YOMEDIA
Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng
Chia sẻ: _ _
| Ngày:
| Loại File: PPT
| Số trang:29
26
lượt xem
3
download
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis do TS. Đinh Thị Thu Hằng biên soạn trình bày các nội dung chính sau: B. pseudomallei gây bệnh, hệ gen B. pseudomallei, kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP, thiết kế và đánh giá phản ứng TTSS1-real-time LAMP xác định vi khuẩn B. pseudomallei gây bệnh melioidosis. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng
- HỌC VIỆN QUÂN Y
HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020
Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated
isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn
Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis
TS. Đinh Thị Thu Hằng
Hà Nội, T12 - 2020 1
- ĐẶT VẤN ĐỀ
Burkholderia pseudomallei và melioidosis
- Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe,
tử vong 40%.
- Phân bố: bùn đất, nước các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
- A. Whitmore (1911)
- Melioidosis: cấp và mạn tính - triệu chứng không đặc hiệu, dễ
nhầm lẫn chẩn đoán, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”).
“Bom hẹn giờ Việt Nam”
Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44.
Chen, Y. L., et al. (2014). PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877. 2
- Áp-xe do melioidosis
White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 3
- Phân bố Melioidosis trên toàn cầu
- Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B. J. 2015))
- Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/
AIDS và lao)
- 1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D. et al. 2010, 2012).
- NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia (
Limmathurotsakul D. et al. 2016), (Gohler A. et al. 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm.
Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. 4
Rotz, L. D., et al. (2002). Emerg Infect Dis 8(2): 225-230.
- B. pseudomallei gây bệnh
Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit)
Đường lây:
• Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe
phủ tạng, NKH. Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều
với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD.
• Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ.
5
(Perumal Samy R. et al. 2017)
- Phòng và điều trị
- Chưa có vắc xin, phòng không đặc hiệu
- Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc
• Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn công, 3-
6T duy trì (thể nặng 12T).
• Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các
ápxe phổi.
• Dễ tái phát, thời gian, kinh phí
=> Quân số, sức chiến đấu
6
- B. pseudomallei và vũ khí sinh học
• B. pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác
nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí
sinh học (VKSH).
• Hệ gen B. pseudomallei giống đến 99% so với B. mallei -
được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga
• Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B. pseudomallei để chế tạo
VKSH.
7
- Hệ gen B. pseudomallei
Gene TTSS1
AF074878
NST số 1: 3.460 CDS NST số 2: 2.395 CDS
Trao đổi chất, tăng trưởng Thích ứng, tồn tại
Holden et al. (2004),10.1073/pnas.0403302101. 8
- Các phương pháp xác định
Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày
Huyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu
không cao
PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực
- chưa đáp ứng thực tế hiện trường
9
- Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP
(Loop mediated isothermal Amplification)
- Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm
là DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu quả cao (Notomi T. et al. 2000
).
- Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có
thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc.
10
- Ưu điểm của LAMP
• Tiết kiệm
• Độ nhạy, đặc hiệu cao
• Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân
• Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ
• Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ không đổi từ 60 - 65°C.
• Không đòi hỏi DNA tinh sạch cao.
=> Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, user-
friendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to
end users) - thực địa.
- real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản
hóa quá trình phát hiện B. pseudomallei
11
(Kaneko H. et al. 2007, (Njiru Z. K. 2012)
- Thế giới
• Hơn 100 XN LAMP chẩn đoán mầm bệnh ở người và động
vật: virus Dengue (Parida M. et al. 2005), vi khuẩn lao (
Geojith G. et al. 2011), S. aureus (Lim K. T. et al. 2013), KST
sốt rét (Wu L. et al. 2015)... (Eiken Chemical Co. Ltd).
• B. pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá
ở Đông Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm
sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N. et al. 2008).
• Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi
tiết (Michelle Wong Tzeling J. et al. 2016).
12
- B. pseudomallei ở Việt Nam?
• Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ
tham chiến tại Việt Nam (Schulin T. et al. 2001)+ một số chó
nghiệp vụ. ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B.
pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R. et al. 2017).
• 6 BN nhiễm B. pseudomallei ngoại thành Hà Nội (1993).
• 73 (+)/ 147 cánh đồng lúa miền Nam (1999).
• Báo cáo các ca lâm sàng: BV Chợ Rẫy 2009-2011, 80 ca/ năm;
BV TƯ Quân đội 108 (2015), BV Bạch Mai (2016),…;
• TT Trung&cs(2016) NC đặc điểm phân bố B. pseudomallei ở
Bắc Trung Bộ, real-time PCR: 77 chủng/ 70 BN.
• Mưa lũ lịch sử, đến hết tháng 11/2020, ghi nhận số ca tăng đột
biến, 5 ca tử vong.
Quyết định 6101/QĐ-BYT 30/12/2019 HD chẩn đoán & điều trị bệnh Whitmore
BV quân đội + địa bàn đóng quân, lân cận?
Công cụ phát hiện tại thực địa? 13
- Đề tài cấp BQP: “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán
nhanh tại hiện trường VK B. pseudomallei”. Mã số: 2019.75.027. 14
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Mẫu chủng PCR, Giải trình
B. p cloning tự Primer 3
PrimerExplorer V.5
B. pseudomallei, B. cepacia,
Thiết kế
P. aeruginosa mồi gen GenBank
TTSS1
PCR, real-time PCR
Thiết lập real-time LAMP
LAMP
• Độ nhạy, độ
PP: Thực nghiệm mô tả, Đánh giá đặc hiệu
phân tích trong PTN. • So sánh
15
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Gene TTSS1
AF074878
PCR: primer BpF/R, sản phẩm: 723 bp
BpF qBpF qBpR BpR
Real-time PCR: primer qBpF/R, probe qBp-Pr, sp: 105 bp
LAMP và Real-time LAMP: các set primer LAMP gồm 2-3 cặp
FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system)
TTSS1
16
- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1
723 bp
PCR TTSS1-orf11 trên gel agarose 1,2%
M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm;
2- 6: Mẫu B. pseudomallei Bp1-Bp5
17
- Thiết kế phản ứng TTSS1 real-time PCR
Phản ứng real-time 20 µl PCR tối ưu : QuantiTect probe PCR 1X; qBp (F1+R1)
0,2 µM; probe qBp 0,05 µM; mồi IC (F+R) 0,2 µM; probe IC 0,05 µM; 5 µl DNA.
Chu trình: (50oC/ 2 phút) (95oC/ 15m) (94oC/ 15s; 60oC/ 60s; 70oC/ 30s)x 45 chu kỳ.
Real-time PCR
LOD95%=14,6 copy/rxn,
độ tin cậy 95%.
PCR LOD: 500
copy/rxn
18
- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế các bộ mồi LAMP
TT Trình tự (5’-3’) Kích Nguồn
ên mồi o
gắn mồi (Ta: thước (bp)
o
C)
ộ mồi 1
1 215 Chantratita
3 CCTGCTCCCACACCG 8,01 N. và cs,
2 2008 [13]
3 CGCTTGCGCGTCAT 7,88
3 CCACAGCAACGGAAAGAGCAGA-
IP GCTTGCGGCCGAGATC
4 GCCTCGATTGCGCGATCGCC-
IP TGTTGCTAGCGGATTGTCA
Bộ mồi 2, bộ mồi 3
1 Bp-F3 CAATCTCACCAGCGTTCCA 60,01 242
2 Tự thiết
CCGGCCTCAATTCATC
p-B3 9,48 kế
3 GCGCAGATGCCTGTCGATCA-
p-FIP CCGCCAACCTTTCCACA
GCGCAGATTGCCTGTCGATCA-
p-FIP-4T TTTTCCGCAACCTTCCAACA
4 CGGCACAACCTGACAATCGC- 19
p-BIP TTCCGCGAACCTGGACT
- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế phản ứng LAMP
Quan sát bằng mắt thường
Điện di
UV
1 2 3
20
Thêm tài liệu vào bộ sưu tập có sẵn:
Báo xấu
LAVA
ERROR:connection to 10.20.1.100:9315 failed (errno=111, msg=Connection refused)
ERROR:connection to 10.20.1.100:9315 failed (errno=111, msg=Connection refused)
Đang xử lý...
Thêm vào BST
Báo xấu
