Bài giảng Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng – ThS. Lê Thị Hạnh

Chia sẻ: Anh Bình | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

"Bài giảng Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng – ThS. Lê Thị Hạnh" với các nội dung bao gồm giới thiệu kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng, các bước tạo kháng thể đơn dòng, ứng dụng kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng. Mời các bạn cùng tham khảo bài giảng để nắm chi tiết hơn nội dung kiến thức.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng – ThS. Lê Thị Hạnh

Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG.TP.HCM Viện Tế Bào Gốc KĨ THUẬT SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG Ths. Lê Thị Hạnh hanhle@sci.edu.vn 11/2018
Nội dung u Giới thiệu u Các bước tạo kháng thể đơn dòng u Ứng dụng hanhle@sci.edu.vn
Kháng nguyên-kháng thể u Kháng nguyên (antigen – Ag): một chất phản ứng với các sản phẩm của một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Bản chất là protein (glycoprotein/lipoprotein), polysaccharid/lipopolysaccharid, acid nucleic hoặc lipid Kháng nguyên không phụ thuộc T (polysaccharid) và Kháng nguyên phụ thuộc T (protein) u Kháng thể (antibody - Ab): là một protein được hệ miễn dịch sử dụng để nhận diện và trung hoà những tác nhân xâm nhiễm ngoại lại Mỗi kháng thể chỉ nhận diện duy nhất một kháng nguyên mục tiêu của nó Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody – mab): là kháng thể được xác định bởi một loại tế bào miễn dịch, bắt nguồn từ một dòng tế bào duy nhất Kháng thể đa dòng bắt nguồn từ nhiều dòng tế bào khác nhau hanhle@sci.edu.vn
Đáp ứng miễn dịch dịch thể hanhle@sci.edu.vn
n ai Kháng thể đơn dòng b Do m Fa (monoclonal antibody) u Là kháng thể kháng môt kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào Fc Domain B trong điều kiện in vitro u Là kháng thể chỉ nhận diện 1 vị trí epitope duy nhất trên kháng nguyên hanhle@sci.edu.vn
Kháng thể đơn dòng – đa dòng Kháng thể đa dòng - Kháng thể đơn dòng - Polyclonal antibodies Monoclonal antibodies Ø Dễ sản xuất Ø Đòi hỏi kĩ thuật cao Ø Tương tác kháng nguyên – Ø Tương tác kháng kháng thể không chuyên nguyên – kháng thể biệt chuyên biệt Ø Giới hạn số lượng (động Ø Không giới hạn số lượng vất) (sx trên tế bào) hanhle@sci.edu.vn Ø Tiết kiệm thời gian Ø Cần nhiều thời gian
Nobel y học 1984 Niels K. Jerne, George Kohler, César Milstein Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies Georges J.F. Köhler, César Milstein (1975) Niels K. Jerne and his theories Theory 1: Specificity is predetermined Theory 2: Reactivity against self-antigens creates diversity hanhle@sci.edu.vn Theory 3. Antibodies, anti-anti-bodies
Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng hanhle@sci.edu.vn
Các bước tạo kháng thể đơn dòng 1. Chọn động vật gây nghiễm, chọn kháng nguyên 2. Gây đáp ứng miễn dịch 3. Thu nhận tế bào miễn dịch và dung hợp với tế bào myelom, tạo tế bào lai hybridoma 4. Sàng lọc, dòng hóa hybridoma 5. Thu nhận, tinh chế và kiểm tra kháng thể đơn dòng hanhle@sci.edu.vn
Kháng nguyên (antigen) u Được nhận diện bởi một kháng thể mục tiêu u Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh u Có cấu trúc càng giống với kháng nguyên tự nhiên càng tốt (Hiện nay kháng nguyên thường được tạo ra bằng kĩ thuật protein tái tổ hợp) u Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay một phân tử protein nào đó hanhle@sci.edu.vn
Chọn kháng nguyên u Quyết định sự thành công của quy trình u Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành u Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (Mab gắn đặc hiệu với KN tiêm vào) hanhle@sci.edu.vn
Chọn động vật gây nhiễm u Động vật thường được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch là chuột nhắt (Mouse), chuột lớn (Rat, Hamster), thỏ… u Chuột nhắt là mô hình lý tưởng do: • Đáp ứng miễn dịch mạnh • Thời gian ngắn tạo ra kháng thể u 2 dòng chuột trong công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (Mab) là BALB/c và C57BL/6 • Lai cùng dòng • 6-8 tuần tuổi Chuột • hanhle@sci.edu.vn cái • “sạch tuyệt đối” BALB/c C57BL/6
Các vị trí tiêm Ag Intraperineal (i.p.) tiêm khoang bụng Intramuscular (i.m.) tiêm vào cơ Intradermal (i.d.) tiêm vào da Subcutaneous (s.c.) tiêm dưới da hanhle@sci.edu.vn Intravenous (i.v.) tiêm tĩnh mạch
hanhle@sci.edu.vn
Gây đáp ứng miễn dịch u Phải gây đáp ứng miễn dịch khác loài (VD: động vật gây nhiễm là mouse thì kháng nguyên có nguồn gốc từ rat/hamster) u Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây đáp ứng miễn dịch (VD: tế bào lách từ mouse thì dòng myeloma là SP2/0 hoặc X63/Ag.8654, nếu là rat thì chọn dòng Y3.Ag1.2.3 u Có chất bổ trợ (tá dược - adjuvant) • CFA (Complete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobacteium • IFA (incomplete Freud’s Adjuvant) gồm nước, nhũ tương dầu • ALUM (aluminum hydroxide gel) hanhle@sci.edu.vn
Liều lượng sử dụng Kháng nguyên là protein Kháng nguyên là tế bào Ø Tiêm 10-100 µg/chuột/lần Tiêm 5x10^6 - 5x10^7 tế bào Ø Tá dược thường được dùng là /chuột/lần CFA Tá dược thường được dùng là ALUM hanhle@sci.edu.vn
Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở chuột nhắt Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c 14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c 28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c 36 Thu serum 42 Nghỉ hoặc Tiêm nhắc lại lần 3 IFA s.c 52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v 55 Thu tế bào lách sau khi xác định hiệu giá Ig trong huyết thanh hanhle@sci.edu.vn
Quy trình gây đáp ứng miễn dịch ở rat Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p 21 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA i.p 42 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA i.p 52 Thu serum kiểm tra 63 Tiêm nhắc lại lần 3 IFA i.p 73 Thu serum kiểm tra 84 Tiêm nhắc lại lần 4 IFA i.p 94 Thu serum kiểm tra 98 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v 101- Thu tế bào lách 110 hanhle@sci.edu.vn
Xác định hiệu giá kháng thể hanhle@sci.edu.vn
Dung hợp tạo tế bào lai hanhle@sci.edu.vn