnh
- 9/18/2020
Chƣơng 3
CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU PROTEIN/ ENZYME
Mục đích
• Để làm gì?
• Số lượng bao nhiêu?
• Độ tinh sạch như thế nào?
Đối tƣợng
• Thu nhận từ đối tượng nào?
• Đối tượng đó như thế nào?
• Có thỏa mãn được “mục đích” không?
Xây dựng quy trình
• Cần những nhóm phương pháp?
• Các phương pháp có tính khả thi không?
• Nhóm phương pháp phù hợp nhất là gì?
1
- 9/18/2020
Các nội dung chính trong nghiên cứu protein/ enzyme
Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme
• Phá tế bào
• Loại bỏ tạp chất
• Phân tách protein/ enzyme
• Bảo quản protein/ enzyme
Sản xuất protein/ enzyme tái tổ hợp
• Tách dòng
• Biểu hiện và tinh sạch
Cải biến protein/ enzyme
Phân tích cấu trúc, dự đoán chức năng
Tách chiết và tinh sạch protein/ enzyme
Protein ngoại bào Protein nội bào
Loại bỏ tạp chất Phá vỡ tế bào
Tinh sạch
Định tính và định
lượng
Bảo quản
2
- 9/18/2020
Protein ngoại bào (Extracellular proteins)
Những protein được tổng hợp trong tế bào sau đó tiết ra ngoài môi
trường ngoại bào để thực hiện các chức năng sinh học của tế bào và
cơ thể:
• Protein tham gia truyền tín hiệu ngoại bào: hormone, cytokine,
chemokine
• Các enzyme tiêu hóa: trypsin, pepsin
• Protease ngoại bào: Cathesin
• Kháng thể dịch thể
Trypsin (EC3.4.21.4) và Chymotrypsine (EC3.4.21.1)
3
- 9/18/2020
• Trypsin và chymotrypsin là 02 enzyme phổ biến của hệ tiêu hóa, sinh ra từ
tuyến tụy sau đó tiết vào dịch ruột non.
• Trypsin thuộc nhóm serine protease, nó thường cắt các chuỗi peptide tại vị trí
cacboxyl của lysine hoặc arginine (ngoại trừ trường hợp sau amino acid này là
proline).
• Chymotrypsin thường cắt các liên kết peptide tại vị trí cacboxyl của một số
amino acid kị nước có kích thước lớn như tyrosine, triptophan, phenylalanine
Pepsin (EC3.4.23.1)
• Pepsin thuộc nhóm aspartate protease, sinh ra ở trong dạ dày. Cùng với
Trypsin và Chymotrypsin là 03 enzyme thuộc nhóm phân giải protein được tìm
thấy dưới dạng tinh thể trong hệ tiêu hóa.
• Pepsin thường cắt hiệu quả đối với các liên kết peptide tạo ra giữa Amino acid
kị nước và Amino acid thơm như tyrosine, triptophan, phenylalanine.
4
- 9/18/2020
5
- 9/18/2020
• Thu dịch nuôi cấy: Ly tâm loại bỏ tế bào Dịch enzyme
ngoại bào
• Ưu điểm: Nhanh, đơn giản, chi phí thấp
6
- 9/18/2020
Protein nội bào (Intracellular proteins)
Phá vỡ tế bào: Tùy thuộc vào tính chất của mỗi loại tế
bào mà sử dụng phương pháp phù hợp
• Nghiền đồng thể
• Siêu âm
• Dùng áp suất
• Nghiền với cát, hạt thủy tinh
• Vortex mạnh với các hạt thủy tinh
• Xử lý bằng enzyme: lysozyme
• Sử dụng: chất hoạt động bề mặt (SDS)
7
- 9/18/2020
8
- 9/18/2020
9
- 9/18/2020
Các chất hoạt động bề mặt
• Ionic (cation hoặc anion): SDS, LiDS
Protein các subunit (gây biến tính) xác định Mw
• Nonionic: Triton X-100, Tween 20 tách phức hợp
protein (ít gây biến tính) (có khả năng kết tủa).
• Zwiterionic: CHAPS hạn chế protein-protein interaction
ít gây biến tính protein.
Thao tác với protein enzyme
• Ở nhiệt độ thấp 40C
• Giảm thiểu các bước trong quy trình tách chiết, tinh sạch
• Bảo quản trong các đệm chiết phù hợp và có mặt các
chất ức chế protease (PMSF, EDTA)
• Các chất thường dùng trong quá trình bảo quản
(albumin, glycerol, PEG)
10
- 9/18/2020
Đệm tách chiết protein (Protein extraction buffer)
Các thành phần thƣờng gặp trong dung dịch đệm tách chiết protein:
• PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mM): Ức chế protease
• HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, 50 mM , pH
7.5): Là phân tử lưỡng điện hữu cơ, dùng để tạo dung dịch đệm, duy trì pH.
• EDTA (5 mM): Ức chế protease
• EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid, 5 mM): tạo phức với một số ion kim
loại như Ca2+, Mg2+. Thường sử dụng trong biểu hiện và tinh sạch protein.
• Na3VO4 (Sodium orthovanadate, 1 mM): Là chất ức chế tyrosine
phosphatases, alkaline phosphatases and ATPases.
• NaF (25 mM): Là chất ức chế Ser/Thr and acidic phosphatases
• DTT (Dithiothreitol, C4H10O2S2 , 2 mM): Cắt các liên kết disulfide trong phân
tử protein
• Glycerol (5%): Tạo môi trường ổn định cho protein
• Triton X-100 (1%): Liên kết các cấu trúc màng
• Chất ức chế protease khác
Các chất ức chế protease (Protease inhibitors)
Là các phân tử có khả năng úc chế hoạt động chức năng của protease,
trong tự nhiên các chất ức chế này thường là các phân tử protein.
Phân loại protease: theo loại protein mà nó ức chế hoặc theo cơ chế tác
động.
Protease Inhibitor Cocktails: Là hỗn hợp các chất ức chế đã được thương
mại hóa, mỗi sản phẩm sẽ ức chế một nhóm protease khác nhau.
Các chất tạo phức (chelating bond):
Serpin (serine protease inhibitor) Ethylenediamine
11
- 9/18/2020
Giới thiệu một số chất ức chế
• Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF): Ức chế một số serine protease
bằng cách tạo phức không thuận nghịch với các enzym này. Chất này khi tan
trong nước sẽ nhanh chóng bị phân giải, khi sử dụng nên hòa tan trong các
dung môi như ethanol, isopropanol, DMSO…
• Ethylenediaminetetraacetate (EDTA): Ức chế metalloprotease thông qua việc
tạo phức với một số ion kim loại như Ca2+, Fe3+
• Pepstatin A: ức chế aspatyl protease như pepsin, renin, cathepsin D,
chymosin. Chất này không tan trong nước, chloroform, benzen nhưng tan trong
methanol, ethanol hoặc DMSO khi có mặt acetic acid.
• Leupeptin (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal): Là chất ức chế được tìm
thấy trong tự nhiên ức chế cysteine, serine vàthreonine protease (papain,
plasmin)
• Aprotinin: Ức chế một số serine protease đặc biệt là plasmin, trypsin,
chymotrypsin.
Cô đặc dung dịch protein
• Tủa
• Bay hơi ở áp suất thấp
• Ly tâm dùng màng bán thấm
• Thẩm tích
12
- 9/18/2020
Tủa
• Muối trung hòa: (NH4)2SO4 thẩm tích
loại muối
• Dung môi hữu cơ (aceton, ethanol 80%):
Nhanh biến tính
• pHi: khó xác định chính xác pH
Bay hơi ở áp suất thấp
• Speed Vac (Vacumm)
13
- 9/18/2020
Ly tâm dùng màng bán thấm
Thẩm tích (dialysis)
14
- 9/18/2020
Bảo quản protein/ enzyme
• Phụ thuộc vào mục đích sử dụng
• Thời gian ngắn (giữ hoạt tính enzyme, khả năng
biến tính thấp): 1-7 ngày ở 40C
• Thời gian dài (> 7 ngày): giữ ở 40C dưới dạng
tủa với (NH4)2SO4 hoặc -800C.
• Đông khô
• Bảo quản trong glycerol, albumin, PEG
Các chất cho bảo quản
Albumin:
Bổ sung trong các dung dịch đệm, tăng độ bền và ổn định cấu trúc protein/
enzyme Pha loãng các dung dịch protein, enzyme
Glycerol:
• Chống đóng băng (dùng trong bảo quản protein enzyme lâu dài)
• Tương tự Ethylene glycol, propylene glycol khi tan trong nước phá vỡ
các liên kết H giữa các phân tử H2O không thể hình thành cấu trúc kết
tinh.
• 60-70% glycerol đóng băng ở -37.80C
• Thường sử dụng làm dung môi cho các enzyme
15
- 9/18/2020
Dung dịch đệm
• Là hỗn hợp axit yếu và base liên hợp của
nó
• pH của dung dịch chỉ thay đổi không đáng
kể khi cho một lượng nhỏ axít hoặc kiềm
vào.
• Ít tương tác đến các phản ứng enzyme
• Làm bền enzyme
pKa
• Hằng số phân ly acid (Ka)
HA A− + H+
• Giá trị pKa càng lớn khả năng phân ly càng thấp
• Dung dịch đệm tốt khi pH ~ pKa Đệm axit, đệm kiềm
16
- 9/18/2020
Chọn dung dịch đệm nhƣ thế nào ?
• Giá trị pH ~ pKa
• Mức thay đổi pH phụ thuộc vào độ pha loãng
• Lưu ý ảnh hưởng của nhiệt độ
• Khả năng hòa tan (protein enzyme quan tâm)
• Khả năng tương tác với các thành phần khác có trong dung dịch,
phản ứng enzyme
• Khả năng hấp thụ UV (đo quang phổ)
• Mức độ thấm qua màng sinh học (tương tác hay không tương tác
với tế bào)
• Chi phí
Lƣu ý khi chọn dung dịch đệm
• Nồng độ: 50 mM thử đầu tiên
• pH: tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm
• Loại đệm: cationic hoặc anionic buffer (sắc ký trao đổi ion). Tris
cationic trao đổi anion. PBS anionic trao đổi cation.
• Khi làm việc ở pH sinh lý (với tế bào, mô) MES, PIPES, MOPS
(Good’s buffer).
17
- 9/18/2020
Đệm phosphate
• Phạm vi pH 8-11
• Tủa hoặc gắn với nhiều cation đa trị
• Ức chế 1 số enzyme (kinase, phosphatase,
dehydrogenase)
• pH thay đổi khi pha loãng
• Dễ bị nhiễm khuẩn
Đệm Tris
• Khả năng đệm kém khi pH < 7,0
• Chứa nhiều nhóm NH2 có khả năng phản ứng
• Ảnh hưởng đến nhiều phản ứng enzyme (xúc tác bởi
alkaline phosphatase (dephosphoril hóa)
• Thấm qua màng sinh học (tương tác)
• pH chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ pha loãng
18
- 9/18/2020
Đệm Acetate
• Phạm vi pH đệm hẹp (4-6)
• Không sử dụng được với các hệ thống tế
bào
Đệm Citrate
• Có khả năng gắn tạo phức với một số
protein (phức kim loại).
• Ít sử dụng với các hệ thống tế bào
19
- 9/18/2020
Đệm MOPS
• Không gây ảnh hưởng đến sinh lý tế bào
• Ảnh hưởng đến phản ứng Lowry (Bradford
không bị ảnh hưởng).
• Đắt
Đệm HEPES
• Không gây ảnh hưởng đến sinh lý tế bào
• Ảnh hưởng đến phản ứng Lowry
• Tạo ra các gốc tự do ảnh hưởng đến
các phản ứng oxy hóa khử
20
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
