Biệt hóa tế bào gốc trung mô tuỷ xương thỏ thành dạng tạo cốt bào trong môi trường Dexamethasone và Ascorbic

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> BIỆT HOÁ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TUỶ XƢƠNG THỎ<br /> THÀNH DẠNG TẠO CỐT BÀO TRONG MÔI TRƢỜNG<br /> DEXAMETHASONE VÀ ASCORBIC<br /> Lê Thị Hồng Nhung*; Ngô Duy Thìn*; Nguyễn Khang Sơn*<br /> TÓM TẮT<br /> 15 mẫu tế bào đơn nhân tủy xương thỏ nuôi cấy tăng sinh 14 ngày. Sau khi định danh bằng<br /> kỹ thuật hoá mô miễn dịch với các marker CD44, CD90, CD34, CD14 xác định là tế bào gốc<br /> trung mô (TBGTM), được đưa vào môi trường cảm ứng tạo xương có dexamethasone 1 µM và<br /> ascorbic 50 µg/ml trong thời gian 3 tuần. Kết quả: tất cả các mẫu tế bào nhuộm hóa mô đều có<br /> hiện tượng tạo canxi trong chất nền (dương tính khi nhuộm alirazin red). Quan sát các mẫu<br /> dưới kính hiển vi điện tử quét thấy xuất hiện tinh thể khoáng. Mẫu tế bào nhuộm hóa mô miễn<br /> dịch dương tính với marker osteocalcin. Kết luận: đ biệt hoá thành công TBGTM tủy xương<br /> thỏ thành tế bào dạng tạo cốt bào trong môi trường có dexamethasone và ascorbic.<br /> * Từ khóa: Tế bào trung mô; Tạo cốt bào; Biệt hóa; Dexamethasone; Ascorbic.<br /> <br /> Diffrentiation of Bone Marrow Mensenchymal Stem Cell into Osteoblast<br /> in Dexamethasone and Ascorbic Culture<br /> Summary<br /> 15 samples rabbit bone marrow mononuclear after culture for 14 days. Those were isolated<br /> by flow cytometry and immunocytochemistry staining with marker CD44, CD90, CD14, CD34.<br /> These analyses indicated that culture cells were MSCs. To induce osteoblast differentiation<br /> of the MSCs, the cultures were maintained in osteogenic media supplement with 1 µM<br /> dexamethasone, 50 µg/mL ascorbic acid for up to three weeks. Results: All samples after<br /> differentiation demonstrated that therre were actual calcium deposits in matrix by alizarin red<br /> staining. Under SEM appearance white crystals of MSC differentiation into osteogenic line. The<br /> cells were immunocytochemistry stained positive for osteocalcin. Conclusions: The bone marrow<br /> MSC tendency differentiation into osteoblast in dexamethasone and ascorbic acid.<br /> * Keywords: Mesenchymal stem cell;; Osteoblast; Differentiation; Dexamethasone; Ascorbic.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tạo cốt bào là một trong 4 tế bào của<br /> mô xương có vai trò tạo xương mới trong<br /> giai đoạn phát triển của cơ thể hoặc khi<br /> mô xương bị tổn thương. Trong cơ thể,<br /> các tế bào gốc trước khi trở thành tạo cốt<br /> <br /> bào (osteoblast), chúng phải trải qua giai<br /> đoạn biệt hóa để tạo thành tiền tạo cốt<br /> bào (pre-osteoblast). Ngày nay với công<br /> nghệ, giai đoạn này có thể thực hiện trong<br /> điều kiện in vitro nhằm tạo ra dòng tế bào<br /> có khả năng ứng dụng trên lâm sàng để<br /> <br /> * Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Hồng Nhung (nhunglehmu@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017<br /> <br /> 173<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> điều trị các bệnh lý xương khớp, đặc biệt<br /> là các bệnh không thể điều trị bằng phương<br /> pháp thông thường [1].<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Hình dạng tế bào sau biệt hóa.<br /> <br /> Kỹ thuật và môi trường biệt hóa TBGTM<br /> tủy xương thành tạo cốt bào đ được<br /> nhiều tác giả nghiên cứu. Trong phạm vi<br /> bài này, chúng tôi xin giới thiệu kết quả biệt<br /> hóa TBGTM tủy xương thỏ trong môi trường<br /> có dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic, đây là<br /> những chất kích thích cảm ứng tạo xương.<br /> Mục tiêu của nghiên cứu: Nuôi cấy,<br /> biệt hóa thành công TBGTM tủy xương<br /> thỏ thành tạo cốt bào trong môi trường có<br /> dexamethasone và ascorbic.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 15 mẫu tế bào trung mô tủy xương thỏ.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Các tế bào đơn nhân được phân lập từ<br /> tủy xương thỏ sau khi nuôi cấy tăng sinh<br /> 14 ngày, định danh bằng kỹ thuật hóa mô<br /> miễn dịch để khẳng định chắc chắn chúng<br /> là TBGTM.<br /> Đưa vào môi trường biệt hóa cảm ứng<br /> tạo xương để biệt hóa thành tạo cốt bào,<br /> gồm: 89% DMEM, 10% FBS, 1% kháng sinh,<br /> 1 µM dexamethasone, 50 µg/ml ascorbic,<br /> 100 mM β - glycerolphosphatase. Thời gian<br /> biệt hóa 3 tuần, thay môi trường 3 ngày/lần.<br /> Định danh sau biệt hóa bằng kỹ thuật<br /> alizarin để đánh giá khả năng lắng đọng<br /> canxi chất nền của tế bào. Đánh giá sự hình<br /> thành tinh thể khoáng bằng kỹ thuật hiển<br /> vi điện tử quét. Xác định marker osteocalcin<br /> của tế bào sau biệt hóa bằng phương pháp<br /> nhuộm hóa mô miễn dịch. Mỗi phương<br /> pháp lấy ngẫu nhiên 5 mẫu trong 15 mẫu<br /> đ biệt hóa.<br /> 174<br /> <br /> Hình 1: TBGTM sau biệt hóa theo hướng<br /> tạo cốt bào 14 ngày (x500).<br /> Quan sát tất cả các mẫu chúng tôi nhận<br /> thấy có sự biến đổi rõ rệt về hình dạng tế<br /> bào theo thời gian. Càng về sau, các tế<br /> bào có xu hướng phình to đoạn giữa giống<br /> hình hạt đậu. Đây có thể là hình ảnh đặc<br /> trưng của tế bào tạo xương.<br /> 2. Kết quả định danh tế bào sau biệt<br /> hóa.<br /> * Định danh bằng kỹ thuật nhuộm<br /> alizarin red:<br /> <br /> Hình 2: Tế bào sau biệt hóa 21 ngày nhuộm<br /> alizarin red (x200).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Trên tất cả các mẫu tế bào khi nhuộm với alizarin red đều cho kết quả đặc hiệu:<br /> tế bào và chất nền bắt màu đỏ cam, đây là phức hợp của thuốc nhuộm với ion canxi<br /> hiện diện trong tế bào hay chất nền ngoại bào, chứng tỏ tế bào được biệt hóa đ chuyển<br /> sang dạng tế bào tạo xương với lắng tụ canxi trong tế bào và chất nền ngoại bào.<br /> * Định danh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch:<br /> <br /> Hình 3: Các tế bào sau biệt hóa 15 ngày nhuộm hóa mô miễn dịch với<br /> marker osteocalcin (x200).<br /> Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin cho thấy tất cả các mẫu<br /> đều dương tính với osteocalcin. Osteocalcin là protein được tổng hợp nhiều trong tế<br /> bào tạo xương và được xem là marker của tế bào tạo xương.<br /> * Định danh bằng quan sát hình thành tinh thể khoáng dưới kính hiển vi điện từ quét:<br /> <br /> Hình 4: Tế bào gốc sau biệt hóa 30 ngày dưới hiển vi điện tử quét.<br /> (Các tinh thể muối khoáng lắng đọng trên bề mặt và xung quanh tế bào)<br /> 175<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Sau 3 tuần biệt hóa, trên tất cả các<br /> mẫu tế bào nuôi cấy quan sát dưới kính<br /> hiển vi điện tử quét, đều thấy xuất hiện<br /> tinh thể khoáng rõ rệt. Lắng đọng tinh thể<br /> khoáng trong mô nền quanh tế bào đang<br /> biệt hoá có xu hướng tăng dần về số<br /> lượng. Các tinh thể khoáng này có dạng<br /> hình kim, hoặc hình bông tuyết, tập hợp<br /> thành đám, lớn dần theo thời gian. Nghiên<br /> cứu của chúng tôi cũng thấy, hình ảnh<br /> lắng đọng tinh thể khoáng không xuất<br /> hiện trên các mẫu chứng là tế bào trung<br /> mô được nuôi cấy trong môi trường thông<br /> thường, không có yếu tố gây biệt hoá.<br /> <br /> của tạo cốt bào. Osteocalcin là marker<br /> xương, đặc biệt xuất hiện muộn tăng cao<br /> sau biệt hóa 28 ngày [3].<br /> <br /> Chúng tôi cho rằng đây là minh chứng<br /> rõ nét nhất cho thấy tế bào trung mô trong<br /> môi trường nuôi cấy, đặc biệt đ biệt hoá<br /> thành tạo cốt bào. Chính những tạo cốt<br /> bào này đ sinh ra mô nền tiền cốt. Mô nền<br /> tiền cốt này với đặc tính đặc biệt, đ tạo<br /> lắng đọng muối khoáng (chủ yếu là canxi<br /> và phospho), để tạo ra chất căn bản xương<br /> sau đó.<br /> <br /> hình, hình thái vẫn giống nguyên bào sợi.<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng<br /> phù hợp với Nadri S (2007). TBGTM sau<br /> khi tách chiết từ tủy xương biệt hóa thành<br /> tế bào tạo xương sau 3 tuần với biểu hiện<br /> hình thành nốt khoáng hóa bắt màu đỏ<br /> khi nhuộm alazarin red và phân tích marker<br /> biểu hiện xương bằng kỹ thuật RT-PCR<br /> cho thấy biểu hiện dương tích osteocalcin,<br /> osteopontin [2].<br /> Tsai M.T (2012) sau nuôi cấy biệt hóa<br /> TBGTM thành tạo cốt bào cũng định danh<br /> bằng các marker Runx2, ALP, osteocalcin.<br /> Runx2 biểu hiện tăng ở ngày thứ 3 sau<br /> biệt hóa, ALP là marker biểu hiện sớm<br /> 176<br /> <br /> Quiroz F.G (2008) nghiên cứu biệt hóa<br /> hMSC thành tạo cốt bào trong môi trường<br /> chuyên biệt tạo xương, đánh giá sự tạo<br /> xương bằng khoáng hóa trong chất nền<br /> và marker biểu hiện ở tạo cốt bào tại các<br /> thời điểm 14 và 20 ngày và so sánh với<br /> nhóm chứng. Sau 2 ngày biệt hóa, hình<br /> thái tế bào đ thay đổi, sau 5 ngày biệt<br /> hóa, tế bào có hình đa diện, nhóm tế bào<br /> ở nhóm chứng không có thay đổi kiểu<br /> Sau 14 ngày biệt hóa, khoáng hóa trong<br /> chất nền chưa r , mặc dù hình thái tế bào<br /> đ<br /> <br /> thay đổi, sau 20 ngày thấy có lắng<br /> <br /> đọng canxi hình thành trong chất nền khá<br /> điển hình. Tế bào MSC không nuôi cấy<br /> trong môi trường biệt hóa (nhóm chứng),<br /> hình thái tế bào không có thay đổi, không<br /> có khoáng hóa. Mức độ biểu hiện gen<br /> collagen týp I (col1), osteonectin (ON),<br /> bone sialoprotein (BSP) so với nhóm chứng<br /> thấy mức độ biểu hiện gen col1 và ON<br /> không có sự khác biệt ở thời điểm 14 và<br /> 20 ngày. Biểu hiện BSP có sự khác biệt ở<br /> thời điểm 14 và 20 ngày sau biệt hóa.<br /> Tiềm năng biệt hóa xương của MSC<br /> được xác định bằng khoáng hóa trong<br /> chất nền, là điều kiện duy trì trong quá<br /> trình biệt hóa xương. Quan sát sự khoáng<br /> hóa sau 20 ngày biệt hóa từ MSC có<br /> kiểu hình tương tự tế bào tiền thân tạo<br /> xương [4].<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Nhiều nghiên cứu đ<br /> <br /> công bố về vai<br /> <br /> trò của tế bào gốc đối với sự hồi phục<br /> g y xương không tự hàn gắn. Vì vậy, việc<br /> nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào<br /> gốc mô xương được quan tâm nhiều. Khả<br /> năng biệt hóa MSC thành dạng tạo cốt<br /> bào gợi mở ứng dụng liệu pháp tế bào gốc<br /> trong tái tạo mô xương. Hướng nghiên<br /> cứu có ý nghĩa quan trọng giúp cung cấp<br /> các bằng chứng khoa học, vai trò định<br /> hướng dòng trong điều trị tái tạo xương.<br /> Dexamethasone là một glucocorticoid<br /> steroid, có tác dụng kích thích biệt hóa<br /> thành xương của MSC, phụ thuộc vào<br /> liều của nó, liều cao thì kích thích tạo mỡ,<br /> liều thấp thì kích thích tạo xương. Liều<br /> dùng trong nghiên cứu này phù hợp cho<br /> biệt hóa tạo xương. Các yếu tố khác như<br /> ascorbic là yếu tố có tác dụng tham gia<br /> hình thành xương như biển đổi tiền<br /> collagen thành collagen, glycerolphosphatase<br /> có vai trò thúc đẩy hình thành chất nền<br /> khoáng hóa. Chính vì vậy, sau một thời<br /> gian tiếp xúc với môi trường biệt hóa, các<br /> tế bào MSC thay đổi hình thái giống tạo<br /> cốt bào.<br /> Hợp dòng và biệt hóa MSC tạo dòng<br /> xương được điều hòa bởi nhiều yếu tố.<br /> MSC biệt hóa tạo tiền tạo cốt bào. Tiền tạo<br /> cốt bào có hình elip, nhân nằm dọc theo<br /> tế bào và giai đoạn đầu của biệt hóa<br /> tế bào vẫn có tiềm năng tăng sinh. Chúng<br /> biểu hiện Runx2, DLx5, MSx2 và một vài<br /> marker của tạo cốt bào như ALP, collagen<br /> týp I và osteopontin (OPN), nhưng biểu<br /> hiện các marker yếu hơn ở tạo cốt bào<br /> <br /> trưởng thành. ALP là một trong những<br /> protein biểu hiện sớm và điều hòa khoáng<br /> hóa.<br /> β-catenin, Runx2 và Osx biệt hóa<br /> thành tiền tạo cốt bào đến tạo cốt bào<br /> trưởng thành. Những tế bào này phẳng<br /> có hình con suốt. Chúng biểu hiện protein<br /> chất nền xương, BSP và OPN.<br /> Giai đoạn sau, Runx2 bị ức chế khi tạo<br /> cốt bào trưởng thành. Osx có ở giai đoạn<br /> cuối của tạo cốt bào trưởng thành và cảm<br /> ứng biểu hiện osteocalcin. Khi tế bào<br /> hoàn tất quá trình biệt hóa có dạng hình<br /> khối và sản phẩm khoáng hóa vào chất<br /> nền vô cơ. Trong bào tương có bộ Golgi<br /> và lưới nội bào có hạt rất phát triển ở tạo<br /> cốt bào, kết quả là tăng các sản phẩm<br /> protein. Biểu hiện của OPN là giảm ở tạo<br /> cốt bào trưởng thành, trong khi biểu hiện<br /> các protein như P2X5, alkaline phosphatase,<br /> collagen týp I và osteocalcin ngày càng<br /> tăng [5].<br /> KẾT LUẬN<br /> Sau khi được biệt hóa 3 tuần trong môi<br /> trường có các chất cảm ứng tạo xương<br /> gồm dexamethasone và ascorbic, TBGTM<br /> tủy xương thỏ đ có dấu hiệu đặc trưng<br /> của tạo cốt bào.<br /> LỜI CẢM ƠN<br /> Nghiên cứu thuộc phạm vi đề tài cấp<br /> Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình nuôi cấy<br /> tế bào gốc mô xương và khả năng ứng<br /> dụng trong ghép tự thân trên động vật<br /> thực nghiệm”. Nhóm nghiên cứu xin gửi<br /> lời cảm ơn tới Bộ Y tế đ tài trợ cho<br /> nghiên cứu.<br /> 177<br /> <br />