Bài giảng Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:46

Thêm vào BST

Báo xấu

383
lượt xem 59
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh tiến hành giải mã bộ gen người; giải trình tự DNA; khuếch đại bắt cầu và giải trình tự bằng sinh tổng hợp; qui trình chuẩn đoán gen IX factor gây bệnh hemophilia B;... Mời các bạn tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh TH.S NGUYỄN THÁI QUỲNH ANH 04/2014
Giải mã bộ gen người 2 2001: Giải mã bộ gen người 2.7G$, 11năm 10 2007: 454 1M$, 3 tháng Log10(price) 8 2001: Celera 2008: ABI SOLiD 6 100M$, 3 năm 60K$, 2 tuần 2010: 5K$, 4 vài ngày? 2009: Illumina, Helicos 2 40-50K$ 2012: 100$,
Giải trình tự DNA  Mục đích:  Xác định thứ tự của các nucleotide (A,C,G và T) trên mạch DNA của bộ gen  Ứng dụng trong công nghệ sinh học: nghiên cứu, khám phá, chuẩn đoán và điều tra  Vấn đề  Phương pháp giải trình tự DNA hiện tại chỉ hữu hiệu trên mạch DNA (1-2 Kbp)  Giải pháp o Giải trình tự và lắp ráp những đoạn nhỏ bằng máy tính
1977 Sanger Sequencing 2005 454 Sequencing Illumina sequencing 2006 2007 ABI solid Sequencing
Chiến lược chung 5 TG..GT TC..CC AC..GC CG..CA TT..TC TG..AC AC..GC GA..GC CT..TG GT..GC AC..GC AC..GC AA..GC AT..AT TT..CC Genome Những đoạn DNA ngắn Trình tự DNA ngắn ACGTGGTAA CGTATACAC TAGGCCATA ACGTGACCGGTACTGGTAACGTACA CCTACGTGACCGGTACTGGTAACGT GTAATGGCG CACCCTTAG ACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAA CGTATACACGTGACCGGTACTGGTA TGGCGTATA CATA… ACGTACACCTACGTGACCGGTACTG GTAACGTACGCCTACGTGACCGGTA CTGGTAACGTATACCTCT... ACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATA Trình tự genome 5
Phương pháp của Sanger (1977)  Ưu điểm  Đọc đoạn dài (~900bps)  Các nghiên cứu nhỏ  Khuyết điểm  Công nghệ  Đắt
Sanger NGS Các mảnh DNA Các mảnh DNA Tạo dòng in vivo và nhân bản Nối với các adaptor in vitro Giải trình tự chu kì Hình thành polony array Giải trình tự cyclic array Điện di >106 đầu đọc/array) 1 đầu đọc/ống mao dẫn
454 sequensing/Roche Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Emulsion PCR Pyrosequencing
Emulsion PCR
4. Biến tính: mạch ngược “gốc” biến tính từ hạt bead; mạch xuôi được nối với bead bởi khung 1. Biến tính mảnh DNA phosphate đường DNA 5. Bám dính: mạch ngược 2. Bám dính: MỘT bám lên bead, primer bám mảnh DNA (ngược) với lên mạch xuôi adaptor trên bead 6. Kéo dài: polymerase khuếch đại mạch xuôi 3. Kéo dài: từ hạt bead đến primersite; và mạch ngược từ Polymerase khếch đại primer đến bead mạch xuôi từ bead đến vị trí primer 7. Lặp lại 4-5-6 (30 -60 chu kì)
Pyrosequencing  Cơ sở:  Ánh sáng được phát ra tỉ lệ với số lượng nucleotide kếp hợp 1pmol DNA = 6*1011 ATP = 6*109 photons at 560nm pyrophospate Từ đom đóm, oxi hóa luciferin và tạo ra ánh sáng
Ưu điểm Khuyết điểm  Chiều dài đọc 400 base  Khó phân tích các (độ chính xác 99% tại homopolymer base thứ 400 và cao hơn ở các base phía trước)  Chi phí cao => hạn chế  Công nghệ cao so với re-sequencing so với Sanger sequencing SOLID sequencing  Không cần lặp lại cloning  Thư viện DNA có thể được mã hóa và tách riêng trong suốt quá trình phâ tích kết quả.
Ilumina sequencing Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Khuếch đại bắt cầu Giải trình tự đầu ngược (reversible termination)
Khuếch đại bắt cầu và giải trình tự bằng sinh tổng hợp Khuếch đại bắt cầu Terminal transferase x 35 chu kì bổ sung ddNTP blocker Kéo dài bởi Phusion Cắt periodate của Giải trình tự bằng DNA Polymerase một của những oligo sinh tổng hợp
Polony PCR