Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

687
lượt xem 84
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tách dòng gen (gene cloning), còn được gọi với nhiều tên khác nhau: tạo dòng gen, nhân dòng gen, phân lập gen…Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen

III. Các phương pháp tách dòng gen Tách dòng gen (gene cloning), còn ư c g i v i nhi u tên khác nhau: t o dòng gen, nhân dòng gen, phân l p gen…Tách dòng gen là t p h p các k thu t nh m ưa m t gen, m t o n DNA c n thi t (DNA ensert) vào t bào ch (host cell), t o i u ki n tích h p các t bào ch phân chia, t o nên vô s các t bào cùng mang m t o n DNA insert gi ng nhau, t o nên m t dòng t bào tái t h p mang gen c n tách dòng. Tách dòng gen có t h ư c th c hi n theo nhi u phương pháp khác nhau.Các phương pháp tách dòng gen ch y u u c s d ng nhi u trong công ngh sinh h c phân t là tách dòng th c nghi m (cloning in vitro) và tách dòng o (cloning in silico). 1. Tách dòng invitro. Tách dòng in vitro hay tách dòng th c nghi m là tách dòng gen ư c th c hi n t các m u sinh h c (mô t vào, lông tóc, d ch sinh h c…), mang các gen c n tách dòng ho c t ng h p nhân t o o n gen c n tách dòng. Tách dòng in vitro g m phương pháp khác nhau, có th tách dòng t DNA, tách RNA ho c tách dòng trên cơ s dòng t trình t cac acid amin trong chu i polypeptid…. 1.1. Tách dòng gen t DNA: Tách dòn t DNA g m các bư c cơ b n sau: Bư c 1: Chuân b gen c n tách dòng (gen c n thi t, gen ích - target gene) và ch n vectơ tách dòng. - Chu n b gen c n tách dòng: Trong các phòng thí nghi m sinh h c ph n t gen c n tách dòng thư ng ư c tách chi t t các m u sinh h c. Phương pháp này chu n b gen tách dòng b ng t ng h p nhân t o t các oligonucleotid ít ư c s d ng, do k thu t ph c t p, t n kém và chu n xác không cao. Trư ng h p chưa bi t trình t c a gen c n tách dòng, ph i d a vào kích thư c ch n l c o n gen c n tách dòng. Các bư c th c hi n ch c a gen c n tách dòng y u: tách chi t DNA b gen, nhân gen b ng PCR, s d ng enzym gi i h n c t thành các o n DNA nh , i n di trên gel agar (ho c gel polyacrylamid) v i thang DNA 1
i n di, d a vào kích thư c c a gen c n tách dòng l a ch n ư c chu n. T k t qu o n DNA ch a gen c n tách dòng. Sơ k thu t tách dòng th c nghi m - Ch n vectơ tách dòng D a vào kích thư c gen c n tách dòng và m c ích tách dòng ch n vectơ tách dòng là plasmid, phage, các nhi m s c th nhân t o… Bư c 2: T o vectơ tái t h p. S d ng các enzym gi i h n thích h p c t các gen c n tách dòng và vectơ tách dòng nh ng v trí c hi u gi ng nhau, t o i u ki n thu n l i cho quá trình tái t h p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA inset. S d ng enzym n i DNA ligase g n các gen c n tách dòng vào vectơ có hi u qu , hình thành các vectơ tái t h p (recombinant vectơ). hi u qu t o vectơ tái t h p cao, c n chú ý t l thích h p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA insert, ng th i b sung các enzym n i DNA thích h p. Enzym T4DNA ligase xúc tác hình thành các liên k t phosphoeste n i các do n DNA 2
u b ng v i nhau, nên ư c s d ng r t r ng rãi trong t o vectơ n i các o n ct DNA. Bư c 3: Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch . Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch (host cell) b ng các phương pháp khác nhau: Siêu âm, vi tiêm, b n gen, s d ng PEG (polyethylen glycol)… V i các t bào ch là vi khu n thư ng s d ng phương pháp bi n n p s c nhi t. Phương pháp s c nhi t có hi u qu cao v i các t bào ch là vi khu n E.coli và m t s loài vi khu n khác. Trư ng h p t bào ch là n m men có th s d ng phương pháp bi n n p là xung i n, bán gen…. Bư c 4: Sàng l c các dòng tái t h p Sàng long (screeing) các th tái t h p nh m ch n l c các t bào mang vectơ tái t h p trong qu n th . Tuỳ thu c gen ch th (marker) trong các vectơ tái t h p là ch l a ch n phương pháp thích h p. th kháng sinh, ho c ch th màu Bư c 5: Nuôi c y dòng tái t h p thu sinh kh i và protein tái t h p. Nuôi c y các dòng tái t h p trong môi trư ng dinh dư ng các i u ki n thích t 108 - 109 t bào/1ml có th li tâm thu sinh kh i t bào. h p, khi m t t bào 1.2. Tách dòng gen t RNA thông tin (mRNA). Tách dòng gen t mRNA là m t quá trình ph c t p, có th th c hi n theo các bư c sau: Bư c 1: Tách chi t mRNA RNA thông tin ư c tách chi t theo các protcol thông d ng trong các phòng thí nghi m. Có th s d ng s c kí ái l c v i bi t có mang oligo nucleotid T. Các phân t mRNA có uôi poly A t o liên k t v i oligo - dT, làm cho các phân t mRNA bám trên b m t các viên bi t . S d ng k thu t li tâm phân o n tách mRNA ra kh i bi t - 850C thu mRNA. Có th gi mRNA nhi t ti p t c nghiên c u. Bư c 2: T ng h p cDNA m ch kép. d ng k thu t PCR ngư c có s tham gia c a enzym phiên mã ngư c S (reverse transcriptase enzyme), enzym DNA polymerase t ng h p cDNA (cDNA complêmntary DNA). Thu phân s i khuôn mRNA b ng enzym RNase H, sau ó b t ng h p s i ơn cDNA th hai, t o sung enzym DNA polymerase và các dNTP phân t cDNA m ch kép. 3
Bư c 3,4,5: G n cDNA m ch kép v i các vectơ tách dòng thích h p, hình thành các vectơ tái t h p. Bi n n p vào t bào ch , sau ó sàng l c các t bào mang vectơ tái t h p và c y truy n vào các ng th ch nghiêng t o nên các dòng khác nhau u c tách dòng t mRNA. Tách dòng gen t mRNA K t qu t mRNA có th t o nên các dóng vi khu n mang o n cDNA m ch kép, tương ưng v i các gen c n tách dòng. 2. Tách dòng in sillico. Tách dòng in silico hay tách dòng o (cloning in silico) là s t ng h p, phân tích các k t qu tách dòng gen in vitro, trên cơ s thông tin t các ngân hàng d li u (STS, EST…) l a ch n m t o n DNA ho c m t gen c n thi t nào ó. K t qu tách dòng in silico cho phép l a ch n phương án thi t k vectơ tái t h p có hi u qu , d toán trư c k t qu tách dòng và hi u qu bi u hi n gen cũng như mc thành công c a th c nghi m. 4
Bư c 1: S d ng ph n m m pDRAW 32 ch n vectơ tách dòng. Gi i thi t ch n vectơ pCR 2.1 trong các lo i vectơ hi n th , ng th i ki m tra rình t nucleotid c a vectơ pCR 2.1 và tìm v trí c t c a enzym gi i h n thích h p. Ví d , o n DNA insert có kích thư c 958 bp, có th ài g n vào vectơ pCR 2.1 v trí 294 và k t thúc v trí 1252 . IV. Ngân hàng b gen (genome bank) 1. Khái ni m ngân hàng b gen. Ngân hàng b gen là t p h p các o n DNA b gen ư c tách dòng trong t bào ch , t o nên các dòng t bào khác nhau, m i dòng mang m t o n DNA khác nhau c a b gen. B gen c a sinh v t b c cao g m các gen phân o n, có các exon xen k intron. Do ó, ngân hàng b gen bao g m các o n DNA có các trình t mang mã di truy n (exon) xen k v i các trình t không mang mã di truy n (intron). M i lo i enzym gi i h n c t c hi u DNA nh ng trình t nh t nh. M t b gen, khi s d ng các lo i enzym gi i h n khác nhau, t o nên s lư ng o n c t khác nhau, s hình thành nên các ngân hàng b gen khác nhau. 2. Thi t l p ngân hàng b gen. Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n các m c khác nhau: ngân hàng gen c a m t nhi m s c th , m t t bào hay m t loài. Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n theo các bư c cơ b n sau: Tách chi t và tinh s ch DNA b gen, s d ng m t ho c m t s lo i enzym gi i h n c t DNA b gen thành t ng o n có kích thư c nh theo ý mu n. Tách riêng t ng o n DNA và g n v i m t vectơ tách dòng t o nên các vectơ tái t h p, m i vectơ tái t h p ư c chuy n vào m t t bào ch t o nên m t dòng. 5
Sơ thi t l p ngân hàng b gen V. Ngânhàng cDNA Tách chi t và tinh s ch mRNA c a t bào, mô t ng th i i m nh t nh thu ư c s lo i mRNA tương ng v i s gen ang ho t ng trong t bào. S d ng k thu t phiên mã ngư c t mRNA t o nên các cDNA tương t ng, m i cDNA ư c g n vào m t vectơ tách dòng, t o nên các còng cDNA khác nhau. T p h p t t c các mRNA thu u c t m t lo i t bào, các giai o n phát tri n khác nhau t o nên t p h p cDNA ư c tách dòng g i là ngân hàng cDNA c a m t t bào. 1. K thu t phiên mã ngư c t o cDNA. Ký thu t phiên mã ngư c t o cDNA khác nhau, g m hai nhóm phương pháp ch y u: 1.1 Phiên mã ngư c b ng phân hu hoàn toàn s i khuôn mRNA S d ng k thu t PCR v i các m i c hi u có uôi oligo - dT, các lo i nucleotid t do và enzym DNA polymerase, t s i khuôn mRNA t ng h p s i ơn cDNA có c u trúc k p tóc (hairpin loop) u cu i ( u 3'). S d ng enzym RNase H phân hu hoàn toàn s i khuôn mRMA, ng th i b sung enzym DNA polymerase và các nucleotid t do t ng h p s i ơn cDNA th 2, nh kéo dài c u trúc k p tóc (c u trúc vòng). X lý enzym S1 nuclease c tb o n c u trúc k p tóc, t o nên phân t cDNA có c u trúc xo n kép, mang mã di truy n tương ng v i gen mã hoá mRNA. 6
Sơ ò t o cDNA theo cách phân hu hoàn toàn mRNA 1.2. Phiên mã ngư c t o cDNA theo k thu t RACE K thu t RACE g n các bư c tương t như tách dòng t mRNA. Sau khi t ng h p ư c cDNA m ch ơn, thu phân toàn b phân t mRNA b ng RNase H. Th c hi n k thu t n i thêm uôi poly C (CCCC) vào u 3' c a cDNA nh enzym terminal transferase và ATP. B sung thêm các m i oligo dG (GGGG), dNTP, enzym DNA polymerase và th c hi n nhân gen PCR t ng h p m ch cDNA th hai. 7
S d ng k thu t RACE tách dòng gen t mRNA 2. Thi t l p ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA có th xây d ng trên m t nhi m s c th , m t cơ quan ho c toàn b cơ th . T m i phân t mRNA thu ư c, th c hi n phiên mã ngư c t o nên m t cDNA m ch kép. M i phân t cDNA m ch kép ư c g n vào m t vectơ tách dòng và chuy n vào m t t bào ch o nên các dòng cDNA. 8