Báo cáo " Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau của thân và hạt cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.) "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ các phần khác nhau của thân, hạt cây tô mộc (C.sappan) đến hoạt độ của một số proteinase. Các kết quả nghiên cứu cho thấy: Dịch chiết từ phần vỏ cũng như phần gỗ thân cây C. sappan đều có hoạt tính ức chế trypsin (TIA) và hoạt tính ức chế chymotrypsin (ChIA). TIA , ChIA của phần gỗ và lõi gỗ theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU và 22,44 IU/100 gam nguyên liệu ; TIA , ChIA của phần vỏ thân theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo " Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau của thân và hạt cây tô mộc (Caesalpinia sappan L.) "

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 Nghiên c u ñi u tra các ch t c ch proteinase các ph n khác nhau c a thân và h t cây tô m c (Caesalpinia sappan L.) Hoàng Thu Hà, Ph m Th Trân Châu* Vi n Vi sinh v t và Công ngh Sinh h c, ðHQGHN, 144 Xuân Th y, Hà N i, Vi t Nam Nh n ngày 29 tháng 10 năm 2008 Tóm t t. Công trình này nghiên c u tác d ng c a d ch chi t t các ph n khác nhau c a thân, h t cây tô m c (C.sappan) ñ n ho t ñ c a m t s proteinase. Các k t qu nghiên c u cho th y: D ch chi t t ph n v cũng như ph n g thân cây C. sappan ñ u có ho t tính c ch trypsin (TIA) và ho t tính c ch chymotrypsin (ChIA). TIA , ChIA c a ph n g và lõi g theo th t vào kho n g 6,11 IU và 22,44 IU/100 gam nguyên li u ; TIA , ChIA c a ph n v thân theo th t vào kho n g 52,45 IU và 74,94 IU/100 gam nguyên li u. D ch chi t t h t C. sappan có TIA, ChIA và ch t c ch poteinase c a P.aeruginosa (PPsIA): TIA, ChIA c a v và nhân h t không khác nhau nhi u, theo th t , vào kho ng 3000 và hơn 10000 mIU/g. Tuy nhiên, PPsIA c a v h t cao hơn nhân h t kho ng 5 l n, ñ t kho n g 1700mIU/g. Ph ñi n di TI, ChI c a d ch chi t nhân h t C. sappan tương t nhau: có ít nh t 7 băng, t p trung 2 vùng, vùng th nh t có ñ di ñ ng ñi n di (Rm) tương ñ ương v i các protein có Mr l n hơn 43kD, vùng th 2 (có ít nh t 3 băng) tương ñương v i các protein có Mr t 20-30 kD và 1 băng vào kho n g 14 kD. Các băng PPsI có Rm tương ng v i các protein có Mr l n hơn 67 kD. S c ký qua c t Sephadex G-75 ho c G-100 nh n ñư c m t ñ nh ho t ñ ng (ð2), ñ t hi u su t hơn 90%, ho t ñ riêng tăng t 3 – 4 l n. 1. M ñ u∗ nh p c a vi khu n, virus, ký sinh trùng vào cơ th ch , có tác d ng kháng viêm v.v…. Vì v y, các PI cũng là ñ i tư ng ñã và ñang ñư c Cây Caesalpinia sappan (Cs) có nhi u nghiên c u ñ phát tri n thu c [ 4], m t s ñã m t s t nh mi n núi nư c ta, g thân cây có tác ñư c thương m i hóa [5]. Nghiên c u c a d ng kháng khu n, kháng viêm, tiêu viêm, và chúng tôi v PI ñã b t ñ u t hơn 20 năm nay s d ng ñ ñi u tr m t s b nh như b nh th p [6,7], ñã phát hi n và ng d ng ñ ư c m t s PI kh p, viêm v.v… và cũng ñư c dùng làm ch t quí như các PI c a h t g c. m u [1-3]. Cho ñ n nay ñã có nhi u công trình nghiên c u thành ph n hóa h c c a g cây C. C.sappan thu c h Caesalpiniaceae, h t các sappan, nhưng chưa có công trình nào nghiên cây h này thư ng giàu PI nhưng cho ñ n nay c u các ch t c ch proteinase c a cây này. chưa tìm th y các công b v PI c a C.sappan. M t s ch t c ch proteinase (PI) cũng có tác Công trình này nghiên c u tác d ng c a d ch d ng kháng khu n, ngăn c n q uá trình xâm chi t t các ph n khác nhau c a t hân, h t C.sappan ñ n ho t ñ c a trypsin, chymotrypsin, _______ và proteinase tách t Pseudomonas aeruginosa; ∗ Tác gi liên h . ð T: 84-4-37547638. E-mail: chauptt@vnu.edu.vn 261
262 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 - Phương pháp nghiên c u s p hân b , ñi u ki n tách và tinh s ch sơ b các ch t c ch proteinase t h t c a + Xác ñ nh protein theo phương pháp chúng Bradford [8], dùng albumin huy t thanh bò làm chu n, ño ñ h p th bư c sóng 595nm. + Xác ñ nh ho t ñ c ch trypsin (TIA), 2. Nguyên li u và phương pháp chymotrypsin (ChIA) theo phương pháp Anson c i ti n [9]. M i ñơn v c ch (IU) là lư ng Nguyên li u: - Q a và h t C..sappan do ch t c ch làm gi m 50% ho t ñ c a 2mg Th c sĩ Nguy n th Hòa, Trung tâm Tr ng và enzyme. ch bi n cây thu c, Vi n Dư c li u T rung ương + ði n di protein trên gel polyacrylamide cung c p (PAGE) theo phương pháp Laemmeli [10] Hoá ch t: Trypsin, Chymotrypsin, Albumin + ði n di phát hi n các băng ch t c ch : tinh khi t c a hãng Sigma. Casein c a hãng gel có cơ ch t casein, sau khi ñi n di k t t húc, Kanto chemicals co., INC, Coomasie brilliant x lý v i enzyme tương ng, v trí có ch t c blue G-250 c a hãng ICN Biomedicals, Inc ch proteinase s t o thành các băng có m u (ð c). Cao th t c a hãng Merck (ð c), Peptone ñ m trên n n gel sáng hơn. (Trung Qu c). + S c ký qua c t Sephadex G-25 (c t có kích thư c 1,1 x 55cm, cân b ng v i dung d ch vá mÒm gç acetic acid 0,005M); S ơadex G-75 (c t có kích thư c 1,3 x 79 cm, cân b ng v i dung d ch ñ m Sorensen 1/15M, pH 6,5) ; Sephadex G- 100 (c t có kích thư c 1,8 x 89cm, cân b ng v i dung d ch ñ m Sorensen 1/15M, pH 6,5), lâi rút protein cũng b ng các dung d ch cân b ng c t tương ng. + Nuôi vi khu n, tách proteinase c a P. aeruginosa như ñã mô t trư c ñây [11] 3. K t qu và th o lu n 3.1 Ho t ñ c ch trypsin (TIA) và ho t ñ c ch chymotrypsin (ChIA) c a thân cây C. sappan Tách riêng thân cây thành ba ph n: l p v (V), ph n g (G) và ph n lõi gi a (L). T l tr ng lư ng c a m i p h n V, G, và L so v i tr ng lư ng toàn thân theo th t vào kho ng 39,5, 52,0 và 8,4%. ð l a ch n dung d ch chi t rút TI và ChI , ñã s d ng các lo i dung d ch - Agar c a hãng Merk (ð c). Màng l c vô sau: dung d ch ñ m Sorensen M/15 pH 6,5, khu n Minisart 0,2 µm c a hãng Sartorius. Các dung d ch ethanol 50% và dung d ch NaCl hoá ch t khác ñ t ñ s ch phân tích. 0,9%.
263 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 B ng 1. Hàm lư ng protein, TIA, ChIA c a thân C. sappan khi s d ng các lo i dung d ch khác nhau ñ chi t rút Mu Dung d ch Protein TIA ChIA dùng ñ chi t mg/gam HðR HðR t ng s t ng s (mIU/mg protein) (mIU/gam) (mIU/gam) (mIU/mg protein) ð m Sorensen. V mm 1,46 7,11 4,85 19,00 12,95 524,50 749,40 (v thân) Ethanol 50% 26,06 20,13 28,75 NaCl 0,9% 0,94 11,18 11,92 20,80 22,17 ð m Sorensen. 0,81 1,97 2,44 14,85 18,35 19,45 50,05 G Ethanol 50% 3,67 5,30 13,63 NaCl 0,9% 0,68 27,53 0,00 0,00 0,00 ð m Sorensen. 2,20 14,27 6,50 29,20 13,30 41,62 174,37 Lõi Ethanol 50% 12,15 3,42 14,35 NaCl 0,9% 0,45 12,71 28,24 0 0 mIU mIU mg 1200 30000 25000 1000 25000 20000 20000 800 15000 15000 600 10000 10000 400 5000 S3 200 S3 5000 S3 S2 S2 0 0 S2 S1 0 S1 1 1 S1 2 1 2 3 2 3 3 Hình 1. TIA (a), ChIA (b), Protein (c), tính theo t l % tr ng lư ng m i ph n so v i toàn thân. 1. V ; 2. g ; 3. Lõi. S1: chi t b ng NaCl 0,9% ; S2: chi t b ng ñ m Sorensen 1/15M ; S3: chi t b ng ethanol 50%. B ng 2. Protein, TIA, ChIA c a m i ph n tính trên 100g thân (theo t l % tr ng lư ng c a m i ph n so v i toàn thân (100g thân có 39,5 g v m m; 52,0 g g và 8,5 g lõi) Dung d ch dùng ñ HðR Ch tiêu V mm G Lõi Tính t ng s phân tích chi t rút các ph n c a (mIU/mg 100 g thân protein) ð m Sorensen 57,97 47,36 18,50 123,83 1029,89 191,02 102,18 Protein Etanol 50% 1232,09 (mg) NaCl 0,9% 37,15 35,39 3,78 76,32 ð m Sorensen 208,98 102,53 102,01 413,52 3,34 20728,24 1012,37 350,02 TIA Etanol 50% 22090,63 17,93 (mIU ) NaCl 0,9% 441,83 0 106,89 548,72 7,19 ð m Sorensen 750,88 772,94 244,06 1767,88 14,28 29616,28 2605,10 1466,45 ChIA Etanol 50% 33687,83 27,34 (mIU) NaCl 0,9% 822,02 0 0 822,02 10,77
264 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 K t q u trên b ng 1 cho th y TIA và ChIA ChIA trong d ch chi t ethanol 50% c a V, G cũng như L luôn cao hơn các d ch chi t khác. T 100% s li u b ng 1 có th tính ñ ư c d ch chi t 80% ethanol c a 100g v thân có TIA , ChIA theo loi 60% th t vào kho ng 52,45 IU và 74,94 IU; TIA, go ChIA c a ph n g th p nh t, n u tính t ng 40% vo mem TIA, ChIA c a c g và lõi, theo th t vào 20% kho ng 6,11 IU và 22,44 IU/100gam, th p hơn 0% demsor ensen NaCl 0,9% Ethanol 50% các giá tr tương ng c a v m m kho ng 8,5 và hơn 3 l n. K t q u này cũng cho th y: ChIA b) luôn cao hơn TIA, gi ng như k t q a nghiên c u trư c ñây c a chúng tôi ñ i v i nhi u cây protein thu c khác [12]. D a vào t l tr ng lư ng c a m i p h n V, 100% G, L so v i tr ng lư ng toàn thân ñ tính 80% protein, TIA, ChIA có trong 100 g thân, cũng loi 60% cho th y: protein, TIA và ChIA trong DC go 40% ethanol c a ph n v thân (V) v n cao hơn các vo mem 20% ph n khác, m c dù nó ch chi m 39,5% tr ng lư ng c a thân (b ng 2, hình 1). Do ñó, TIA, 0% dem sorensen NaCl 0,9% Ethanol 50% ChIA c a ph n v luôn chi m t l % khá cao c a t ng TIA ho c ChIA c a thân, trong d ch c) chi t ethanol ho c NaCl có th chi m ñ n hơn 80% (hình 2) Hình 2. TIA (a), ChIA (b), Protein (c) tính theo % c a t ng protein ho c TIA ho c ChIA c a toàn thân khi chi t b ng các dung d ch khác nhau. TIA Tóm l i, ta th y p h n v thân (V) có hàm 100% lư ng protein, ho t ñ c ch trypsin (TIA), c 80% ch chymotrypsin (ChIA) cao hơn h n các ph n khác c a thân. ði u này có th vì ph n V có loi 60% go ch a m ch libe nên gi u các ch t hơn so v i 40% vo mem ph n g cây. Trypsin và chymotrypsin là các 20% proteinase có trong h tiêu hoá c a nhi u ñ ng 0% v t, TIA và ChIA trong ph n V c a cây cao dem sorensen NaCl 0,9% Ethanol 50% cũng có th là ñ th c hi n ch c năng b o v cây. a)
265 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 3.2. Ho t ñ c ch proteinase (PIA) c a v và nghiên c u và l a ch n ñư c h t giai ño n có nhân h t chín. PIA cao, g i là h t chín. S p hân b TIA các ph n c a h t cũng không ñ ng ñ u, vì v y Các k t q u nghiên c u trư c ñây c a chúng tôi ñã tách riêng v h t, nhân h t chín và chúng tôi h t các cây h bí [6] cho th y h t xác ñ nh ho t ñ c ch proteinase (PIA) m i càng già TIA càng cao, ngay c giai ño n m t ph n. nư c (desiccation), vì v y, chúng tôi cũng ñã B ng 3. Hàm lư ng protein, ho t ñ c ch proteinase (PIA) c a v và nhân h t C.sappan chín V ht Nhân h t Ch tiêu Tính theo Tính theo tr ng Tính theo Tính theo tr ng Phân tích tr ng lư ng lư ng khô tr ng lư ng lư ng khô tươi tươi Ch t khô (%) 79,1 67,96 Protein (mg/gam) 5,18 7,81 8,20 12,06 1709,00 312,60 PPsIA (mIU/gam) 2160,55 459,97 TIA (mIU/gam) 2861,10 3617,06 3020,00 4443,79 ChIA (mIU/gam) 11.453,60 14479,90 10498,05 15447,39 K t q u b ng 3 cho th y TIA và ChIA c a Pseudomonas aeruginasa và Staphylococcus v và nhân h t cao hơn TIA, ChIA c a v thân aureus 5 (phân l p t m v t t hương). Tuy kho ng 5 ñ n 14 l n. So sánh gi a v và nhân nhiên khi ñi n di DC v h t ñã không phát hi n ñư c băng protein ho c b ăng PI nào. Có th h t, ta th y T IA và ChIA khác nhau không nhi u, nhưng ho t ñ c ch proteinase PIA c a DC v ch y u là do nh ng ch t phân t th p, không ph i protein? V n ñ này ñang Pseudomonas aeruginosa (PPsIA) c a DC v h t cao g p hơn 5 l n PPsIA c a DC nhân h t. ñư c ti p t c nghiên c u. Các thí nghi m ti p trong công trình này ch s d ng nhân h t. Th ho t tính kháng khu n (hình 3) cho th y DC v h t có tác d ng c ch sinh trư ng Hình 3. Ho t tính kháng khu n c a d ch chi t v h t (a): S. aureus ; (b) P. aeruginosa.
266 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 3.3. Thăm dò ñi u ki n chi t rút các ch t c (di ñ ng ch m) có nhi u hơn so v i 2 dung d ch còn l i. ði u này là do pH th p (4,5) m t s ch trypsin (TI), c ch chymotrypsin (ChI) t protein phân t l n có th ñã b k t t a. h t C. sappan. ð l a chon dung d ch thích h p chi t rút các ch t c ch chúng tôi ñã s d ng 4 S d ng phương pháp PAGE ñ ng trùng dung d ch thư ng dùng là: nư c Mili Q, ñ m h p v i cơ ch t casein 0,1% là phương pháp Sorensen 1/15M pH 6,5, dung d ch acetic acid nh y, cho phép phát hi n tr c ti p m t cách ñ y 0,005M, dung d ch ñ m natri acetate 0,02M pH ñ các TI/ChI t m t lư ng r t ít d ch chi t thô 4,5. (
267 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 3.4. Tách các PI c a h t C. sappan b ng phương pháp s c ký qua c t Sephadex OD 2,5 OD OD750nm 5 5 2 4 4 1,5 3 3 2 1 2 1 0,5 1 0 0 ml 0 1 4 7 10 13 16 19 ml 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 (a) (b) (c) Hình 5. S c ký qua c t Sephadex - G25 (a), Sephadex -G75 (b) ; Sephadex-G100 (c) —ο— : protein (OD 595nm/ml) ; — —: TIA (OD750nm/ml) ; —▲—: ChIA (OD750nm/ml) (Ghi chú: tr c hoành: th tích rút (ml), hình (a) : th tích rút chưa k 20ml ban ñ u). TIA và ChIA ñ u cao, ñ s ch tăng lên hơn 3 K t q u trên hình 5 cho th y khi s c ký DC nhân h t q ua các c t Sephadex ñ u nh n ñư c 2 l n (b ng 4). T b ng tóm t t k t qu s c ký ñ nh protein, nhưng v i c t Sephadex G-25 c 2 qua các c t Sephadex khác nhau (b ng 4) cho ñ nh ñ u có TIA, ChIA, nhưng hi u su t thu h i th y ñ tinh s ch sơ b các TI,ChI t h t C. th p (b ng 4). S c ký ñ q ua c t Sephadex G- sappan có th s d ng c t Sephadex G-75 ho c G-100. ð nh 2 thu ñư c t các c t này ñang 75 và G-100 khá gi ng nhau: TIA, ChIA t p ñư c nghiên c u ti p. trung vào ñ nh protein th 2 (ð2), hi u su t B ng 4. Tóm t t k t qu s c ký qua các c t Sephadex khác nhau M u: sau khi s c TIA ChIA ký qua c t Sephadex Hi usu t (%) ð s ch (l n) Hi u su t (%) ð s ch (l n) so v i DC so v i DC ð nh 1 G-25 : 71,66 0,99 55,20 0,62 ð nh 2 48,30 5,78 31,00 4,67 ð nh 2 G-75 104,00 4,79 76,97 3,54 ð nh 2 G-100 93,50 3,49 82,5 3,08 Ph ñi n di protein, TI/ChI c a ñ nh ð2 c a ch t (hình 6d). K t q u này gi ng v i k t qu c t Sephadex G-75 và G-100 cũng t ương t nh n ñư c khi ñi n di ñ nh 1 và ñ nh 2 c a c t nhau (hình 6). ð nh protein th nh t (ð1) tuy Sephadex G-25 (hình 7). Các băng PPsI có ñ không xác ñ nh ñ ư c PIA b ng phương pháp di ñ ng ch m, tương ng v i các protein có kh i lư ng phân t l n hơn 67 kD. Anson c i ti n nhưng ñã phát hi n ñ ư c băng PPsI khi s d ng phương pháp PAGE có cơ
268 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 (a) (b) (c) (d) 1 2 1 2 1 2 1 2 Hình 6. Ph ñi n di các ñ nh protein nh n ñư c sau khi s c ký DC h t C. sappan qua c t Sephadex G-75/G100 (1. ð nh 1 ; 2. ð nh 2). (a): protein ; (b): TIA ; (c): ChIA ; (d): c ch PA c a P. aeruginosa 1 2 3 4 kD 1 2 3 1 2 3 1 (-) 2 94.0 3 67.0 43.0 4 30.0 5 6 20.1 7 14.4 (a) (c) (b) Hình 7. Ph ñi n di c a m u h t C.sappan trư c và sau khi qua c t Sephadex G-25. (a): protein ; (b): TI /ChI ; (c): ch t c ch PA c a P. aeruginosa 1: DC lên c t ; 2: ð nh 1 ; 3: ð nh 2 ; 4: protein chu n (14,4 – 94kD) 4. K t lu n 2) D ch chi t t h t C. sappan có TIA, ChIA và ch t c ch p oteinase c a 1) D ch chi t t ph n v cũng như ph n g P.aeruginosa (PPsIA). PPsIA c a v h t ñ t thân cây C. sappan ñ u có ho t tính c ch kho ng 1700mIU/g, cao hơn nhân h t kho ng 5 trypsin (TIA) và ho t tính c ch chymotrypsin l n; tuy nhiên TIA, ChIA c a chúng l i không (ChIA). S d ng dung d ch ethanol 50% ñ khác nhau nhi u, theo th t , vào kho ng 3000 chi t rút các ch t c ch ñ t ñ ư c ho t ñ cao và hơn 10000 mIU/ g. nh t: TIA , ChIA c a ph n g và lõi g theo 3) Ph ñi n di TI, ChI c a d ch chi t h t C. th t vào kho ng 6,11 IU và 22,44 IU/100 gam nguyên li u ; TIA , ChIA c a p h n v sappan tương t nhau: có ít nh t 7 băng, t p theo th t vào kho ng 52,45 IU và 74,94 trung 2 vùng, vùng th nh t có ñ di ñ ng IU/100 gam nguyên li u. D ch chi t v h t có ñi n di (Rm) tương ñ ương v i các protein có tác d ng c ch sinh tr ư ng S. aureus và P. Mr l n hơn 43kD, vùng th 2 (có ít nh t 3 aeruginosa. băng) tương ñ ương v i các protein có Mr t 20-
269 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 design of EETI and MCoTI, Proceeding of the 30 kD và 1 băng vào kho ng 14 kD. Các băng 4th International Seminar of Asian Network of PPsI có Rm tương ng v i các protein có Mr Research on antidiabetic plants (ANRAP), l n hơn 67 kD. January 16-18, Kolkata, India, Mukherjee & 4) S c ký qua c t Sephadex G-75 ho c G- Dubnath, eds; Tata McGraw-Hill Publishing Company Ltd, New Delhi. (2005) 81. 100 nh n ñ ư c m t ñ nh ho t ñ ng (ð2) ñ t [5] Protein drug delivery: Penetrating a growth hi u su t hơn 90%, ho t ñ riêng tăng t 3 – 4 marker, Datamonitor 7/3/2005 l n. Vì v y có th s d ng các lo i Sephadex [6] Ph m th Trân Châu, Trypsin inhibitors of white này ñ bư c ñ u tinh s ch các TI/ChI t h t bush (Cucurbita pepo var.patissonina) fruits and C. Sappan. seeds (in English, 110 pages), Acta Universtatis N0 912. * Wydaw. Univ. Wratislaviensis Wroclawskiego, Wroclaw 1987. * * [7] Pham thi Tran Chau, Concise report on study of Công trình ñư c s h tr v kinh phí c a proteinase inhibitors in Viet nam, Proceeding of The 2nd International Conference on the chương trình NCCB- Khoa h c S s ng, development of Biomedical engineering in Viet ð tài 621306. nam, July 25th - 27th, Hanoi, (2007) 196. [8] M.M.Bradford, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of Tài li u tham kh o protein utilizing the principle of protein – dye biding. Anal. Biochem. 72 (1976) 248. [1] ð Huy Bích, ð.Q. Chung, B.X. Chương, N.T. [9] J.S. Pietrowa, M.M. Wincjunajte, Opredelenie Dong, ð.T. ðàm, P.V. Hi n, V.N. L , P. D. Mai, proteolyticheskoi aktivnosti fermentnykh P.K. Mãn, ð. T. Nhu, N. T p, T. Toàn, Cây preparatov microbiologicheskovo proiskhozhdenie. thu c và ñ ng v t làm thu c Vi t Nam, t p I I, Priklad. Biochem. Mikrobiol., 2 (1966) 232. NXB Khoa h c và K thu t, Hà N i, 2004. [10] U.K. Laemmli, Cleavage of structure proteins [2] M.T. Nguyen, S. Awale, Y.Tezyka, Ql. Tran, during assembly of the head of bacteriophage Kadota, Xanthine oxidase inhibitors from the T4. Nature, 227 (1970) 341. heartwood of Vietnamese Caesalpinia sappan. [11] Hoàng Thu Hà, Ph m th Trân Châu. M t s Chem. Pharm. Bull (Tokyo), 53, 8 (2005) 984. thành ph n hóa sinh và ho t tính sinh h c c a [3] Shrishailappa Badami, Sudheer Moorkth and d ch ép t t h t qu mư p ñ ng (Momordica Suresh Caesalpinia sappan – A medicinal and charantia L.), T p chí Sinh h c, 28, 1 (2006) 75. dye yielding plant. Natural Product Radiance 3 [12] Ph m Th Trân Châu, Hoàng Thu Hà, Nguy n (2004) 75. th Hòa, Ph m H ng Minh, Proteinase và ho t [4] Dung Le Nguyen, A. Heitz, L. Chiche, J-F ñ c ch proteinase c a m t s cây thu c ch a Hernandez, T. H. Phan, Tran-Chau Pham: b nh m n nh t - m n ng a - l l oét - b nh da, Microproteins from Cucurbitaceae with T p chí Dư c li u, 13 (2008) 30. potential therapeutic applications: Molecular Investigation of proteinase inhibitors from Caesalpinia sappan L. wood and seeds Hoang Thu Ha, Pham Thi Tran Chau Institute of Microbiology and Biotechnology, VNU, 144 Xuan Thuy, Hanoi, Vietnam Caesalpina sappan wood is widely used in oriental medicine. In Vietnamese traditional medicine it has been used for treatment of rheumatism, inflammatory, infection and other disease. There have
270 H .T. Hà, P.T.T. Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ 24 (2008) 261-270 been many papers about chemical compositions of C. sappan wood but none of them related to proteinase inhibitors (PIs). As is known, PIs play an important role in regulation of different living processes and they are good candidates for development of new drugs. C.sappan belongs to Caesalpiaceae plant family, and the seeds of this plant family is known as a PIs-rich source. However, so far, no publication related to PIs from C. sappan seeds has been found. The aim of this work is to determine the effect of wood and seeds extracts on the activity of trypsin, chymotrypsin, proteinases isolated from P. aeruginosa and to study the conditions to partly purify the proteinase inhibitors coming from C. sappan seeds. The results obtained have indicated that: C. sappan bark and heartwood extracts exhibit inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin. The trypsin inhibitory activity (TIA) and chymotrypsin inhibitory activity (ChIA) in 50% aqueous extract from bark are found to be 52.45 IU and 74.94 IU/100g, respectively, while those from heartwood are only 6.11 IU and 22.44 IU/100g, respectively.. C. sappan dormant seeds extract possesses TIA, ChIA as well as inhibitors against P. aeruginosa proteolytic enzymes (PPsIA). The PPsIA of seed coats is around 170IU/100g, that is 5 times higher than that of coat-free seeds. The use of 1/15M, pH 6,5 Sorensen buffer allows us to extract, at a high level, both TI and ChI. The TIA and ChIA of coat-free seeds (c-f-s) reach a level around 302 IU and 1049 IU/100g. The electrophoretic patterns of TI and ChI from c-f-s extract are very similar: 7 inhibitor bands were detected on the gel. These bands are located in two zones: the first one (at least 3 bands) corresponds to proteins of Mr higher than 43 kD and the other one (with 3 bands) to proteins with Mr from 20 – 30 kD; another band is equivalent to 14 kD. The PPsI bands zone is corresponding to protein bands of Mr higher than 67kD. Fractionation of c-f-s extract on Sephadex G-75 or G-100 column, one active peak (D2) has been obtained. The inhibitory activity yield of D2 is more than 90% of extract and their specific activities increase from 3 to 4 times. Thus, it has been suggested that the column chromatography on Sephadex G-75 or G-100 gel can be used at the first step for purification of TI/ChI from C. sappan seeds.