BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM"

Chia sẻ: Linh Ha | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:20

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM"

PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng Viện Công nghệ Sinh học. Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992, Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in). Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer ( 2000) đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩn đã được xác định trình tự nucleotid. Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ được trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-ARN ribosom (16S-ARNr). I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vi sinh vật:
Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây lúa ở Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối kháng F. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coli DH5 đã được sử dụng. 2. Các phương pháp phân loại: a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình: Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API 20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theo nhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loại các nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, không thuộc Họ Enterobactieraceae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE, các đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin đã được xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được tiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi trường LB rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu được ủ ở 30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ
ủ. Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theo phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclin lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm đối chứng. Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ. b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen: -Thu ADN tổng số: ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson và cộng sự (1985). -Thu nhận gen 16S-ARNr: Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận chiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứng với các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli;
mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,, tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset- Oligos Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịch ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADN được biến tính ở 95o C trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biến tính ở 940 C trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt độ 520 C và phản ứng kéo dài chuỗi ở 720 C trong 1 phút 20 giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ bản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến tính một lần ngay ở nhiệt độ 940 C trong 1 phút, tiếp sau pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72 0 C trong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 40 C. Kết quả phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8%. Sản phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1 theo chỉ dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen. Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào
dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và RUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI. 3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotit và xử lý số liệu: Chuỗi ADN chứa gen 16S- ARNr và nột phần plasmid được giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer). Mồi xuôi M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) và mồi ngược M13R (5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng trong giải trình tự là các chuỗi cố định của vectơ và nằm gần hai đầu biên của ADN tái tổ hợp cần giải trình. Trong quá trình giải trình, một mồi khác ký hiệu là Seq16SF (5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’ của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu khoảng 300-320 nucleotit đã được thiết kế bởi máy không có khả năng đọc
một lần hết chiều dài chuỗi. Giải trình được thực hiện nhiều lần với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được kết quả chính xác. Chuỗi được xứ lý nucleotit bằng chương trình SeqEd1.0.3; sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5 (Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua chương trình BLASTn có tại (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 4. Chọn chuỗi so sánh: Các chuỗi nucleotit 16S ARNr của một số chủng có trình tự tương ứng từ Pseudomonas spp. tại Ngân hàng Gen được thu nhận bằng cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số thư mục ngân hàng và được sử dụng để so sánh đối chiếu với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1).
Bảng 1 Các chủng Pseudomonas spp. được dùng để so sánh 5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dòng hoá sản phẩm và một phần phân tích số liệu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng máy, Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Công việc giải trình trình tự và xử lý số liệu giám định phân tử được tiến hành tại Viện nghiên cứu Y học Queensland (Australia). II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Phân loại theo kiểu hình: Như đã nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn được chuẩn hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ Enterobacteriaceae. Kết quả phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ bản, chủng này cho kết quả âm tính với khử nitrat, tạo indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp - galactosidase; và cho 3 kết quả dương tính là lên men glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase. Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1 không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat, citrat và phenol-axetat. Với những kết quả như vậy, chủng Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng chỉ số Analytical Profile Index, 5th edition, BioMerieux S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn, chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc
giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ số ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch. violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết quả xác định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy, chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni (1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang (Gould và cộng sự, 1985). Chính vì vậy, đến đây có thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng Chromobacterium. 2. Phân loại theo kiểu gen: Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 đã được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen PCR; trình tự của nó cũng đã được xác định và đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với
số thư mục AF521651. Một phần của kết quả giám định chủng Ps7-1 bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua chương trình BLASTn cho thấy chủng Ps7-1 có đọ tương đồng cao nhất với 332 chủng thuộc Pseudomonas và một phần kết quả này được trình bày trong bảng 2. Bảng 2 Mức độ tương đồng trình tự nucleotid gen 16S- ARNr của chủng Ps7-1 với một số chủng Pseudomonas spp.
Căn cứ vào các kết quả giám định nhận được từ ngân hàng gen có thể khẳng định rằng chủng Ps7-1 là một chủng thuộc Chi Pseudomonas, bởi sự so sánh chuỗi trình tự nucleotid của gen 16S-rARN từ chủng này với trình tự từ các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen cho giá trị tin cậy cao nhất thuộc về các chủng của Chi Pseudomonas. Để làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của chủng Ps7-1, mối quan hệ di truyền của chủng này được xác định dựa trên sự thiết lập cây phả hệ với một số chủng Pseudomonas đặc trưng bằng hệ chương trình máy tính MEGA 2.1 ( Hình 1 ). Hình 1: Cây phả hệ ( không có rễ ) của các chủng Pseudomonas được thiết lập theo chương trình MEGA 2.1. Pficu: P. ficuserectae JCM 2400T, Psyr+gly: P. syringae pv glycinea MAFF 302260,
Pmeli: P. meliae MAFF 301463T, Psyr+pha: P. syringae pv. phaseolicola MAFF 302282, Pchlor: P. chlororaphis DSM 50083T, Pcost: P. costantinii CFBP 5705, Pman: P. mandelii CIP 105273, PfluoATCC: P. fluorescens ATCC 17386, Pfluor: P. fluorescens CHAO. Cây phả hệ cho thấy, chủng Ps7-1 cùng với 2 chủng P. fluorescent lập nên một nhóm riêng, trong khi đó giữa các chủng còn lại thuộc các loài Pseudomonas khác đều cho những khoảng cách nhất định. Điều này nói lên rằng chủng Ps7-1 có họ hàng gẫn gũi nhất vỡi loài P. fluorescent. Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống API 20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết quả phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE, nhưng theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì chủng này thuộc loài P. putida (99%) (Lottmann và cộng sự
, 2000). Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ loài, không xẩy ra ở định loại chi. Nhưng, như đã nêu, trong trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API 20NE cho kết quả cách biệt khá lớn, nếu không nói hoàn toàn khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr, mặc dù theo nhà cung cấp dịch vụ API 20NE, các chủng thuộc Chi Pseudomonas là một trong nhũng đối tượng phù hợp của hệ thống xác định được chuẩn hoá này. Tóm lại, cùng với những đặc tính phân lập có chọn lọc, hiếu khí bắt buộc và kháng tetraxyclin, kết quả phân tích trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr cho thấy chủng Ps7-1 là một chủng Pseudomonas, chứ không thuộc chi Chromobacterium và có quan hệ họ hàng gần nhất với loài P. fluorescens, cùng các chủng P. fluorescens ATCC 17386 và chủng P. fluorescens CHAO lập nên một nhóm riêng. Công trình này được tài trợ bởi Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và hỗ trợ bởi Hội đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học Công nghệ & Môi
trường, tài khóa 2002. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H. and Oyaizu,H. (2000). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1563-1589.. 2. Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M. and Smalla, K., 2000. Successful strategy for the selection of new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137. 3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D., Pienta,P.A. and Gillevet, P.M. (Chưa công bố). 4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M. Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration and recovery of fluorescent Pseudomonads from Various Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32. 5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus Azospirillum. In: Krieg, N.R.,
& Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin Co., Baltimore. 6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering, K., Wackernagel, W., Smalla, K., Berg, G., 2000. Establishment of introduced antagonistic bacteria in the rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on the bacterial community. EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49. 7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of Bacteria beyond the 16S-rRNA Standerd. Vermicon. http:w.w.w. ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm 8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985. Conservation of symbiotic nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol., 163, 2-25. 9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C., Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De
Wachter,R. and Timmis,K.N.(1996). Syst. Appl. Microbiol. 19, 478-492. 10. Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J.-M., Christen,R. and Gardan,L. (2002). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. đang in. 11. Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh, 2000. Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu khí khu trú trong rễ lúa ở một số địa điểm thuộc đồng bằng sông Hồng. Tuyển tập Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong sinh học. Hội Nghị Sinh học quốc gia, Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia Hà Nội. 12. Norberto, J. and Palleroni, 1984. Genus Pseudomonas. In: Krieg, N.R. & Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The Williams and Wilkin, Co., Baltimore. 13. O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens. Microbiol. Rev., 56, 662-672
14. Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y. and Defa go, G. (2001). Mol. Plant Microbe Interact. 14 (5), 639-652 15. Sawada, H. (1997). Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen 16. Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D. and Leclerc,H. (1999). Syst. Appl. Microbiol. 22, 45-58 17. Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev., 51, 221-271 SUMMARY TAXONOMICAL POSITION OF THE ISOLATE PS7- 1 CAPABLE OF ANTAGONISM AGAINST FUSARIUM OXYSPORUM BASED ON THE ANALYSIS OF THE 16S-rRNA GENE NUCLEOTIDE SEQUENCE. NGUYEN THI TUYET NHUNG et al To establishing the taxonomical position of the bacterial strain Ps7-1 which was isolated from the rice rhizosphere soil in Kim Chung, Dong Anh, Ha Noi on the selective
medium for fluorescent pseudomonad bacteria, being gram -negative and possessed the great capable of antagonism to the fungal phytopathogene F. oxysporum , the different methods have been used. By the API 20NE system – a phenotypically standardized micromethod combining 8 conventional tests and 12 assimilation tests for identification of non-fastidious Gram-negative rods not belong to the Enterobacteraceae, the train Ps7-1 was positioned with the code number 4156534 which does not be present in the catalog, nevertheles with a such code number it also could be thought that this strain may be belong to the group Chromobacterium. The genotypical classification method based on the nucleotide sequence of 16s-rRNA gene has been applied to grouping the strain Ps7-1. The 16S-rRNA gene from Ps7-1 has been obtained by Polymerase Chain Reaction with primers Prf: 5,- GAGTTTGATCATGGCTAA-3 and Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3, cloned in Vector pCR2.1and automatically sequenced by ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer); to sequencing 3 used primers are M13F 5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’, M13R
5’CAGGAAACAGCTATGAC3’ and Seq16SF 5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3'. The nucleotide sequence of the 16s-rRNA gene from Ps7-1 has been checked by the program SeqEd1.0.3 and registered in GenBank with the accession number AF521651. This sequence has been aligned with the registered sequences at Genbank. Results of analyses showed that the isolate Ps7-1 possesses the highest homology with the P. fluorescens (99%). Based on the nucleotid sequences of the 16s-rRNA gene from the choosen strains of the known Pseudomonas species, a dendogram was presented. Ps7-1 and the strains P. fluorescens ATCC 17386 P. fluorescens CHAO built a common group. Additionally, the isolate Ps7-1 is the strictly aerobic one and resistant to tetracycline; those are the main characteristics of genus Pseudomonas. With such results it may be concluded that the Ps7-1 strain belongs to P. fluorescens. Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Trương Nam Hải.