Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab)

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:53

Thêm vào BST

Báo xấu

223
lượt xem 25
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kháng thể đơn dòng là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro. Và để hiểu rõ hơn về lĩnh vực này, mời các bạn tham khảo bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab) sau.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab)

SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG (Monoclonal antibodies-Mab)
Định nghĩa Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)
: George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984
Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng Tương tác KN-KT Tương tác KN-KT không chuyên biệt chuyên biệt Dễ sản xuất Đòi hỏi kỹ thuật cao Giới hạn về số lượng Không giới hạn về số lượng
Kháng thể đơn dòng 1 4 epitope 2 3 Huyết thanh Kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng
8 bước tạo MAb • Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag • Gây đáp ứng miễn dịch • Thu TB lách và TB myeloma • Dung hợp TB lách với TB myeloma • Sàng lọc, dòng hóa hybridoma • Nhân sinh khối MAb bằng phương pháp in vitro hay in vivo • Tinh chế MAb • Thu nhận, kiểm tra MAb
(1a) Chọn động vật gây nhiễm • Động vật thường được sử dụng để tạo hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ… • Mouse là mô hình lý tưởng nhất: đáp ứng miễn dịch mạnh tổng hợp kháng thể nhanh • 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản xuất MAb: BALB/c và C57BL/6
BALB/c C57BL/6 Lai taïo 1967 taïi Ñöùc Lai taïo 1982 taïi Myõ • Lai cùng dòng • Chuột cái • 6-8 tuần tuổi • “sạch tuyệt đối”
Rat Hamster
Hệ thống chuồng chuột sạch
(1b) Chọn Ag • Quyết định sự thành công của quy trình • Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành • Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (MAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)
Antigen • Được nhận diện bởi MAb mục tiêu • Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh • Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật protein tái tổ hợp. • Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó
Các vị trí tiêm Ag Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch) Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da) Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da) Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ) Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)
(2) Gây đáp ứng MD Nguyên tắc 1 Phải gây ĐƯMD khác loài Sử dụng động vật gây nhiễm là mouse thì phải dùng kháng nguyên có nguồn gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng miễn dịch
(2) Gây đáp ứng MD Nguyên tắc 2 Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách - Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay X63/Ag.8653 - Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3
(2) Gây đáp ứng MD Nguyên tắc 3 Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm • CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum • IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương dầu • ALUM (Aluminum hydroxide gel)
Với kháng nguyên là protein Tiêm 10-100g/1 chuột/1 lần Tá dược thường được sử dụng là CFA Với kháng nguyên là tế bào Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần Tá dược thường được sử dụng là ALUM
Quy trình gây ĐƯMD ở mouse Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA s.c. 14 Tiêm nhắc lại lần 1 IFA s.c. 28 Tiêm nhắc lại lần 2 IFA s.c. 36 Thu serum 42 Nghỉ trước khi dung hợp IFA s.c. (hay tiêm nhắc lần 3) 52 Tiêm nhắc lại lần cuối i.v. 55 Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh
Quy trình gây ĐƯMD ở rat Ngaøy THAO TAÙC Chất bổ trợ Vò trí tieâm 0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p. 21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p. 42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p. 52 Kiểm tra serum 53 ELISA 63 Tiêm nhắc lần 3 IFA i.p. 73 Kiểm tra serum 74 ELISA 84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p. 94 Kiểm tra serum 95 ELISA 98 Tiêm nhắc lần cuối i.v. 101-110 Thu lách
Xác định hiệu giá kháng thể (1) Pha loãng huyết thanh theo từng bậc Huyết thanh Undiluted Chứng âm serum ban đầu 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative control (2) Bổ sung một lượng nhất định KN vào mỗi tube Huyết thanh Undiluted ban đầu 1/2 1/4 Chứng âm 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative (3) Ủ - xác định độ pha serum control loãng cao nhất vẫn cho phản ứng (trong trường hợp này là 1/16)