Bước đầu phân lập và sàng lọc một số chủng vi khuẩn xử lý Ammonia và Nitrite từ một số nguồn mẫu khác nhau

Chia sẻ: Sở Trí Tu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết thông tin đến bạn từ 9 nguồn mẫu thu từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản 2, Huyện Cần Giờ và Huyện Thạnh Hoá, Long An đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn xử lý nitrogen bao gồm 2 chủng xử lý ammonia và 2 chủng nitrite. Cả 4 chủng này đều thuốc nhóm trực khuẩn Gram âm. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bước đầu phân lập và sàng lọc một số chủng vi khuẩn xử lý Ammonia và Nitrite từ một số nguồn mẫu khác nhau

BƢỚC ĐẦU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN XỬ LÝ AMMONIA VÀ NITRITE TỪ MỘT SỐ NGUỒN MẪU KHÁC NHAU Phạm Minh Nhựt, Nguyễn Phƣơng Thanh Trúc, Nguyễn Thị Bội Tuyền, Giáp Hồ Gia Bảo, Trần Minh Nhân Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh TÓM TẮT Từ 9 nguồn mẫu thu từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản 2, Huyện Cần Giờ và Huyện Thạnh Hoá, Long An đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn xử lý nitrogen bao gồm 2 chủng xử lý ammonia và 2 chủng nitrite. Cả 4 chủng này đều thuốc nhóm trực khuẩn Gram âm. Khi tiến hành định tính khả năng loại bỏ ammonia và nitrite, cả 4 chủng này đều có hoạt tính làm giảm lượng ammonia và nitrite trong môi trường W1 và W2. Các chủng này cần nghiên cứu sâu hơn về khả năng loại bỏ các hợp chất nitrogen. Từ khóa: Ammonia, ao nuôi tôm, định tính, hạt nổi, nitrite. 1. GIỚI THIỆU Tôm thẻ chân trắng là loài tôm được nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Các quốc gia như Ecuador, Mexico, Panama, Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Philippines, Malaysia… Tại Việt Nam hình thức nuôi tôm thẻ chân trắng phổ biến hiện nay là nuôi bán thâm canh và thâm canh với năng suất dao động phổ biến cho hình thức nuôi bán thâm canh 4-6 tấn/ha/vụ và cho hình thức nuôi thâm canh 8- 15 tấn/ha/vụ. Quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng được quản lý theo quy trình nuôi bằng hóa chất cho diệt khuẩn, quản lý tảo ao nuôi, bằng chế phẩm sinh học cho cải thiện chất lượng đáy và nước ao nuôi, quản lý bệnh bằng sử dụng các loại kháng sinh và hóa chất. Vấn đề cố hữu của các hệ thống ao nuôi tôm là sự tích tụ các chất thải hữu cơ (phần lớn là từ thức ăn thừa và chất thải của tôm nuôi), cùng với các hợp chất nitơ vô cơ có độc tính cao đối với thủy sinh vật (đặc biệt là ammonium và nitrite). Nitrogen là thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho tất cả các sinh vật, là một phần quan trọng cấu thành các phân tử như protein, nucleic acid, adenosine phosphate, pyridine nucleotide, và các sắc tố (Hagopian và Riley, 1998). Nitrogen trong ao tồn tại ở các dạng khác nhau bao gồm nitrate, nitrite, ammonia và các dạng nitrogen hữu cơ khác. Nitrogen được thải ra từ chất bài tiết của tôm, phân hủy từ tôm chết, tảo chết, và thức ăn dư thừa. Các dạng hợp chất nitrogen tích tụ trong bùn và trong nước giống nhau. Trong ao nuôi tôm, ammonia ở dạng NH3 (un-ionized ammonia) là hợp chất gây độc cho động vật thủy sản ở nồng độ nhất định. Ion ammonium (NH4+) là dạng khác của ammonia nitrogen không gây độc cho động vật thuỷ sản ở nồng độ thấp nhưng có thể gây hại khi ở nồng độ cực cao. N – NH3 là sản phẩm thải từ quá trình biến dưỡng của động vật thuỷ sản và sự phân hủy các chất hữu cơ bởi vi khuẩn. Tùy theo pH và nhiệt độ mà tỉ lệ ammonia tổng số và NH3 khác nhau (Kungvankij et al.,1986). Sự hiện diện của NH3 trong ao nuôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó đáng kể nhất là độ mặn, nhiệt độ và pH, oxy hòa tan, nitrate, và lượng thức ăn dư thừa trong ao, tảo. Khi pH cao thì ammonium chuyển hóa thành ammonia gây độc cho tôm và ngược lại. Để giải quyết vấn đề về nitrogen trong nguồn nước ao nuôi thì việc sử dụng các chế phẩm sinh học được coi là một giải pháp hỗ trợ mang tính tất yếu để ngành nuôi tôm công nghiệp tại nhiều nước trên thế giới 706
nói chung và Việt Nam nói riêng ổn định và phát triển bền vững. Việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong nuôi tôm thâm canh hiện nay đã phá vỡ cân bằng sinh thái và tác động xấu đến môi trường, chất lượng sản phẩm kém và tồn lưu các hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng đang tạo nên rào cản trong việc xuất khẩu tôm Việt Nam ra thị trường thế giới. Chính vì thế, việc tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hoạt tính xử lý nitrogen đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản nhằm góp phần ổn định chất lượng nước ao nuôi giúp cho động vật nuôi phát triển mạnh và bền vững. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguồn mẫu 9 mẫu được sử dụng để phân lập nhóm vi khuẩn xử lý nitrogen bao gồm 2 mẫu nước ao nuôi tôm và 2 mẫu bùn thu tại Huyện Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh; 1 mẫu hạt nổi trong hệ thống tuần hoàn thu tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản II; 4 mẫu nước ao nuôi cá trê bột thu tại Huyện Thạnh Hoá, tỉnh Long An. 2.2. Phân lập vi khuẩn xử lý nitrogen Các mẫu sau khi thu về được tăng sinh chọn lọc trong môi trường W1 và W2 trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 – 7 ngày. Sau thời gian tăng sinh chọn lọc, tiến hành định tính lượng ammonia và nitrite trong môi trường W1 và W2. Những mẫu có hiện tượng giảm nồng độ của ammonia và nitrite được tiến hành pha loãng và cấy trang trên môi trường W1 và W2 agar ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 – 7 ngày và tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trên môi trường dựa vào các đặc điểm về hình thái, màu sắc, rìa và hình chiếu. Các khuẩn lạc được chọn lọc được cấy làm thuần trên môi trường W1 và W2 agar và giữ giống trong glycerol 20% để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. 2.3. Khảo sát hình thái Các chủng vi khuẩn sau phân lập được tiến hành nhuộm Gram để xác định nhóm vi khuẩn vi khuẩn mong muốn. 2.4. Sàng lọc hoạt tính xử lý nitrogen của các chủng phân lập Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong môi trường BHIA có bổ sung NaCl 1,5%. Sau đó đo OD600nm và pha loãng về mật độ 108 cfu/ml rồi cấy vào môi trường khảo sát chứa N-NH3 (W1) và N- NO2 (W2) với nồng độ 10 mg/l và tiến hành khảo sát khả năng xử lý ammonia và nitrite theo thời gian khảo sát từ 0h đến 120h. Tại mỗi thời điểm khảo sát, tiến hành định tính lượng ammonia bằng thuốc thử Nessler và nitrite bằng hỗn hợp thuốc thử Griess A và Griess B. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.5. Trình bày kết quả: Thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn quang dưỡng có khả năng xử lý nitrogen từ 9 mẫu được trình bày ở Bảng 1. Kết quả phân lập chỉ thu được 2 chủng xử lý ammonia và 2 chủng xử lý nitrite. 707
Bảng 1. Các chủng vi khuẩn tự dưỡng phân lập từ các nguồn mẫu Hình dạng tế Hình ảnh Nguồn mẫu Chủng vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc bào Hạt nổi HnAOB1 Tròn, lồi, rìa đều, màu Hình que, đầu vàng nhạt, đường kính tròn, Gram âm < 1 mm HnAOB2 Tròn, lồi, rìa đều, màu Hình que, đầu trắng trong, đường tròn, Gram âm kính < 1 mm Mẫu bùn BC1NOB1 Tròn, lồi, rìa đều, màu Hình que, ngắn, CG1 trắng trong, đường Gram âm kính < 1 mm Mẫu bùn BC2NOB1 Tròn, lồi, rìa đều, màu Hình que, Gram CG2 trắng đục, đường kính âm > 1 mm Kết quả phân lập cho thấy rằng, tuy số mẫu được sử dụng khá nhiều trong quá trình phân lập (9 mẫu) nhưng chỉ thu được 4 chủng vi khuẩn xử lý nitrogen (2 chủng xử lý ammonia và 2 chủng xử lý nitrite). 2 chủng xử lý ammonia phân lập từ mẫu hạt nổi thu từ hệ thống bể nuôi tôm tuần hoàn của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản 2. Trong hệ thống nuôi tuần hoàn này, nước từ các bể nuôi được bơm qua bể lắng, sau đó qua bể chứa hạt nổi và sau đó đưa lại vào trong bể nuôi. Do đó, việc xuất hiện các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen trong hạt nổi là điều dễ hiểu. Hai chủng còn lại thuộc 2 chủng xử lý nitrite được phân lập từ 2 mẫu bùn thu tại ao nuôi tôm ở Cần Giờ. Trong khi đó, 2 mẫu nước ao nuôi tôm tại Cần Giờ và 4 mẫu nước ao nuôi cá trê tại Long An không phân lập được vi khuẩn xử lý nitrogen trong môi trường W1 và W2. Điều này có thể do các ao này việc quản lý nguồn nitrogen khá tốt nên việc hàm lượng nitrogen trong nguồn nước không cao dẫn đến khả năng xuất hiện các vi khuẩn xử lý nitrogen cũng rất hạn chế, từ đó dẫn đến kết quả không phân lập được các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen từ các nguồn mẫu này. 3.2. Kết quả định tính khả năng loại bỏ ammonia và nitrite của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Vi khuẩn xử lý ammonia được cấy vào môi trường W1 có sự hiện diện của (NH4)2SO4 với liều lượng 0,47 g/l, trong khi đó vi khuẩn xử lý nitrite được cấy vào môi trường W2 có sự hiện diện của NaNO2 với liều lượng 0,246 g/l, và tiến hành định tính sự hiện diện của hai thành này theo thời gian. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 2. 708
Bảng 2. Kết quả định tính loại bỏ ammonia và nitrite theo thời gian của các chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Thuốc thử Hiện tƣợng Thời gian HnAOB1 Nessler Vàng nhạt Sau 48h HnAOB2 Nessler Vàng rất nhạt Sau 48h BC1NOB1 Griess A và Griess B Trắng Sau 48h BC2NOB1 Griess A và Griess B Hồng nhạt Sau 48h Kết quả này cho thấy rằng 4 chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng xử lý ammonia và nitrite. Trong môi trường có chứa ammonia, nếu nồng độ càng cao thì phản ứng với thuốc thử Nessler sẽ càng mạnh tạo ra màu vàng sậm đền nâu. Tuy nhiên khi khảo sát hai chủng HnAOB1 và HnAOB2 thì sau 48h khảo sát thì màu vàng hình thành rất nhạt, điều này có nghĩa là hàm lượng ammonia trong môi trường còn rất ít so với ban đầu. Kết quả này cho thầy hai chủng HnAOB1 và HnAOB2 có khả hiệu quả xử lý ammonia. Tương tự như vậy đối với hai chủng BC1NOB1 và BC2NOB2 khi cấy vào môi trường W2. Khi sử dụng thuốc thử Griess A và Griess B để định tính sự hiện diện của nitrite trong môi trường thì hàm lượng nitrite càng cao thì màu càng hồng đậm. Sau thời gian 48h nuôi cấy BC1NOB1 và BC2NOB2 trong môi trường W2 thì trong môi trường nuôi cấy BC1NOB1 sau khi nhỏ thuốc thử không hình thành màu hồng còn môi trường nuôi cấy BC2NOB2 chỉ tạo màu hồng rất nhạt. Điều này chứng tỏ hai chủng này có hiệu quả loại bỏ nitrite khá tốt. Tuy nhiên, do khiếm khuyết về mặt thời gian nên nghiên cứu này chưa thể đánh giá định lượng hiệu quả loại bỏ nitrite và ammonia của 4 chủng này. Các thí nghiệm này sẽ được thực hiện trong thời gian tới để hoàn thành nghiên cứu. 4. KẾT LUẬN Từ 9 nguồn mẫu bao gồm mẫu hạt nổi, mẫu bùn, mẫu nước ao nuôi tôm và nước ao nuôi cá trê đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn trong đó có 2 chủng xử lý ammonia và 2 chủng xử lý nitrite. Kết quả định tính cho thấy rằng cả 4 chủng đều loại bỏ tốt ammonia và nitrite sau thời gian 48h nuôi cấy trong môi trường bổ sung cơ chất ammonia và nitrite. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boyd, C.E, 1998. Water quality in pond for aquaculture. Department of fisheries and applied aquaculture, Auburn University. [2] Chen, J.C. and S.F. Chen, 1992. Effects of nitrite on growth and molting of Penaeus monodon juveniles. Comparative boichemistry and physiology part C: Comparative pharmacology and toxicology. 101: 453-458. [3] Hagopian and Riley, 1998. A closer look at the bacteriology of nitrification. Aquacultural Engineering. 18 (4): 223-244. [4] Kungvankij, P., T.E. Chua, J. Pudadera, G. Corre, L.B. Tiro, I.O. Potestas, G.A. Taleon and J.N. Paw, 1986. Shrimp culture: pond design, operation and management. NACA training manual series. 2:50-68 709