BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:20

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

S. enteritidis hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan trọng nhất trong số các chủng Salmonella. Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076"

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076 1 Đỗ Thị Huyền, 2Nguyễn Thành Trung, 2Nguyễn Thị Thu Hằng, 1Phạm Thuý Hồng, 3Trương Văn Dung, 1 Trương Nam Hải, 2Lê Đình Lương 1: Viện Công nghệ sinh học, 2: Đại học Quốc gia Hà Nội 3: Viện Thú Y Trung Ương MỞ ĐẦU Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn cho người trên toàn cầu. Theo số liệu thống kê của Pháp năm 1995, trong số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ăn đã có tới 3131 bệnh nhân do Salmonella gây ra. Bệnh do Salmonella tập trung chủ yếu ở các nước châu Âu, châu Mỹ điển hình là Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan [1, 2]. S. enteritidis hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan trọng nhất trong số các chủng Salmonella. Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ ít hơn và chủng gây bệnh chủ yếu là S. typhimurium, S. cholera sau đó đến
S. enteritidis. Thông thường bệnh không gây triệu chứng nặng đối với người lớn nhưng lại gây triệu chứng nghiêm trọng đối với người già, người yếu và trẻ em. Người bị mắc bệnh là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc từ thịt động vật, gia cầm và trứng đã nhiễm Salmonella. Hiện nay mỗi nước đều có chương trình an toàn thực phẩm và khuyến cáo để phòng bệnh do Salmonella nhưng hầu như vẫn chưa loại trừ được mầm bệnh một cách triệt để [1]. Một trong những phương pháp để hạn chế sự lây lan của mầm bệnh là phải có phương pháp phát hiện nhanh, tiện lợi, chính xác để phát hiện ra nguồn gia súc, gia cầm nhiễm bệnh. Hiện nay có nhiều phương pháp phát hiện Salmonella [1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. Phương pháp được sử dụng rộng rãi là phương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát hiện sự tồn tại của kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh [1, 4, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, kháng nguyên sử dụng trong các phương pháp này đều mới là kháng nguyên toàn vẹn được tinh chế bằng phương pháp hoá học và lý học nên tính đặc
hiệu chưa cao. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi mong muốn tạo được epitope của kháng nguyên H:g,m có khả năng phát hiện đặc hiệu S. enteritidis bằng công nghệ AND tái tổ hợp. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu a, Chủng vi sinh vật - Chủng S. enteritidis ATCC13076 là chủng vi khuẩn mang nguồn gen gm1 do Viện Thú Y Trung Ương cung cấp. - Chủng E. coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, nhân và chọn dòng các plasmit. - Chủng E. coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dcm (DE3) plysS (Caml)] được sử dụng làm chủng nhận trong
thí nghiệm biến nạp với vectơ biểu hiện pET22b(+) mang gen gm1. b, Plasmit - Plasmit pCR2.1 mua của hãng Invitrogen được sử dụng làm vectơ tách dòng gen. - Plasmit pET22b(+) được sử dụng làm vectơ biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 2. Phương pháp a, Phương pháp biến nạp Tế bào E. coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bào khả biến bằng muối CaCl2 của Seidman C. E. và cộng sự [10] b, Các phản ứng cắt, nối ghép các đoạn ADN, điện di trên gel agaroza được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [11]
c, Phản ứng PCR Phản ứng làm biến tính ADN khuôn diễn ra ở 940C trong 2 phút sau đó được tiếp theo với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bước: bước 1: biến tính sợi ADN khuôn ở 940C trong 1 phút; bước 2: mồi kết cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng trên sợi khuôn ở 490C trong 1 phút; bước 3: tổng hợp, kéo dài chuỗi ở 720C trong 40 giây. Phản ứng kết thúc ở 720C trong 5 phút và ủ mẫu ở 40C. Hai đoạn mồi dùng để nhân gen do hãng Amersham Pharmacia Biotech tổng hợp có trình tự như sau: gm1f: TCCATggATgAAgCCAAAgCgATAgCTggT NcoI gm1r: ACTCgAggTTTTTggTTTTATCATCAAA XhoI
Hình 1: Phân tích ADN hệ gen S. enteritidis ATCC13076 trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Hệ gen S. enteritidis ATCC13076 Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn d, Tách ADN hệ gen của S. enteritidis Một khuẩn lạc của S. enteritidis được nuôi cấy lắc trong 10 ml môi trường LB ở 370C qua đêm. Sau đó tế bào được thu lại bằng ly tâm và được hoà tan vào 567 l TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH8). Mẫu tế bào được bổ sung thêm 30 l SDS 10%, 3 l proteaza K 1% và ủ ở 370C trong 1
giờ sau được bổ sung thêm 180 l NaCl 5 M và ủ ở 650C trong 10 phút. Protein của tế bào được loại bỏ bằng Chloroform. ADN hệ gen nằm ở pha trên được tủa lại bằng cồn và được hoà vào 40 l TE có bổ sung 0,4 l ARNaza1%. ADN hệ gen được bảo quản ở 40C. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Nhân gen gm1 bằng kỹ thuật PCR S. enteritidis có 3 kháng nguyên quan trọng được sử dụng để phát hiện sự có mặt của chúng trong huyết thanh là kháng nguyên O, H và kháng nguyên lông. Trong số các kháng nguyên này, kháng nguyên H và kháng nguyên lông là đặc hiệu hơn cho S. enteritidis. Kháng nguyên H của S. enteritidis chỉ có một tính đặc hiệu là H:g,m được mã hoá bởi gen fliC. Kháng nguyên H được biểu hiện thường xuyên giúp cho Salmonella vận động và kết dính vào thành ruột tạo điều kiện cho sự định khu, nhân bệnh và gây bệnh. Năm 1995, Van Asten A. J. A. M và cộng sự đã xác định được vùng gen mã hoá cho epitope của kháng nguyên H
đặc hiệu cho S. enteritidis. Epitope này là chuỗi polypeptid ngắn có trình tự axit amin từ 246-382 [2]. Trong thí nghiệm của mình, chúng tôi đặt tên cho gen mã hoá epitope đó là gm1. Để có được nguồn gen gm1, chúng tôi đã tách chiết ADN hệ gen của S. enteritidis theo như quy trình đã được mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp. ADN hệ gen sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di sản phẩm ADN được trình bày trên hình 1 cho thấy ADN hệ gen là băng sáng, kích thước lớn, không bị đứt gãy. Sau đó ADN hệ gen được pha loãng ra 200 lần để làm sợi khuôn nhân gen gm1. Cặp mồi dùng để nhân gen được thiết kế dựa trên trình tự gen fliC mã số M 84980 trên ngân hàng gen quốc tế. Với mục đích tạo được epitope của kháng nguyên tái tổ hợp hoàn chỉnh, không bị lẫn một số axit amin nằm trong vùng đa nối của vectơ pET-22b(+), chúng tôi đã thiết kế mồi đầu 5’ và 3’ có chứa thêm trình tự của enzyme hạn chế NcoI và XhoI tương ứng. Protein tái tổ hợp sẽ được tiết ra khoang chu chất của tế bào nhờ tín hiệu dẫn pelB và sẽ được tinh
sạch dễ dàng nhờ 6 axit amin Histidin ở tận cùng đầu C đã được thiết kế sẵn trên vectơ pET-22b(+).Gen gm1 được nhân lên bằng PCR theo chu trình đã được mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp. Sản phẩm của phản ứng được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza 0,8%. Kích thước gen gm1 theo tính toán dài khoảng 0,3 kb (Hình 2). Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn
Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng EcoRI trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn
Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang gen gm1
2. Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1 Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh S. enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E. coli BL21 vì E. coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nhau nên E. coli có thể tổng hợp được protein có cấu trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong Salmonella. Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng pCR2.1. Sản phẩm lai được biến nạp vào E. coli DH5. Plasmit trong thể biến nạp E. coli DH5 được tách và được cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI. Theo tính toán, nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3). Các plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI. Đoạn gen có kích thước 0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza. Sản phẩm nối
được biến nạp vào tế bào E. coli BL21. Sau khi kiểm tra các dòng plasmit trong các thể biến nạp E. coli BL21, chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 như mong muốn. Plasmit này được đặt tên là pETgm1. Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình bày ở hình 4. 3. Biểu hiện gen gm1 Các dòng E. coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1 được nuôi cấy qua đêm ở 37 0C trong 2ml môi trường LB có chứa 100g/ml ampicilin. Sau đó tế bào được hoà loãng vào môi trường LB có ampicillin đến OD600  0,1 và nuôi cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để OD600 đạt 0,5 đến 0,8. Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp. Đây là nhiệt độ thuận lợi để E. coli hình thành cấu trúc đúng của protein. Sau 6 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng đệm xử lý mẫu. Protein tổng số được kiểm tra trên gel acrylamit 13,3%. Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E.
coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình 5). Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E. coli BL21 trên gel acrylamit 13,3% Đường chạy 1-5: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG Đường chạy 6: Protein chuẩn Đường chạy 7: E. coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG Đường chạy 8: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong điều kiện không cảm ứng
Hình 2: Phân tích sản phẩm PCR nhân gen gm1 trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Sản phẩm PCR Đường chạy2: Thang ADN chuẩn
Hình 3: Phân tích sản phẩm cắt các dòng pCRgm1 bằng EcoRI trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1-3: Các dòng pCRgm1 cắt bằng EcoRI Đường chạy 4: Thang ADN chuẩn
Hình 4: Sơ đồ thiết kế vectơ biểu hiện pET22b(+) mang gen gm1 2. Thiết kế vectơ biểu hiện pETgm1 Với mục đích thu được lượng lớn epitope của kháng nguyên H:g,m tái tổ hợp để tạo kit ELISA phát hiện nhanh S. enteritidis, chúng tôi đã chọn chủng biểu hiện là E. coli BL21 vì E. coli và Salmonella có đặc điểm di truyền gần giống nhau nên E. coli có thể tổng hợp được protein có cấu trúc tương tự với cấu trúc nguyên thủy của nó trong Salmonella. Đoạn gen gm1 sau khi được nhân lên bằng PCR sử dụng Taq polymerase sẽ được nối trực tiếp với vectơ tách dòng pCR2.1. Sản phẩm lai được biến nạp vào E. coli DH5. Plasmit trong thể biến nạp E. coli DH5 được tách và được cắt kiểm tra bằng enzyme hạn chế EcoRI. Theo tính toán,
nếu vectơ pCR2.1 đã mang gen gm1 thì khi cắt bằng EcoRI sẽ cho ra đoạn gen có kích thước 0,3 kb (Hình3). Các plasmit này được đặt tên là pCRgm1.Để đưa gen gm1 vào vectơ biểu hiện pET22b(+), chúng tôi đã tiến hành cắt vectơ pCRgm1 bằng NcoI và XhoI. Đoạn gen có kích thước 0,3 kb được tinh sạch lại từ gel agarose 0,8% và được nối vào vectơ pET-22b(+) bằng ADN ligaza. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli BL21. Sau khi kiểm tra các dòng plasmit trong các thể biến nạp E. coli BL21, chúng tôi đã chọn được các dòng pET22b(+) mang đoạn gen gm1 như mong muốn. Plasmit này được đặt tên là pETgm1. Toàn bộ sơ đồ thiết kế vectơ pETgm1 được trình bày ở hình 4. 3. Biểu hiện gen gm1 Các dòng E. coli BL21 tái tổ hợp mang plasmit pETgm1 được nuôi cấy qua đêm ở 37 0C trong 2ml môi trường LB có chứa 100g/ml ampicilin. Sau đó tế bào được hoà loãng vào môi trường LB có ampicillin đến OD600  0,1 và nuôi cấy lắc ở cùng điều kiện trong khoảng thời gian 2 giờ để
OD600 đạt 0,5 đến 0,8. Bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM và chuyển sang cấy lắc ở 280C để cảm ứng tế bào tổng hợp protein tái tổ hợp. Đây là nhiệt độ thuận lợi để E. coli hình thành cấu trúc đúng của protein. Sau 6 giờ nuôi cấy cảm ứng, tế bào được thu lại và được phá bằng đệm xử lý mẫu. Protein tổng số được kiểm tra trên gel acrylamit 13,3%. Kết quả cho thấy tất cả thể biến nạp E. coli BL21 đều tổng hợp băng protein lạ có kích thước khoảng 10 kDa tương đương với kích thước của gm1 (Hình 5). Hình 5: Phân tích protein của các thể biến nạp E. coli BL21 trên gel acrylamit 13,3% Đường chạy 1-5: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy
trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG Đường chạy 6: Protein chuẩn Đường chạy 7: E. coli BL21 mang pET22b(+) nuôi cấy trong điều kiện cảm ứng bằng 1 mM IPTG Đường chạy 8: E. coli BL21 mang pETgm1 nuôi cấy trong điều kiện không cảm ứng