zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Khoa học tự nhiên

Bài tiểu luận: Phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

Chia sẻ: Nguyến Văn Đê | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:44

Báo xấu

124
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài tiểu luận "Phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc" giới thiệu đến các bạn những nội dung về coliforms, phương pháp phân tích vi sinh thực phẩm như: Phương pháp enzyme, phương pháp phân tử,...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài tiểu luận: Phát hiện và đếm coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc

BÔ CÔNG TH ̣ ƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  Môn : Phân Tích Vi Sinh Th ực Ph ẩm Đề Tài: Detection And Enumeration Of Coliforms In Drinking Water: Current Methods And Emerging Approaches (Phát Hiện Và Đếm Coliforms Trong Nước Uống: Các Phương Pháp Hiện Thời Và Phương Pháp Tiếp Cận Nổi Bậc) GVGD: Phan Thị Kim Liên TP.HCM,THÁNG 112014
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 2
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................... 3 TÓM TẮT ......................................................................................................... 4 1. Giới Thiệu.......................................................................................................................5 1.1. Coliforms là gì?...............................................................................................................7 2. Mục Tiêu.......................................................................................................................10 3. Phương Pháp Cổ Điển.................................................................................................10 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống..........................................................................................10 3.2. Kỹ thuật màng lọc.........................................................................................................12 4. Phương Pháp Enzyme.................................................................................................15 4.1 Nguyên tắc chung..........................................................................................................15 4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme...........................................................................................17 4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn............................................20 4.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry...........................................21 4.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn...........22 4.6. Kết luận về phương pháp enzyme...............................................................................23 5. Phương Pháp Phân Tử ...............................................................................................24 5.1. Phương pháp miễn dịch ..............................................................................................24 5.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic .............................................................................28 6. Kết Luận.......................................................................................................................41 LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ 44 GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 3
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm TÓM TẮT Nhóm coliform được sử dụng rộng rãi như một chỉ tiêu của chất lượng nước và về phương diện lịch sử đã dẫn đến khái niệm bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Mục đích của việc xem xét này là để kiểm tra phương pháp hiện đang được sử dụng hoặc có thể được đề xuất cho việc kiểm tra định lượng coliforms trong nước uống. Trên thực tế, nhu cầu về các thử nghiệm nhanh hơn, nhạy hơn và cụ thể hơn là điều cần thiết trong ngành công nghiệp nước. Các kỹ thuật thông thường và được thừa nhận rộng rãi, đã được thảo luận, như là các phương pháp nổi bậc từ sự phát triển của các nghiên cứu gần đây. Phương pháp truyền thống đã được chấp nhận để phát hiện coliform bao gồm kỹ thuật lên men nhiều ống (MTF) và kỹ thuật màng lọc (MF) sử dụng môi trường nuôi cấy cụ thể và điều kiện ủ khác nhau. Những phương pháp này vẫn còn những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ bệnh, sự can thiệp sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể và việc phát hiện kém đối với các vi sinh vật phát triển chậm hoặc có thể phát triển và tồn tại mà không nuôi cấy. Ngày nay, kỹ thuật màng lọc đơn giản và không tốn kém là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất cho việc định lượng thông thường coliforms trong nước uống. Việc phát hiện coliforms dựa trên hoạt tính enzyme đặc trưng đã cải thiện được độ nhạy của các phương pháp này. Các enzyme βD galactosidase và βD glucuronidase được sử dụng rộng rãi để phát hiện và định lượng coliforms tổng và Escherichia coli, tương ứng. Nhiều chất chromogenic và fluorogenic được dùng để phát hiện cụ thể hoạt tính của các enzyme này và các thử nghiệm mang tính thương mại khác nhau được dựa trên các chất có sẵn này. Nhiều sự so sánh đã cho thấy những thử nghiệm này có thể là một thay thế thích hợp cho các kỹ thuật cổ điển. Tuy nhiên, phương pháp này thì đắt hơn, và thời gian ủ, mặc dù giảm, nhưng vẫn còn quá dài để cho kết quả cùng ngày. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 4
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Các công cụ phân tích tinh vi hơn như kỹ thuật đếm tế bào pha rắn có thể được tận dụng để làm giảm thời gian cần thiết để phát hiện các hoạt động của enzyme ở vi khuẩn, với một ngưỡng phát hiện thấp. Phát hiện coliforms bằng phương pháp phân tử này cũng được đề cập, vì các phương pháp này cho những phát hiện rất cụ thể và nhanh chóng mà không cần nuôi cấy. Ba phương pháp phân tử được đánh giá ở đây: các kỹ thuật miễn dịch, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai tại chỗ (ISH). Trong cách phương pháp miễn dịch, các kháng thể khác nhau chống lại vi khuẩn coliform được tạo ra, nhưng việc áp dụng kỹ thuật này thường cho thấy kháng thể mang tính đặc hiệu thấp. PCR có thể được sử dụng để phát hiện vi khuẩn coliform bằng phương pháp khuếch đại tín hiệu: trình tự DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b galactosidase) và gen uidA (b – D gen glucuronidase) đã được sử dụng để phát hiện tổng coliforms và E. coli, tương ứng. Tuy nhiên, việc định lượng với PCR vẫn thiếu chính xác và đòi hỏi phải làm việc trong phòng thí nghiệm chuyên dụng. Kỹ thuật FISH liên quan đến việc sử dụng các đầu dò oligonucleotide để phát hiện các trình tự bổ sung bên trong tế bào cụ thể. Đầu dò oligonucleotide được thiết kế đặc biệt cho phạm vi của các phân tử RNA 16S của Enterobacteriaceae có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng vi sinh của các mẫu nước uống. FISH nên là một kỹ thuật cần quan tâm có thể thay thế cho các phương pháp nuôi cấy thông thường để xác định nhóm coliform trong nước uống, vì nó cung cấp các dữ liệu định lượng trong một khoảng thời gian khá ngắn (6 – 8 tiếng), nhưng vẫn đòi hỏi nỗ lực nghiên cứu. 1. Giới Thiệu Việc bảo vệ sức khỏe công đồng và môi trường đòi hỏi nước uống phải an toàn, điều đó có nghĩa là không chứa VSV gây bệnh. Giữa các VSV phân tán trong các nguồn nước, VSV gây bệnh ở ruột là những loại dễ bắt gặp nhất. Như một hệ quả, các nguồn ô nhiễm phân trong nước dành cho hoạt động con người phải được kiểm soát chặt chẽ. Tác nhân gây bệnh đường ruột, như Escherischia GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 5
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm coli O157: H7, thường hiện diện tại nồng độ rất thấp trong môi trường nước trong một hệ vi thực vật đa dạng. Các phương pháp phức tạp được đòi hỏi để phát hiện ra chúng, và những phương pháp này thì vô cùng tốn thời gian. Hầu hết coliform hiện diện với số lượng lớn trong hệ thực vật đường ruột của người và động vật máu nóng khác, và vì thế nên chúng được tìm thấy trong phân thải. Như một hệ quả, coliforms, được phát hiện ở nồng độ cao hơn vi khuẩn gây bệnh, được sử dụng như một chỉ số thể hiện sự hiện diện tiềm ẩn của tác nhân gây bệnh đường ruột trong môi trường nước. Việc sử dụng các nhóm coliform, và cụ thể hơn là E. coli, như một chỉ số vi sinh của chất lượng nước có từ sự phân lập đầu tiên của các vi sinh vật này từ phân vào cuối thế kỷ thứ 19. Coliforms cũng thường được tìm thấy trong môi trường tự nhiên đa dạng, như một vài loài trong số đó có nguồn gốc từ đất, nhưng nước uống không phải là một môi trường tự nhiên của chúng. Sự hiện diện của chúng trong nước uống ít nhất phải được coi là một mối đe dọa hoặc dấu hiệu của vi sinh vật về sự suy thoái của chất lượng nước. Số mẫu coliform tổng dương tính trong một nguồn nước đã được xử lý mà thường không có coliform thì có thể là chỉ ra việc xử lý không có hiệu quả, mất mát của chất khử trùng, bị chọc thủng (McFeters và các cộng sự, 1986), sự xâm nhập của nước ô nhiễm vào các nguồn cung cấp nước sinh hoạt (Geldreich và các cộng sự, 1992; Clark và các cộng sự, 1996) hoặc các vấn đề tái sử dụng (LeChevallier, 1990) trong hệ thống phân phối, và, như một hệ quả, không được cho phép. Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số về việc có thể hiện diện các tác nhân gây bệnh đường ruột trong các hệ thống thủy sinh là một đề tài tranh luận trong nhiều năm. Nhiều tác giả đã báo cáo dịch bệnh qua đường nước trong cuộc họp quy định coliform trong nước (Payment và các cộng sự, năm 1991; Moore và các cộng sự, 1994; MacKenzie và các cộng sự, 1994; Gofti và các cộng sự, 1999). Tuy nhiên, mục đích của bài viết này không phải là để thảo luận về các khái niệm chỉ số, mà là để xác định phương pháp hiện đang được sử dụng GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 6
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm hoặc có thể được đề nghị cho việc theo dõi coliforms trong nước uống. Sự cần thiết của các kiểm nghiệm nhanh và nhạy hơn là không thay đổi trong ngành công nghiệp nước, với mục đích là theo dõi trực tuyến liên tục của các nhà máy xử lý nước thải. 1.1. Coliforms là gì? Các nhóm coliform bao gồm một sự đa dạng phong phú về thuật ngữ chi và loài, dù có hoặc không thuộc họ Enterobacteriaceae. Hầu hết các định nghĩa coliforms là chủ yếu dựa trên các đặc tính sinh hóa thông thường. Trong các phương pháp tiêu chuẩn cho việc kiểm tra nước và nước thải (Part 9221 và 9222; APHA và các cộng sự, 1998),các thành viên nhóm coliform được mô tả như sau: 1. Tất cả đều kỵ khí và hiếu khí tuỳ ý, gram , không bào tử, vi khuẩn hình que và lên men lactose sinh khí và tạo axit trong vòng 48h ở 35 oC (Kỹ thuật lên men nhiều ống; Phần 3.1) hoặc 2. Tất cả hiếu khí và kỵ khí nhiều tuỳ ý, gram âm, không bào tử, vi khuẩn hình que phát triển thành một khuẩn lạc màu đỏ ánh kim trong vòng 24h ở 35oC trên một môi trường loại Endo có chứa lactose (màng lọc kỹ thuật; Phần 3.2). Định nghĩa các thành viên của nhóm coliform gần đây đã được mở rộng bao gồm các đặc điểm khác, chẳng hạn như phản ứng βDgalactosidase dương tính (Part 9223;. APHA et al, 1998) (kiểm tra enzyme nền, phần 4.2). Vi ệc tìm kiếm các vi sinh vật βgalactosidase dương tính và đệm βgalactosidedương tính cũng cho phép một bước xác nhận lên men lactose, khi đó kỹ thuật lên men nhiều ống được sử dụng. Các thử nghiệm cytochrome oxidase cũng được sử dụng như là một thử nghiệm khẳng định để loại bỏ một số vi khuẩn của chi Aeromonas hoặc Pseudomonas mà có thể lên men lactose. Định nghĩa của vi khuẩn coliform hơi khác tùy thuộc vào quốc gia hoặc các tổ chức chịu trách nhiệm về các quy định giám sát vi sinh. Tại Canada, định nghĩa giống như ở Mỹ, và khác với một số nước châu Âu. Ví dụ, Hiệp hội Tiêu GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 7
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm chuẩn Pháp (NFT90413 và NFT90414; AFNOR, 1990), nó có thể được xem là một mô hình đại diện cho luật pháp châu Âu, xác định coliforms tổng (TC) như: Hình que, không bào tử, gram âm, oxidase âm tính, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý. Vi khuẩn có thể phát triển trong sự hiện diện của muối mật hoặc chất có hoạt tính bề mặt thay thế khác có tác dụng ức chế sự tăng trưởng tương tự và lên men lactose sinh khí và sinh acid (hoặc aldehyde) trong vòng 48 giờ ở 37 ± 1oC. AFNOR (1990) đi xa hơn bằng cách định nghĩa nhóm coliform khác, bao gồm cả các coliform chịu nhiệt (còn gọi là coliforms phân, FC), và cụ thể hơn, E. coli là: Coliforms chịu nhiệt có cùng đặc tính lên men như coliforms (TC), nhưng nhiệt độ 44 ± 0,5oC. E. coli là một coliform chịu nhiệt, chỉ khác một vài điều, tạo indole từ tryptophane tại nhiệt độ 44 ± 0.5oC, cho kết quả thử nghiệm methyl đỏ dương tính, không thể tạo ra acetylmethyl carbinol và không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất của nó. Việc sử dụng các nhóm coliform như một chỉ số ô nhiễm phân phải phụ thuộc vào các quy định nghiêm ngặt của chính phủ (Bảng 1). E. coli là coliforms phổ biến nhất trong hệ thực vật đường ruột của động vật máu nóng động vật và sự hiện diện của nó có thể liên quan chủ yếu đến ô nhiễm phân. Do đó không được phép có E. coli trong nước uống. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) đã phê duyệt một số phương pháp để phát hiện coliform: các kỹ thuật lên men nhiều ống, kỹ thuật màng lọc và các thử nghiệm có mặt /không có mặt (bao gồm các thử nghiệm ONPG – MUG). AFNOR (1990) đã phê duyệt kỹ thuật lên men nhiều ống và kỹ thuật màng lọc. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 8
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Các phương pháp này có những hạn chế, chẳng hạn như thời gian ủ, sự can thiệp của sinh vật đối kháng, thiếu tính cụ thể ở các nhóm coliform và độ phát hiện kém của đối với coliforms phát triển chậm hoặc bị tổn thương. Vì thế, tùy thuộc vào hệ thống môi trường, chỉ một phần nhỏ (0,115%) trong tổng số quần thể vi khuẩn có thể được đếm bởi phương pháp nuôi cấy (Amann và các cộng sự, 1990). Tỷ lệ vi khuẩn không nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện không thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong suốt quá trình nuôi cấy hoặc bởi khả năng sống sót hoặc hoạt động của chúng ở trạng thái không nuôi cấy (VBNC hoặc ABNC) (Roszak và Colwell, 1987; Joux và Lebaron, 2000; Colwell và Grimes, 2000). Bảng 1. Một số quy định chống nhiễm khuẩn hiện và hướng dẫn cho nước uống Yêu cầu giám sát Coliform tổng E.coli Mật độ Mẫu/tháng 0/100 ml (95%) United một mẫu liên tiếp từ 0/100 ml ≈ 1/1000 sinh Statesa cùng vị trí không được (100%) vật có coliform 0/100 ml (90%) không nên chứa nhiều hơn 10 CFU/100 ml 0/100 ml 9000 thế giớic (100%) sinh vật) GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 9
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm a. Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ năm 1990. b Bộ y tế Canada, 1996. c Tổ chức Y tế Thế giới, 1994. 2. Mục Tiêu Vì nước uống là chế độ nghèo dinh dưỡng, các phương pháp nuôi cấy kém nhạy trong việc phát hiện các tế bào vi khuẩn bị tổn thương và sắp chết có thể tạo ra những hạn chế nghiêm trọng do việc đánh giá quá thấp mức độ ô nhiễm. Có tồn tại các phương pháp khác mà có thể được sử dụng để phát hiện coliform, và là những trạng thái khác nhau của sự phát triển và ứng dụng. Đánh giá này mô tả các nguyên tắc và các cách thức thông thường của phương pháp cổ điển, cũng như một số các phương pháp đổi mới và phương pháp tiếp cận mới nổi. Việc ứng dụng các phương pháp khác nhau để phát hiện coliforms trong một môi trường nghèo chất dinh dưỡng như nước uống cũng được đánh giá dựa trên những ưu điểm và nhược điểm của chúng. Các tiêu chí như giới hạn phát hiện và độ nhạy của các phương pháp, thời gian cần thiết để có được kết quả và các kinh phí của phòng thí nghiệm (bao gồm cả kỹ năng, lao động và chi phí) cũng được thảo luận. 3. Phương Pháp Cổ Điển 3.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống Kỹ thuật để đếm coliforms bằng phương pháp lên men nhiều ống (MTF) đã được sử dụng hơn 80 năm như là một phương pháp kiểm tra chất lượng nước. Phương pháp này bao gồm việc cấy một loạt các ống với dung dịch pha loãng thập phân thích hợp của các mẫu nước. Tạo bọt khí, hình thành axit hoặc tăng trưởng nhiều trong ống nghiệm sau 48 giờ ủ ở 35 oC thì có thể là phản ứng GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 10
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm dương tính. Cả môi trường dịch thể lactose và lauryl tryptose đều có thể được sử dụng như một môi trường nuôi cấy giả định, nhưng Seidler và các cộng sự (1981) và Evans và các cộng sự (1981) đã can thiệp, với số lượng lớn vi khuẩn không phải là coliform, thì sử dụng môi trường dich lỏng lactose. Tất cả ống có phản ứng dương tính giả định tiếp sau đó phải thực hiện một thử nghiệm khẳng định. Sự hình thành khí trong các ống lên men chứa môi trường brilliant green lactose bile tại bất kỳ thời điểm nào trong vòng 48 giờ ở 35 oC tạo thành một thử nghiệm khẳng định dương tính. Các thử nghiệm coliform phân (sử dụng một môi trường canh EC) có thể được áp dụng cho xác định colifom tổng (TC) mà cụ thể là FC (APHA và các cộng sự, 1998): việc tạo khí sau 24 giờ ủ ở 44,5oC trong canh EC được coi là một kết quả dương tính. Các kết quả của kỹ thuật MTF được thể hiện trong điều khoản số lượng có thể xảy ra nhất (MPN) về sự hiện diện của vi sinh vật. Con s ố này là một ước lượng thống kê của trung bình số coliform trong mẫu. Hệ quả là, kỹ thuật này được đưa ra để định lượng sơ bộ coliforms. Tuy nhiên, độ chính xác của việc ước lượng thì thấp và phụ thuộc vào số ống dùng để phân tích: ví dụ, nếu chỉ 1 ml được xem xét trong một mẫu chứa 1 coliform / ml, khoảng 37% trong các ống 1 ml có thể mong đợi dự kiến sẽ mang lại kết quả âm tính vì các phân phối ngẫu nhiên của các vi khuẩn trong mẫu. Nhưng, nếu năm ống, mỗi 1 ml mẫu, được sử dụng, một kết quả âm tính có thể được dự kiến sẽ ít hơn 1% của thời gian (APHA và các cộng sự, 1998). Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đáng kể coliform đến phát hiện vi khuẩn bằng MTF, đặc biệt là trong suốt giai đoạn giả định. Sự can thiệp của một lượng lớn vi khuẩn không phải là coliform (Seidler et al, 1981; Evans và các cộng sự, 1981; Means và Olson, 1981), cũng như bản chất ức chế của môi trường (McFeters và các cộng sự, 1982), đã được xác định là yếu tố góp phần đánh giá thấp các coliform đa dạng. Kỹ thuật MTF thiếu chính xác về định tính và định lượng. Thời gian cần thiết để có được kết quả cao hơn so với các kỹ thuật khác. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 11
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Kỹ thuật màng lọc đã thay thế kỹ thuật MTF trong nhiều trường hợp cho việc kiểm tra hệ thống nước uống. Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn còn hữu ích, đặc biệt là khi điều kiện không cho phép sử dụng các kỹ thuật lọc màng, chẳng hạn như các loại nước đục hoặc có màu. MTF là dễ thực hiện và có thể được thực hiện bởi một kỹ thuật viên được đào tạo cơ bản về vi sinh, nhưng phương pháp này có thể trở nên rất dài dòng và cần nhiều nhân công vì nhiều dung dịch pha loãng đã được xử lý cho mỗi mẫu nước. Tuy nhiên, nó tương đối là không tốn kém, vì nó không đòi hỏi thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này là cực kỳ tốn thời gian, đòi hỏi 48h cho kết quả giả định, và buộc phải có một giai đoạn nuôi cấy lại để khẳng định mà có thể mất lên tới hơn 48h. 3.2. Kỹ thuật màng lọc Các màng lọc kỹ thuật (MF) đã hoàn toàn được chấp nhận và đã được phê duyệt như một thủ tục để theo dõi chất lượng vi sinh vật trong nước uống ở nhiều quốc gia. Phương pháp này bao gồm lọc một mẫu nước trên một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,45 mm mà vẫn giữ lại vi khuẩn, ủ màng lọc này trên môi trường chọn lọc và đếm các khuẩn lạc điển hình trên các màng lọc. Nhiều môi trường và điều kiện ủ cho phương pháp MF được thử nghiệm cho việc phục hồi tối ưu của coliformstừ mẫu nước (Grabow và du Preez, 1979; Rice và các cộng sự, 1987). Trong đó, được sử dụng phổ biến cho phân tích nước uống là loại môi trường mEndo ở Bắc Mỹ (APHA và các cộng sự, 1998) và môi trường Tergitol TTC ở châu Âu (AFNOR, 1990). Vi khuẩn coliform hình thành khuẩn lạc màu đỏ ánh kim trên một môi trường loại Endo loại môi trường có chứa lactose (ủ trong 24 giờ ở 35oC đối với TC) hoặc khuẩn lạc màu vàng – cam trên môi trường TergitolTTC (ủ trong 24 và 48 h ở 37 và 44oC đối với TC và FC, tương ứng). Môi trường nuôi cấy khác, chẳng hạn như thạch MacConkey và môi trường Teepol, đã được sử dụng ở Nam Phi và Anh. Tuy nhiên, so sánh giữa các GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 12
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm môi trường nuôi cấy thì thạch mEndo mang lại giá trị đếm được cao hơn thạch MacConkey hoặc thạch Teepol (Grabow và du Preez, 1979). Để đếm các FC, APHA và các cộng sự (1998) cho rằng màng lọc được ủ trên môi trường làm giàu lactose (mFC) ở nhiệt độ 44,5oC trong 24 giờ. Bởi vì nhiệt độ ủ tăng cao và việc bổ sung thuốc thử muối acid rosolic, vài khuẩn lạc không phải coliform phân phát triển trên các môi trường mFC (APHA và các cộng sự, 1998). Việc đếm TC bằng cách lọc màng thì không hoàn toàn thiết thực. Khi MF được kết hợp với môi trường nuôi cấy mEndo chứa lactose, các khuẩn lạc không điển hình thì có màu đỏ sẫm, nhầy hoặc có nhân và không có ánh kim thỉnh thoảng có thể xuất hiện. Khuẩn lạc không điển hình màu xanh, hồng, trắng hoặc không màu thiếu ánh thì không được xem trong TC trong kỹ thuật này (APHA và các cộng sự, 1998). Hơn nữa, các khuẩn lạc điển hình với một độ óng ánh đôi khi được tạo ra bởi vi khuẩn không phải là coliform và ngược lại, các khuẩn lạc không điển hình (màu đỏ sẫm hoặc khuẩn lạc có nhân mà không có ánh kim) thường không phải là coliforms. Do đó việc xác nhận Coliform có thể được chấp nhận cho cả hai loại khuẩn lạc (APHA và các cộng sự, 1998). Với việc chấp nhận MF như một kỹ thuật chọn lọc cho việc theo dõi nước uống (APHA và các cộng sự, 1998; AFNOR, 1990), các câu hỏi liên quan đến việc phát hiện coliform và tính chính xác của việc định lượng đã tăng lên. Sự hiện diện của số lượng lớn vi khuẩn dị dưỡng nền làm giảm việc hồi phục của coliform trong MF (Clark, 1980; Burlingame và các cộng sự, 1984). Các khuẩn lạc tập hợp quá lớn trên các môi trường mEndo đã gắn liền với việc làm giảm các khuẩn lạc coliform tạo ra ánh kim (Hsu và Williams, 1982; Burlingame và các cộng sự, 1984). Điều đáng quan tâm về MF là nó không có khả năng để phục hồi coliforms bị căng thẳng hoặc bị tổn thương. Một số yếu tố hóa học và vật lý liên quan đến việc xử lý nước uống, bao gồm việc khử trùng, có thể gây ra thương vong cho vi khuẩn coliform, kết quả là một tế bào bị hư hỏng thì không thể hình thành một GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 13
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm khuẩn lạc trên môi trường mang tính chọn lọc. Việc phơi sáng của vi khuẩn để tạo ra sản phẩm như clo có thể dẫn đến tổn thương và tăng tính nhạy cảm với muối mật hoặc các chất hoạt động bề mặt thay thế (sodium desoxycholate hoặc Tergitol 7) chứa trong một số môi trường nuôi cấy chọn lọc. Một số cải tiến trong phương pháp đã tăng độ phát hiện đối với vi khuẩn coliform bị tổn thương, bao gồm cả việc phát triển các môi trường mT7 đặc biệt dành cho việc phục hồi của coliforms bị tổn thương trong nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983). Đánh giá thường xuyên về các mẫu nước uống (LeChevallier và các cộng sự, 1983; McFeters et al, 1986) và nước bề mặt. (McFeters và các cộng sự, 1986; Freier và Hartman, 1987) cho thấy sự phục hồi coliform cao hơn trên môi trường mT7 so với trên môi trường mEndo. Tuy nhiên, mT7 có thể không hiệu quả bằng mEndo khi các bộ phận bị tổn thương khác chlorine có liên quan. Rice và các cộng sự (1987) đã đem lại sự khác biệt khôn đáng kể trong coliform đã phục hồi trên mT7 so với mEndo LES từ mẫu monochloraminated, và Adams và các cộng sự (1989) thấy rằng môi trường mT7 không tốt bằng môi trường mEndo trong việc điều tra các tế bào E. coli và C. freundii tiếp xúc với ozone. Các tác giả khác đã gợi ý rằng việc khử trùng bằng clo ảnh hưởng đến các chức năng khác nhau về hoạt tính của vi khuẩn coliform, như hoạt tính enzym catalase (Calabrese và Bissonnette, 1990; Sartory, 1995). Vi khuẩn hoat động trao đổi chất tạo ra hydrogen peroxide (H2O2), việc này thường nhanh chóng bị thoái hóa bởi catalase. Coliforms bị thương với hoạt tính của catalase giảm sẽ tích lũy chất độc hydrogen peroxide, mà chúng thì cực kỳ nhạy. Calabrese và Bissonnette (1990) báo cáo về sự tăng lên trong việc phục hồi coliform trên môi trường nuôi cấy mEndo và mT7, cũng như sự gia tăng trong việc phục hồi E. coli trên mFC khi các môi trường nuôi cấy được bổ sung catalase, sodium pyruvate hoặc cả hai. Sartory (1995) cho rằng sodium pyruvate nên được thêm vào ở nồng độ 0,010,1% cho bất kỳ môi trường phát hiện coliform chuẩn nào vì sản phẩm này cho phép cải thiện việc phục hồi của các coliform chịu áp lực chlorine. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 14
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Số lượng lớn môi trường nuôi cấy thay đổi trong sử dụng là một phản ánh thực tế rằng không có môi trường thông dụng nào hiện nay tồn tại cho phép tối ưu việc đếm các loài coliform khác nhau có nguồn gốc từ các môi trường khác nhau và hiện diện ở nhiều trạng thái sinh lý. Những lợi ích đáng kể của kỹ thuật MF nhiều hơn là phương pháp MTF, việc kiểm tra các thề tích lớn của nước là khả thi, nhạy hơn và độ tin cậy cao hơn. MF cũng là một điều tra định lượng mang tính tương đối với việc định lượng sơ bộ các thông tin được ghi nhận bởi phương pháp MTF. MF là một kỹ thuật hữu ích cho đa số các phòng thí nghiệm về chất lượng nước vì nó là một phương pháp tương đối đơn giản để sử dụng. Nhiều mẫu có thể được xử lý trong một ngày với các thiết bị phòng thí nghiệm bị hạn chế bằng một kỹ thuật với các kỹ năng vi sinh cơ bản . Tuy nhiên, vì phương pháp này thì chưa đủ thiết thực, một giai đoạn khẳng định là cần thiết, mà nó có thể mất hơn 24 h sau giai đoạn ủ đầu tiên trên môi trường chọn lọc. Đây là lý do tại sao việc cải tiến phương pháp MF dựa trên các thuộc tính enzyme của coliforms đã được đề xuất (xem mục 4.3). 4. Phương Pháp Enzyme 4.1 Nguyên tắc chung Các xét nghiệm sinh hóa được sử dụng để xác định vi khuẩn và liệt kê các phương pháp nuôi cấy cổ điển thường được dựa trên các phản ứng trao đổi chất. Kết luận này, chúng không hoàn toàn cụ thể, và nhiều xét nghiệm bổ sung này đôi khi cần thiết để có được xác nhận chính xác. Việc sử dụng các enzyme của vi khuẩn để phát hiện vi khuẩn là một thay thế hấp dẫn đối với các phương pháp cổ điển. Phản ứng enzyme có thể là nhóm, chi hoặc loài cụ thể, tùy thuộc vào enzyme mục tiêu.Hơn nữa, phản ứng nhanh và nhạy cảm.Như vậy, khả năng phát hiện và liệt kê coliforms thông qua các hoạt động enzyme cụ thể đã được điều tra nhiều năm nay. GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 15
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm βDglucuronidase là một enzyme xúc tác thủy phân dẫn xuất βD glucopyranosiduronic vào aglycons tương ứng của chúng và acid Dglucuronic. Mặc dù enzyme vi khuẩn này được phát hiện đầu tiên trong E. coli, độ đặc hiệu tương đối của nó để xác định các vi sinh vật này là không rõ ràng cho đến khi Kilian và Bulow (1976) khảo sát các Enterobacteriaceae và báo cáo rằng hoạt động glucuronidase chủ yếu là giới hạn E. coli. Sự phổ biến của enzyme này và tiện ích của nó trong việc phát hiện vi khuẩn E. coli trong nước sau đó đã được xem xét bởi Hartman (1989). Phản ứng BDglucuronidase dương tính đã được quan sát trong 94 96% của E. coli phân lập được thử nghiệm (Kilian và Bulow, 1976; Feng và Hartman, 1982; Edberg và Kontnick, 1986;. Kaspar và cộng sự, 1987), trong khi Chang và cộng al. (1989) tìm thấy một tỷ lệ cao hơn của BD glucuronidaseE. coli âm tính (thời gian trung bình là 15% từ vi khuẩn E. coli phân lập từ mẫu phân của con người). Ngược lại, hoạt động BDglucuronidase là ít phổ biến hơn trong chi Enterobacteriaceae khác, chẳng hạn như vi khuẩn Shigella (4458%), Salmonella (2029%) và chủng Yersinia và Flavobacteria (Kilian và Bulow, 1976; Massanti et al ., 1981; Feng và Hartman, 1982; Frampton và Restaino, 1993). BDgalactosidase, xúc tác sự phân hủy của lactose thành glucose và galactose và đã được sử dụng chủ yếu để liệt kê các nhóm coliform trong họ Enterobacteriaceae. Việc sử dụng BDglucuronidase và các hoạt động BD galactosidase để phát hiện và đếm vi khuẩn E. coli và TC tương ứng, được xem xét ở đây. Chromogenic và chất fluorogenic sản xuất màu và huỳnh quang, tương ứng khi chia tách bởi một enzyme cụ thể.Các chất đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện hoặc các hoạt động của enzyme cụ thể trong các hệ thống thủy sản (Chrost, 1991). Một số tác giả đã xem xét chất fluorogenic và chromogenic được sử dụng để chẩn đoán vi khuẩn (Bascomb, 1987; Manafi et al, 1991.). Họ lưu ý rằng việc sử dụng các chất đã dẫn đến cải thiện độ chính xác và phát hiện nhanh hơn.Phương pháp phát hiện hoặc điều tra có thể được thực hiện trong một môi GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 16
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm trường duy nhất, do đó bằng cách thông qua sự cần thiết của một thủ tục tốn thời gian cách ly trước khi xác định. Để phát hiện sự hiện diện của BD glucuronidase trong E. coli, các chất nền chromogenic sau đây được sử dụng: (Brenner và cộng sự, 1993) indoxylBDGlucuronide (IBDG), các phenolphthaleinmonoBDglucuronide phức tạp (Butle và SBS, 1989) và 5 bromo4chloro3indolylBDglucuronide (XGlu) (Watkins et al, 1988).Thường xuyên nhất, các chất nền fluorogenic 4 methylumbelliferylBDglucuronide (MUGlu) đã được sử dụng (Dahlen và Linde, 1973; Feng và Hartman, 1982). Chất Chromogenic như onitrophenylBDgalactopyranoside (ONPG), pnitrophenylB Dgalactopyranoside (PNPG), 6bromo2naphtylBDgalactopyranoside (burger, 1967) và 5bromo 4chloro3indolylBDgalactopyranoside (XGal) (Ley et al., 1993) đã được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của BDgalactosidase sản xuất bởi coliforms, cũng như chất phát quang bề mặt 4 methylumbelliferylBD galactopyranoside (MUGal). 4.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ống sử dụng phương pháp enzyme Sự kết hợp của MUGlu vào lauryl tryptose broth sử dụng như một môi trường nuôi cấy cho quá trình lên men nhiều ống (MTF) kỹ thuật lần đầu tiên được đề xuất để phát hiện nhanh chóng và xác nhận ngay lập tức E. coli trong thực phẩm và mẫu nước (Feng và Hartman, 1982). Sự hiện diện của methylumbelliferone do sự thủy phân của MUGlu (mẫu dương tính) đã được phát hiện bởi sự tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím sóng dài và trực quan của sự phát huỳnh quang màu xanhtrắng. Một số tác giả đã sử dụng spectrofluorometer hoặc một quang phổ (Park et al, 1995.) (Standridge et al, 1992; Apte et al, 1995) để giảm ngưỡng phát hiện huỳnh quang và do đó làm giảm thời gian ủ bệnh. Dựa vào tính chất enzyme của vi khuẩn, một phương pháp xác định chất nền được phát triển để khắc phục một số hạn chế của MTF và kỹ thuật MF. Không giống như các phương pháp này, trong đó loại bỏ sự phát triển của vi GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 17
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm khuẩn khôngphải coliform với hóa chất ức chế, công nghệ bề mặt được xác định dựa trên nguyên tắc rằng chỉ có các vi khuẩn mục tiêu (TC và E. coli) được cung cấp và không được cung cấp chất nền cho các vi khuẩn khác. Một bề mặt được định nghĩa được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng quan trọng đối với các vi khuẩn mục tiêu. Trong quá trình sử dụng chất nền, một nhiễm sắc hoặc một fluorochrome được phát triển từ bề mặt, cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu. Edberg và Edberg (1988) đề xuất sử dụng công nghệ bề mặt kết hợp với chất nền ONPG cho các enzyme bgalactosidase có mặt trong tất cả các vi khuẩn và MUGlu chất nền cho việc phát hiện cụ thể của E. coli. Phương pháp xác định chất nền cơ bản đã được thành lập như là một kiểm tra sự hiện diện, sự vắng mặt.Các ống, cái mà sao khi thêm mẫu vẫn không màu.Ngoài ra, được ủ ở 35oC.Bất kỳ màu vàng trong ống nghiệm (chỉ ra quá trình thủy phân của ONPG) được coi là dương tính đối với TC. Bất kỳ ống vàng được tiếp xúc với ánh sáng tia cực tím bước sóng dài, và huỳnh quang màu xanhtrắng thể hiện sự hiện diện của vi khuẩn E. coli. Không có thử nghiệm xác nhận bổ sung cần phải được thực hiện. Thí nghiệm đầu tiên (Edberg và Edberg, 1988) chứng minh rằng kiểm tra các chủng môi trường của TC và E. coli cho thấy độ nhạy tương đương với các phương pháp cổ điển (lên đến 1 CFU / 100 ml) với đặc trưng có khả năng lớn hơn. Dữ liệu cũng xác nhận khả năng phát hiện vi khuẩn bị thương với thời gian đáp ứng tối đa 24 giờ. Rice et al. (1990, 1991) sử dụng nhiều chủng tinh khiết của vi khuẩn E. coli để xác định hiệu quả của công nghệ phát hiện chất nền được định nghĩa với BDglucuronidase và cho thấy kết quả tích cực (95,5% chủng BDglucuronidase dương tính trong 24 giờ và 99,5% dương tính sau 28 giờ ủ). Không có E. coli phân lập dương (Rice et al., 1990). Một số xét nghiệm thương mại sau đó được phát triển dựa trên công nghệ bề mặt được xác định: Colilert (IDEXX phòng thí nghiệm, Portland, ME, Mỹ), GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 18
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Colisure (công ty Millipore, Bedford, MA, USA), ColiQuick (Hach, Loveland, CO, USA). Hầu hết trong số này là có sẵn cho một phản ứng sự hiện diện/sự vắng mặt và đếm bằng kỹ thuật nhiều ống.Sử dụng rộng rãi nhất trong số đó là thử nghiệm Colilert, trong đó sử dụng các kỹ thuật bề mặt được chỉ rõ tính chất với ONPG và MUGlu.Rất nhiều và rất rộng rãi so sánh giữa những thử nghiệm thương mại và MTF cổ điển và phương pháp tiếp cận MF đã được thực hiện để liệt kê TC và E. coli trong các loại nước (Edberg và cộng sự, 1988, 1989, 1990.Clark và cộng sự, 1991. Olson và cộng sự năm 1991, McCarty và cộng sự, 1992;McFeters et al, 1993;. Palmer và cộng sự, 1993; Clark và ElShaarawi năm 1993; Colquhuon et al, 1995; Fricker và Fricker, 1996). Kết luận chính của các nghiên cứu này là những thử nghiệm có hiệu quả để phát hiện các vi khuẩn từ nhiều nguồn nước khác nhau, thường là nhạy cảm như là cách tiếp cận MTF để phát hiện vi khuẩn E. coli và đôi khi nhạy cảm hơn để phát hiện các TC. Gần đây, QuantiTray (QT) (IDEXX), mà là một phiên bản mở rộng của MPN kiểm tra Colilert (một phiên bản MPN với một số giới hạn các ống cũng đã được thương mại hóa ở giai đoạn đầu), được so sánh với các phương pháp MF, đặc biệt là mẫu nước uống, bởi Fricker et al. (1997), De Roubin et al. (1997) và Eckner (1998). Tất cả họ đều kết luận không có sự khác biệt đáng kể cho việc đếm E. coli giữa các phương pháp QT và MF, trong khi khả năng phục hồi của TC lớn hơn với kỹ thuật QT hơn so với phương pháp MF. McFeters et al. (1997a, b) tham khảo các tiêu chuẩn so sánh với các phương pháp thử nghiệm Colisure để phát hiện vi khuẩn chịu clo: với Colisure, thu hồi TC và E. coli bị tổn thương bởi clo được cải thiện hơn các phương pháp tiêu chuẩn, kết quả là một ước tính thực tế hơn vềchỉ số vi khuẩn trong nguồn cung cấp nước công cộng. Trong kết luận, kiểm tra dựa trên công nghệ bề mặt được xác định bằng cách sử dụng chất chromogenic và fluorogenic được áp dụng cho việc phát hiện và định lượng Coliform và E. coli trong nước uống. Các xét nghiệm này dễ sử dụng và cung cấp cho một ước tính nhanh hơn và thực tế hơn (đặc biệt là sự GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 19
Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm hiện diện của Clo dư) các chỉ số ô nhiễm vi khuẩn trong nước hơn so với trường hợp không có sự hiện diện cổ điển hay MTF. Những phương pháp này có thể tốn kém hơn so với phương pháp cổ điển khi sau này không cần các bước xác nhận bổ sung. Khi bước xác nhận được yêu cầu, các chi phí phát sinh trong cả hai phương pháp là tương đương. Trong mọi trường hợp, phương pháp enzyme đòi hỏi nhân lực ít hơn và do đó chi phí của họ về giá trị thương mại thấp hơn. 4.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn Dahlen và Linde (1973) đánh giá sự kết hợp của MUGlu vào môi trường thạch để phát hiện sự hiện diện của hoạt động BDglucuronidase (E. coli). Brenner et al. (1993) đã phát triển môi trường thạch MI, có chứa các MUGal fluorogenic và IBDG chromogenic, đồng thời phát hiện TC và E. coli trong nước. Phương pháp này đã được chứng minh là nhạy cảm, chọn lọc, cụ thể và nhanh chóng (kết quả có sẵn trong 24 h) (Brenner và cộng sự, 1996.). Gaudet et al. (1996) và Ciebin et al. (1995) liên quan MUGlu hoặc XGlu với cổ điển mTEC và thạch lauryl tryptose và so sánh với các phương pháp hiện đại thay đổi với các phương pháp cổ điển. Các môi trường hiện đại thay đổi môi trường thạch thường cho thấy sự phục hồi cao hơn hoặc tương tự như của TC và E. coli. Các môi trường nuôi cấy thương mại đang có sẵn để phát hiện các TC và E. coli. Chúng bao gồm các môi trường nuôi cấy môi trường thạch cổ điển được sử dụng cho E. coli và Coliform với các chất nền chromogenic và / hoặc fluorogenic cụ thể để phát hiện các BDglucuronidase và / hoặc BD galactosidase: thạch Chromocult Coliform (Merck, Darmstadt, Đức), thạch Fluo rocult E. coli trực tiếp (Merck) và mColiBlue24 broth (Hach) (Grant, 1997). Việc sử dụng các phương pháp đếm đĩa, bao gồm cả chất chromogenic và / hoặc fluorogenic, cho phép nhiều hơn, nhanh chóng, dễ dàng hơn và các ước tính chính xác hơn về coliform và E.coli rất nhiều trong nước uống hơn so với việc sử dụng các phương pháp cổ điển. Chúng có thể được sử dụng bởi bất kỳ GVGD: Phan Thị Kim Liên Trang 20

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học

320 tài liệu

1236 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.