Bài giảng Thực hành Vi sinh - Trường ĐH Võ Trường Toản (Năm 2021)

Chia sẻ: Lôi Vô Kiệt | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực hành Vi sinh kết cấu gồm 7 đơn vị bài học, cung cấp cho sinh viên những nội dung cơ bản về: một số dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh, phương pháp khảo sát vi sinh vật, kỹ thuật soi tươi; phương pháp nhuộm Gram; phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng cồn kháng acid (phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen); phản ứng huyết thanh học trong chẩn đoán kháng nguyên, kháng thể; một số nguyên tắc vô khuẩn trong thực hành vi sinh, chuẩn bị môi trường nuôi cấy;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực hành Vi sinh - Trường ĐH Võ Trường Toản (Năm 2021)

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN KHOA Y  BÀI GIẢNG MÔN HỌC THỰC HÀNH VI SINH Giảng viên biên soạn: NGUYỄN THỊ THANH TUYỀN Đơn vị: TT TH Y DƯỢC Hậu Giang – Năm 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÀI GIẢNG MÔN HỌC TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC VOÕ TRÖÔØNG TOAÛN Tên môn học: Thực hành Vi sinh (Tên tiếng Anh: ……………………………….) Trình độ: Đại học Số đơn vị học trình: Giờ lý thuyết: Giờ thực hành: Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: Nguyễn Thị Thanh Tuyền  Đơn vị:  Điện thoại:  E-mail: ntttuyen@vttu.edu.vn 1. Đề cương môn học Tên bài học Số tiết Phần thực hành LT TH Một số dụng cụ cở bản trong phòng thí nghiệm vi sinh. 4 1 Phương pháp khảo sát vi sinh vật. Kỹ thuật soi tươi. 2 Phương pháp nhuộm Gram. 4 Phương pháp nhuộm vi khuẩn kháng cồn kháng acid 4 3 ( Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen) Phản ứng huyết thanh học trong chẩn đoán Kháng nguyên, 4 4 Kháng thể. Một số nguyên tắc vô khuẩn trong thực hành vi sinh. 4 5 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy. 6 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn. 4 7 Kỹ thuật kháng sinh đồ. 4 Tổng 2. Nội dung bài giảng chi tiết
Bài 1. MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT. KỸ THUẬT SOI TƯƠI MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Biết cách sử dụng một số dụng cụ thường gặp trong phòng thí nghiệm vi sinh: kim cấy, vòng cấy, đèn cồn, ống nghiệm, hộp petri. 2. Biết được cấu tạo, cách sử dụng kính hiển vi quang học và cách bảo quản kính sau khi sử dụng. 3. Thực hiện và quan sát, mô tả kết quả mẫu soi tươi. Làm quen với tiêu bản nhuộm soi. I. ĐÈN BUNSEN (HAY ĐÈN CỒN): Ngọn lửa đèn Bunsen (hay đèn cồn) có 2 phần: - Phần giữa: ít nóng, nhiệt độ khoảng 4000C. Nhiệt độ tăng dần cho đến phần ngoài. - Phần ngoài: nhiệt độ khoảng 17000C. II. KIM CẤY VÀ VÒNG CẤY: Kim cấy và vòng cấy làm bằng sợi dây kim khí chóng nóng và chóng nguội (Platin hay Chrome). Phải nhớ đốt kim cấy và vòng cấy trước và sau khi cấy vi trùng. Phải để kim đứng thẳng trên ngọn lửa đèn cồn để cho đầu kim ở vào phần nguội cảu đèn, rồi mới kéo dần ra phần nóng của ngọn lửa, phải đốt cho cả kim cấy và vòng cấy nóng đỏ. Như thế các vi khuẩn sẽ không bị bắn ra xung quanh và sẽ bị đố cháy hết. III. ỐNG NGHIỆM: Phải hơ nóng miệng ống nghiệm sau khi mở và trước khi đậy nút. Nút phải cặp ở ngón tay út vào lòng bàn tay, tránh đụng vào bất cứ vật gì. Khi mở nút ống nghiệm luôn luôn phải nghiêng ống nghiệm một góc 450 để tránh nhiễm khuẩn bên ngoài vào môi trường. Việc lấy vi khuẩn từ các môi trường phải luôn luôn thực hiện ở gần ngọn đèn cồn. IV. HỘP PETRI: Các môi trường cấy đựng trong hộp petri. Khi cấy chỉ hé mở, không được mở hết cả hộp để tránh lây nhiễm. V. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC: 1. Cấu tạo kính hiển vi quang học: Hệ thống giá đỡ: - Bệ kính: tiếp xúc với mặt bàn. - Ống kính: trụ tròn rỗng lắp vào trụ kính hiển vi. - Thân kính: giữa bệ kính và ống kính. - Khai quay: lắp ở đầu dưới ống kính, có lỗ đề lắp vật kính. - Bàn kẹp tiêu bản. Hệ thống phóng đại: - Thị kính: loại 1 ống, loại 2 ống, bản chất là thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn. Phần lớn kính hiển vi quang học dùng trong phòng thực tập vi sinh có thị kính có độ phóng đại 10X. - Vật kính: là bộ phận quang học chủ yếu, gồm có nhiều thấu kính ghép lại, lắp ở khai quay. Vật kính có những bội số phóng đại khác nhau và có ghi rõ bội số (4X, 10X, 40X, 100X). Khi dùng vật kính phóng đại bội số thấp để xem một vật gì thì không cần phải cho dầu vào tiêu bản, nên người ta gọi vật kính đó là vật kính khô. Khi dùng vật kính có bội số cao thì cho một giọt dầu lên tiêu bản và vật kính đó gọi là vật kính dầu. Hệ thống chiếu sáng: 1
- Nguồn sáng: bóng đèn hoặc gương phản chiếu, nằm trên bệ kính. Gương phản chiếu gồm một mặt lồi và một mặt lõm có thể lộn đi lộn lại, dùng để lấy ánh sáng. - Tụ quang: là một loại thấu kính lồi lắp ở dưới giá để tiêu bản, có thể đưa lên đưa xuống, dùng để tập trung ánh sáng vào tiêu bản. Hệ thống điều chỉnh: - Ốc đại cấp (ốc lớn) và ốc vi cấp (ốc nhỏ): để điều chỉnh tiêu cự. - Ốc điều chỉnh bàn đặt tiêu bản. - Ốc di chuyển tụ quang. - Ốc đóng mở khe chắn sáng. 2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học: - Nhỏ giọt dầu lên lam (nếu cần). - Đặt lam lên giá để tiêu bản. - Di chuyển lam vào đúng vị trí. - Chỉnh vật kính vào nấc. - Lấy ánh sáng: bật đèn hoặc xoay gương phản chiếu để lấy ánh sáng. - Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp. Để quan sát vi khuẩn trên một mẫu vật đã nhuộm, ta cần có ánh sáng tối đa. Muốn vậy, ta cần: + Nâng tụ quang cực đại. + Mở hết khe chắn sáng. - Xoay ốc đại cấp đến khi tìm thấy vi trường, di chuyển lam để tìm vùng phết bệnh phẩm. - Chuyển sang vật kính dầu, nhẹ nhàng xoay ốc đại cấp cho vật kính gần sát tiêu bản đã được nhỏ dầu. Mắt không nhìn vào thị kính mà nhìn ngang từ bên ngoài vào khoảng cách vật kính và tiêu bản để tránh vật kính làm vỡ lam. - Nhìn vào thị kính, xoay ốc đại cấp cho tới khi thấy được vi trường thì dừng lại. - Chuyển sang xoay ốc vi cấp cho tới khi hình ảnh hoàn toàn rõ nét. 3. Giữ gìn và bảo quản kính: Cuối buổi thực tập phải lau ngay vật kính dầu. - Hạ giá để tiêu bản xuống để tách vật kính ra khỏi tiêu bản. - Lấy tiêu bản ra khỏi giá. - Xoay vật kính tới vị trí dễ lau nhất. - Dùng giấy thấm lau kính hiển vi lau thị kính trước. - Dùng giấy thấm tẩm aceton để lau vật kính sau. Lau nhẹ nhàng theo hình xoắn ốc. - Xoay vật kính 10X vào nấc, hạ giá để tiêu bản xuống tối đa ( vị trí nghỉ). - Lau sạch bụi ở phần giá để tiêu bản và bệ kính. - Cầm kính hiển vi 2 bằng 2 tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ đến kính, cất kính vào đúng vị trí trong phòng thí nghiệm. VI. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT VI SINH VẬT. KỸ THUẬT SOI TƯƠI: Có rất nhiều phương pháp quan sát vi sinh vật. Trong đó, soi tươi là phương pháp đơn giản nhất. Soi tươi giúp quan sát được hình dạng, màu sắc, tính chất di động của vi sinh vật có trong mẫu. Thường chỉ áp dụng cho những nhóm vi sinh vật có kích thước tương đối lớn. Kỹ thuật soi tươi:  Sử dụng vật kính: 4x, 10x.  Hạ tụ quang cực đại.  Đóng khe chắn sáng. Quan sát tiêu bản nhuộm soi: quan sát hình thể, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn:  Sử dụng vật kính dầu 100x. 2
 Nâng tụ quang cực đại.  Mở hết chắn sáng. Bài 2. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Nêu được đặc điểm của tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm Gram. 2. Biết cách làm một phết vi khuẩn để nhuộm Gram và các bước của phương pháp nhuộm Gram. 3. Mô tả một lame nhuộm Gram trên kính hiển vi với vật kính dầu. I. CHUẨN BỊ MỘT PHẾT VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM 1. Chuẩn bị lame: - Tấm lame dùng để làm phết vi khuẩn phải được rửa sạch và lau khô. - Hơ qua ngọn lửa đèn cồn và để nguội. - Tránh chạm các ngón tay vào lame. 2. Cách gắn vi khuẩn vào tấm lame: - Dùng bút chì sáp vẽ một vòng tròn đường kính 2 cm trên lame. - Lấy một vòng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng và trải mỏng trên diện tích vòng tròn đã vẽ. Nếu vi khuẩn từ môi trường đặc (hộp thạch petri), thì ta phải đặt một vòng cấy nước lên lame trước khi đặt vi khuẩn vào. - Để cho lame khô tự nhiên, sau đó gắn chặt vi khuẩn lên lame bằng cách hơ lame trên ngọn lửa đèn cồn. II. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM: Đây là phương pháp nhuộm cơ bản trong vi khuẩn học. Phương pháp nhuộm Gram còn được gọi là phương pháp nhuộm kép vì trong phương pháp nhuộm này ta sử dụng hai loại phẩm nhuộm tương phản nhau về màu sắc. Đó là tím Gentian và hồng Safranin. 1. Nguyên tắc: Phương pháp nhuộm căn cứ vào nguyên tắc: “chất rượu (alcool) sẽ tẩy được màu của hợp chất “tím Gentian – iod” của vi khuẩn Gram âm. Đặc điểm cấu trúc của tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm Gram: Vi khuẩn chia làm 2 nhóm: Gram âm hoặc Gram dương tùy theo sự đáp ứng của vi khuẩn đối với phương pháp nhuộm Gram (tên của nhà phát minh ra phương pháp nhuộm vi khuẩn). Sự khác biệt giữa vi trùng Gram âm và Gram dương tùy thuộc vào sự khác biệt về thành phần hóa học trong sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Trong tế bào vi khuẩn Gram dương có 40 lớp peptidoglycan, chiếm đến 50% vật liệu cấu tạo vách, còn vi khuẩn Gram âm chỉ có 1 hoặc 2 lớp peptidoglycan, chiếm từ 5 – 10% vật liệu cấu tạo của vách. 2. Dụng cụ: - Lamen sạch. - Vòng cấy. - Bộ thuốc nhuộm gồm: + Tím Gentian ( Crystal violet). + Gram’s iodine (dung dịch Lugol). + Cồn 950 (tẩy màu). + Hồng Safranin - Bút chì sáp. - Đèn cồn. 3
- Giấy thấm. 3. Thực hiện: - Làm phết vi khuẩn. - Nhỏ dung dịch tím gentian lên phết vi khuẩn (30 giây). - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa. - Nhỏ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn (1 phút). - Rửa nước. - Nhỏ dung dịch cồn 950 lên phết vi khuẩn (10-15 giây) - Rửa nước để loại bỏ cồn. - Nhỏ dung dịch hồng Safranin lên phết vi khuẩn ( 1 phút). - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa. - Để lam khô tự nhiên. - Nhỏ một giọt dầu Cedre lên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (100X). 4. Đọc kết quả: Mô tả hình dạng, màu sắc, cách sắp xếp của vi khuẩn. Màu sắc: Màu hồng: Gram âm. Màu tím: Gram dương. Bài 3. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG CỒN KHÁNG ACID (Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen) MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Nêu được đặc điểm cấu tạo của tế bào vi khuẩn có liên quan đến phương pháp nhuộm kháng acid. 2. Kể được các dụng cụ cần cho phương pháp nhuộm kháng acid. 3. Thực hiện đượcc các bước của phương pháp nhuộm. 4. Nhận diện được trực khuẩn kháng acid trên kính hiển vi quang học. I. ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO TẾ BÀO CỦA TRỰC KHUẨN KHÁNG ACID CÓ LIÊN QUAN ĐẾN PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID Mycobacteria là những trực khuẩn dài, mảnh, đôi khi phân nhánh hoặc có dạng sợi. Chúng có đặc tính kháng lại sự xâm nhập của các loại phẩm nhuộm vào tế bào do có một lượng lớn chất lipid trong lớp vỏ của tế bào vi khuẩn. Do đó, ta không thể sử dụng các phương pháp nhuộm thông thường như đối với các loại vi khuẩn khác. Nhưng với Carbonfuchsin, nếu nhuộm với thời gian lâu (5-10 phút) hoặc đun nóng thì vi trùng sẽ ăn màu rất chắc và sẽ không thể tẩy màu bằng hỗn hợp acid-alcool. Dựa trên tính chất này, Ziehl – Neelsen đã đưa ra phương pháp nhuộm kháng acid. Các Mycobacteria gây bệnh thường gặp: Mycobacterium tuberculosis: gây bệnh lao ở người. Mycobacterium bovis: gây bệnh lao ở bò. Mycobacterium leprae: gây bệnh phong. II. DỤNG CỤ: - Bệnh phẩm đờm của bệnh nhân. - Lame sạch. - Đèn cồn. - Vòng cấy. - Hóa chất: Carbon fuchsin (Hồng fuchsin) Dung dịch cồn acid (dung dịch tẩy màu) Xanh methylen. - Giấy thấm. 4
- Kính hiển vi quang học. - Dầu Cedre. III. THỰC HIỆN: 1. Gắn vi khuẩn lên lame 2. Nhuộm nóng bằng Carbonfuchsin: - Nhỏ hồng fuchsin lên lame. - Hơ lame trên ngọn lửa đèn cồn cho tới khi thấy bốc hơi( khoảng 10 giây và phải kéo đèn cồn ra ngoài mới thấy bốc hơi lên được). Làm như thế 3 lần cách nhau vài phút. Lưu ý: Khi hơ lame không để chất màu cạn đi, nếu cần thì nhỏ thêm phẩm nhuộm lên lame. - Rửa nước. Sau khi rửa nước, lớp sáp (lipid) trong tế bào vi khuẩn sẽ đông lại và giữ cho vi khuẩn không bị tẩy màu bởi dung dịch cồn-acid. 3. Tẩy màu bằng dung dịch cồn-acid cho tới khi thấy hết màu. 4. Rửa nước. 5. Nhuộm nền: Nhỏ dung dịch Xanh methylen lên lame (khoảng 30 giây đến 1 phút) Ta có thể dùng bất cứ màu nào tương phản với màu đỏ của Carbonfuchsin thay vì xanh methylen. 6. Rửa nước, để lam khô tự nhiên và xem bằng vật kính dầu (100X). IV. QUAN SÁT TRỰC KHUẨN LAO BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VỚI VẬT KÍNH DẦU: Trực khuẩn lao có hình dài, mảnh, màu hồng hoặc đỏ. Còn vi khuẩn thường cũng như các nền khác như tế bào bào biểu mô hoặc bạch cầu đều bắt màu xanh lơ. Đọc kết quả: Chỉ có thể trả lời có hay không có trực khuẩn kháng acid và đếm số vi khuẩn quan sát được. 1-99 AFB/100 vi trường: 1+ 1-10 AFB/1 vi trường: 2+ > 10 AFB/1 vi trường: 3+ ( Thay đổi tùy theo từng cơ quan và theo chương trình quốc gia). ( AFB: Acid Fast Bacilli). Bài 4. PHẢN ỨNG HUYẾT THANH HỌC MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Nắm được nguyên lý, cách tiến hành và biện luận kết quả của phương pháp sắc ký miễn dịch trong chẩn đoán kháng nguyên HBsAg. 2. Nắm được nguyên lý, cách tiến hành và biện luận kết quả của phương pháp ngưng kết hạt latex trong chẩn đoán ASO. 3. Trình bày và thực hiện được phương pháp bán định lượng nồng độ liên cầu khuẩn trong máu. I. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH: 1. Nguyên lý: Bệnh viêm gan do vi rút là căn bệnh chủ yếu liên quan đến gan. Hầu hết các trường hợp cấp tính của bệnh viêm gan do virút là do các virút Viêm gan A, Viêm gan B (HBV) hoặc Viêm gan C gây ra. Phức hợp kháng nguyên (complex antigen) tìm thấy trên bề mặt của HBV gọi là HBsAg. Sự có mặt của HBsAg trong huyết thanh hoặc huyết tương cho thấy dấu hiệu của sự lây nhiễm virút Viêm gan B cấp hoặc mãn tính. 5
Test nhanh chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm nhanh định tính phát hiện sự có mặt của HBsAg trong huyết thanh hoặc huyết tương. NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG: Test nhanh chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) là dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính bằng phương pháp dòng chảy một chiều (hiện tượng mao dẫn) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên vi rút Viêm gan B trong huyết thanh hoặc huyết tương. Màng que thử được phủ một lớp kháng thể kháng HBsAg ở vùng kết quả. Trong quá trình làm xét nghiệm, mẫu huyết thanh hoặc huyết tương phản ứng với các phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg. Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ các mao dẫn, gặp và phản ứng kết tủa màu với các kháng thể kháng HBsAg trên lớp màng và tạo ra vạch màu. Sự có mặt của vạch màu ở vùng kết quả trên que thử cho biết kết quả dương tính, ngược lại trong trường hợp không có vạch màu là kết quả âm tính. Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, một vạch màu luôn luôn xuất hiện tại vùng chứng (gọi là vạch chứng) để khẳng định rằng lượng mẫu đã đủ và lớp màng đã thấm tốt. 2. Dụng cụ: - Quick test HBV. - Máy ly tâm. - Bơm tiêm 5ml. - Gòn vô khuẩn có tẩm cồn. - Dây garro. - Găng tay. - Ống đựng máu. 3. Tiến hành: Quick test chẩn đoán nhanh HbsAg sử dụng mẫu huyết thanh hoặc huyết tương. Bước 1: lấy 3ml máu tĩnh mạch, để đông tự nhiên khoảng 15 – 30 phút. Bước 2: quay ly tâm, tốc độ 4000 vòng trong 5 phút. Bước 3: tách lấy huyết thanh. Bước 4: Nhúng que thử vào huyết thanh tại vị trí nhúng. Đọc kết quả sau 10 phút. 4. Đọc kết quả: - Nếu xuất hiện màu ở cả 2 vạch C và T: dương tính. - Nếu chỉ xuất hiện màu ở cạch C: âm tính. - Nếu chỉ có cạch T hoặc không có vạch nào: không xác định. 6
II. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT HẠT LATEX: 1. Nguyên lý: Liên cầu khuẩn ß tan huyết nhóm A, có tên gọi là Streptococcus pyogenes là nhóm liên cầu gây bệnh quan trọng nhất ở người, đặc biệt là các bệnh hậu nhiễm liên cầu (viêm khớp, viêm cầu thận cấp, viêm màng trong cơ tim). Streptolysin O là một loại kháng nguyên đặc hiệu của liên cầu nhóm A. Khi xác định được nó trong máu với một số lượng vượt quá chỉ số cho phép trên một cơ thể bình thường là thuộc loại bệnh lý. Xét nghiệm máu tìm kháng thể kháng liên cầu nhóm A được gọi là phản ứng ASLO (Anti Streptolysin O) Test ASLO dùng để xác định nhanh, giúp biết được trong máu bệnh nhân có kháng thể kháng liên cầu nhóm A hay không (Phương pháp định tính). Nguyên lý của phản ứng dựa vào sự ngưng kết của kháng nguyên Streptolysin O với kháng thể Anti Streptolysin O. Các kháng thể có trong huyết thanh sẽ tạo kết tủa với kháng nguyên được gắn trên các hạt latex của bộ thuốc thử. 2. Dụng cụ: - Bộ thuốc thử ASO. - Máy ly tâm. - Bơm tiêm 5ml. - Dây garro. - Ống đựng máu. - Gòn vô khuẩn có tẩm cồn. - Găng tay. - Que khuấy. - Phiến nhựa nền đen. - Micropipet. - NaCl 0,9%. 3. Tiến hành: Bước 1: Lấy 3ml máu tĩnh mạch, để đông tự nhiên khoảng 15 – 30 phút. Bước 2: Quay ly tâm với tốc độ 4000 vòng trong 5 phút. Bước 3: Tách lấy huyết thanh. Bước 4: Cho 50µL latex ASO vào 3 giếng theo thứ tự đánh số sau: - Giếng 1: Mẫu - Giếng 2: Chứng (+) - Giếng 3: Chứng (-) Bước 5: Lần lượt cho 50µL mẫu huyết thanh vào giếng 1, 50µL chứng (+) vào giếng 2 và 50µL chứng (-) vào giếng 3. Bước 6: Dùng que khuấy đều 3 giếng. Bước 7: Dùng máy lắc hoặc lắc tay trong 2 – 3 phút và đọc kết quả. 4. Đọc kết quả: Giếng 2: chứng dương: có ngưng kết. Giếng 3: chứng âm: không có ngưng kết. Quan sát và so sánh sự ngưng kết cuối cùng ở giếng mẫu 1 với chứng dương và chứng âm. Nếu có ngưng kết, nghĩa là kết quả dương tính, chứng tỏ có sự nhiễm liên cầu khuẩn. Tuy nhiên, để ước lượng nồng độ vi khuẩn trong máu, ta phải tiến hành phương pháp bán định lượng. PHƯƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƯỢNG: Phản ứng 1: 50 microlit huyết thanh + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận âm tính.  Dương tính: pha loãng. 50 microlit huyết thanh + 50 microlit NaCl 0,9%: dung dịch (1). 7
Phản ứng 2: 50 microlit dung dịch (1) + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận dương tính 200 UI.  Dương tính: pha loãng tiếp. 50 microlit dung dịch (1) + 50 microlit NaCl 0,9%: dung dịch (2). Phản ứng 3: 50 microlit dung dịch (2) + 50 microlit thuốc thử:  Âm tính: kết luận dương tính 400 UI  Dương tính: pha loãng tiếp. Bài 5. MỘT SỐ NGUYÊN TẮC VÔ KHUẨN TRONG THỰC HÀNH VI SINH. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Nắm được một số nguyên tắc vô khuẩn cơ bản trong thực hành vi sinh. 2. Thực hiện được quy trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy đảm bảo vô khuẩn. I. MỘT SỐ NGUYÊN TẮC VÔ KHUẨN TRONG THỰC HÀNH VI SINH: 1. Khử trùng và tiệt trùng dụng cụ: - Khử trùng bằng hấp ướt: 1210C_1 atm: 30 phút. - Tiệt trùng bằng nhiệt khô: 1700C: 2 giờ. 2. Khử trùng và tiệt trùng môi trường nuôi cấy: Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 1210C_1 atm: 15 phút. Chiếu UV: 15 phút sau khi đỗ môi trường. II. QUY TRÌNH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY: 1. Các loại môi trường sử dụng: - Môi trường thạch NA. - Môi trường thạch EMB. - Môi trường thạch MHA. 2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: - Cân và pha môi trường theo hướng dẫn. - Hấp môi trường ở 1210C_1 atm: 15 phút. - Chờ nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-650C, đỗ môi trường vào các đĩa Petri đã tiệt khuẩn trong tủ nuôi cấy vô khuẩn. - Sau 30 phút, chiếu tia UV 15 phút. Bài 6. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN MỤC TIÊU HỌC TÂP 1. Nắm được nguyên tắc của phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn. 2. Thực hiện được phương pháp cấy 3 đường. 3. Biết cách đọc kết quả cấy 3 đường. I. NGUYÊN TẮC: Phân lập vi khuẩn hay tách rời vi khuẩn từ một hỗn hợp dựa trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy. Để làm cạn dần mầm cấy ta có thể áp dụng phương pháp cấy 3 đường. 8
II. DỤNG CỤ: - Môi trường thích hợp: NA, EMB… - Vi khuẩn cần phân lập. - Tủ nuôi cấy vô khuẩn. - Tủ ấm vi sinh. - Que cấy vòng. - Đĩa petri, đèn cồn, cồn 700. III. THỰC HIỆN: 1. Dùng bút chì sáp chia đáy thạch ra làm 4 phần bằng nhau bằng cách kẻ chữ thập đánh số từ 1 – 4. 2. Khử trùng vòng cấy bằng cách đốt đỏ vòng cấy. 3. Đợi vòng cấy nguội. Lấy vòng cấy bằng cách nhúng vòng cấy vào ống nghiệm chứa hỗn hợp vi khuẩn. Lấy một vòng cấy hỗn hợp vi khuẩn. 4. Cấy lần thứ I: Đặt vòng cấy có vi khuẩn vào trên mặt thạch ở vùng số 1. Cấy vi khuẩn từ vùng 1 sang vùng 2 bằng cách chạm nhẹ đầu vòng cấy trên mặt thạch, kéo zic – zac từ vùng 1 sang vùng 2. Cấy khoảng 1/3 đường kính hộp thì dừng lại. 5. Đốt đỏ vòng cấy, để nguội. 6. Cấy lần thứ II: Xoay hộp thạch 900, để vùng 2 – 3 lên trên, đặt vòng cấy đã nguội, không lấy thêm mầm cấy, cấy lần thứ 2 bằng cách: Đặt vòng cấy vào vùng 2, nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zic – zac từ vùng 2 sang vùng 3. Giống như lần cấy thứ I, sau khi cấy được 1/3 đường kính hộp thạch, ta dừng lại. 7. Đốt đỏ vòng cấy, để nguội. 8. Cấy lần thứ III: Xoay hộp thạch 900, để vug 3-4 lên trên, đặt vòng cấy đã nguội vào vùng 3, nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zic-zac từ vùng 3 sang vùng 4. Lần này ta cấy lên khắp diện tích mặt thạch còn lại. 9. Cấy xong, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ấm 370C. Hôm sau đọc kết quả. VI. ĐỌC KẾT QUẢ: Quan sát vi khuẩn bằng mắt trần. Quan sát ở vùng của chiều cấy thứ 3, chỗ có các vi khuẩn nằm riêng lẻ. Chú ý quan sát sự khác nhau giữa các khúm vi khuẩn. Mỗi loại vi khuẩn khi tăng trưởng sẽ tạo nên một loại khuẩn lạc khác nhau về: - Hình dạng khuẩn lạc: + Đường kính. + Đường viền. + Bề mặt ( lòi hay lõm, khô hay ướt, trơn hay nhăn). - Màu sắc của khuẩn lạc. - Độ đục trong của khuẩn lạc. Mỗi một sự khác nhau về chi tiết của hình dạng, màu sắc, độ đục trong của khuẩn lạc có thể tượng trưng cho một loại vi khuẩn khác nhau. Sau khi quan sát hộp thạch để tìm sự khác biệt của các loài khuẩn lạc. Có thể kết luận: có bao nhiêu khuẩn lạc khác nhau là có bấy nhiêu loại vi khuẩn hiện diện trên hộp thạch. 9
Bài 7. KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ MỤC TIÊU HỌC TẬP 1. Trình bày được định nghĩa kháng sinh đồ. 2. Nắm được nguyên tắc, cách làm và cách đọc kết quả kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên thạch. 3. Thực hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên thạch và đọc kết quả. I. ĐỊNH NGHĨA: Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh. Trong thực tế lâm sàng, kháng sinh đồ có ý nghĩa giúp cho người thầy thuốc chọn được kháng sinh thích hợp và liều lượng thích hợp nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và hạn chế hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Ngoài ra, kỹ thuật này còn dùng trong giám sát dịch tễ học nhằm phát hiện tính kháng thuốc của vi khuẩn. Có nhiều phương pháp kháng sinh đồ, như: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên thạch của Kirby-Bauer, Phương pháp pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm… Trong buổi thực tập này, chúng ta sẽ tìm hiểu về phương pháp chính là đĩa giấy khuếch tán trên thạch (Kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer). II. NGUYÊN TẮC: Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch xung quanh, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn thể hiện sự nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh. Trường hợp không có vòng vô khuẩn, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. III. DỤNG CỤ: - Đĩa kháng sinh: là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh phải được cất giữ trong các ống có chứa các chất chống ẩm và phải bảo quản lạnh. Khi thực hiện kháng sinh đồ, các ống chứa đĩa kháng sinh phải được lấy ra khỏi tủ lạnh 1-2 giờ trước khi mở nắp. - Môi trường: MHA. - Chủng vi khuẩn cần làm kháng sinh đồ. - Ống nghiệm vô khuẩn. - NaCl 0,9% vô khuẩn. - Que cấy vòng, que tăm bông tiệt trùng, bông không thấm nước. - Đèn cồn. - Kéo, kẹp… - Tủ ấm vi sinh. IV. TIẾN HÀNH: 1. Pha dung dịch vi khuẩn: Từ một đĩa nuôi cấy thuần chủng, dung que cấy vô khuẩn chấm vào 10 khuẩn lạc để được một ăng đầy, hòa tan vào 1 ml dung dịch đệm PBS hoặc 1ml nước muối sinh lý. So sánh với Mc Faland 0.5, nếu cần thiết phải cho thêm PBS hoặc nước muối sinh lý để có nồng độ 108 vi khuẩn/ ml ( dung dịch 1). Pha loảng dung dịch 1 để có 106 vi khuẩn/ml bằng cách lấy 0.5ml dung dịch 1 cho vào 4.5ml PBS được dung dịch 2. Tiếp theo lấy 0.5ml dung dịch 2 hòa vào 4.5ml PBS được dung dịch 3. Dung dịch 3 sẽ có 106 vi khuẩn/ml. 2. Phết đều vi khuẩn lên đĩa thạch: - Dùng que tăm bông vô khuẩn nhúng vào dung dịch vi khuẩn, ép hết nước bằng cách ép nhẹ tăm bông lên thành ống nghiệm. - Trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách dùng que tăm bông kẻ hai đường vuông góc. Sau đó, phết vi khuẩn từ giữa dần ra ngoài. Xoay đĩa petri 90 0 và phết tiếp từ 10
giữa ra ngoài đến khi vi khuẩn được trải đều trên đĩa thạch. Để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 10-15 phút. 3. Đặt đĩa kháng sinh lên đĩa thạch đã được trải đều vi khuẩn: - Hơ kẹp trên ngọn đèn cồn. - Để kẹp nguội rồi lấy 1 đĩa kháng sinh cho mỗi loại, đặt nhẹ đĩa kháng sinh lên mặt thạch. Các đĩa kháng sinh cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm và cách nhau khoảng 2 cm. Phải đảm bảo mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch. Có thể đặt 5-6 đĩa kháng sinh. - Hơ kẹp và thu dọn dụng cụ.  Chú ý: Tất cả các thao tác đều phải được thực hiện gần ngọn đèn cồn. Sau khi thực hiện xong, úp ngược đĩa thạch. Sau đó, để ở tủ ấm 37 0C từ 18-20 giờ. Nhận xét và đọc kết quả. V. ĐỌC KẾT QUẢ: Quan sát hộp thạch với chủng vi khuẩn thử nghiệm: Chúng ta nhận thấy vi khuẩn mọc trên khắp mặt thạch và làm đục mặt thạch. Có 2 trường hợp xảy ra: 1. Xung quanh đĩa kháng sinh không có vòng vô khuẩn (Thạch đục đến tận mép đĩa kháng sinh). Kết luận: vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh đó. 2. Xung quanh đĩa kháng sinh có một vòng trong suốt, đó là vòng vô khuẩn, là nơi dưới tác dụng của kháng sinh vi khuẩn không mọc được. Trong trường hợp này, ta không thể kết luận ngay mà phải đo đường kính vòng vô khuẩn (tính bằng mm). Đánh giá kết quả: căn cứ vào bảng Giới hạn đường kính vùng ức chế do các hãng sản xuất đĩa kháng sinh mẫu quy định để xác định mức độ. Có 3 mức độ nhạy cảm với kháng sinh: Độ S: nhạy cảm (susceptible): vi khuẩn đáp ứng với những liều kháng sinh thông thường được dùng theo những đường thích hợp, gồm cả đường uống. Độ I: trung gian (intermediate): vi khuẩn có thể bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt được sau khi được dùng liều lớn nhất theo đường tiêm chích. Độ R: đề kháng (resistant): vi khuẩn không bị ức chế với nồng độ kháng sinh đạt được, do đó thuốc không nên được lựa chọn cho điều trị.. Nên lựa chọn những loại kháng sinh cho kết quả kháng sinh đồ ở mức độ S để điều trị trên lâm sàng. Nhưng trong những loại kháng sinh cùng cho mức độ S thì nên lựa chọn loại kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, có tác dụng đặc hiệu đối với loại vi khuẩn thử, ít tác dụng phụ và rẻ tiền để điều trị. 11