Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli bl21(de3) từ vi khuẩn Bacillus

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> CHỌN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN KERATINASE<br /> TRONG ESCHERICHIA COLI BL21(DE3) TỪ VI KHUẨN BACILLUS<br /> Nguyễn Thu Hiền1, Hoàng Thị Thu Hiền1, Khuất Hữu Thanh2, Nguyễn Huy Hoàng1*<br /> 1<br /> <br /> Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nhhoang@igr.ac.vn<br /> 2<br /> Trường Đại học Bách khoa Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT: Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis là hai chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân lông<br /> vũ cao. Protein keratinase từ hai chủng này đã được nghiên cứu khá phổ biến, đây là nhóm enzyme thương<br /> mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá trình công nghệ sinh học<br /> liên quan đến chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp gia cầm và công nghệ da. Mặt khác, keratin<br /> sau khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo, tạo ra được các axit amin hiếm như<br /> serine, cystein và proline và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Nhằm mục đích thu được lượng<br /> enzyme có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành biểu hiện gen keratinase tái tổ hợp từ B. licheniformis và<br /> B. subtilis trong Escherichia coli. Gen Ker 1 từ chủng B. licheniformis HT10 được tích hợp vào vector<br /> pET22b và gen Ker 2 từ B. subtilis Đ.nđ1.2 được tích hợp vào vector pET32a. Trong cùng điều kiện biểu<br /> hiện ở 37oC, cảm ứng IPTG nồng độ 1mM, hai protein thu được có kích thước và hoạt độ enzyme khác<br /> nhau lần lượt là 28 kDa, 23,5 U/ml và 36 kDa, 18,5 U/ml.<br /> Từ khóa: Bacillus lichenniformis, Bacillus subtilis, E. coli, biểu hiện gen, keratinase.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Keratin là thành phần chủ yếu trong lông<br /> vũ, là protein cấu trúc sợi, giàu liên kết<br /> disulfide, hydro và các đầu tương tác kị nước<br /> dẫn đến độ bền cơ học cao. Theo Lin et al.<br /> (2009) [6], keratin không hòa tan trong nước và<br /> không phân hủy bởi các enzyme phân giải<br /> protein phổ biến như trypsin, pepsin và papain.<br /> Nhưng keratin có thể bị phân hủy bởi các vi<br /> sinh vật có khả năng sinh keratinase cao.<br /> Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều<br /> nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn.<br /> Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh<br /> keratinase, hoạt tính keratinase cao đã được ghi<br /> nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus.<br /> Keratinase có đặc tính sinh hóa rất đa dạng khi<br /> được thu từ các nguồn khác nhau. Mặc dù chỉ<br /> phân lập trong phạm vi hai chủng vi khuẩn B.<br /> licheniformis và B. subtilis nhưng cũng cho ta<br /> thấy sự đa dạng của keratinase. Đối với B.<br /> licheniformis, theo nghiên cứu của Lin et al.<br /> (1992) [7], keratinase có khối lượng phân tử 33<br /> kDa, pH tối ưu đã được xác định 7.5, nhiệt độ<br /> tối ưu là 50°C và ổn định khi bảo quản ở -20°C.<br /> Đối với chủng B. subtilis, keratinase có khối<br /> lượng phân tử là 25,4 kDa, pH tối ưu là 7,5 và<br /> nhiệt độ tối ưu là 70°C theo công bố của Gupta<br /> & Ramnani (2006) [2]. Nhiều nghiên cứu ghi<br /> <br /> nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng<br /> B. licheniformis và B. subtilis, là thành viên của<br /> nhóm protease serine, điều này đã được đề cập<br /> đến trong công bố của Brandelli (2008) [1]. Đây<br /> là nhóm enzyme thương mại, có nhiều ứng dụng<br /> quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong<br /> các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến<br /> chất thải có chứa keratin từ ngành công nghiệp<br /> gia cầm và công nghệ da. Mặt khác keratin sau<br /> khi bị thủy phân có thể làm thức ăn chăn nuôi,<br /> phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như<br /> serine, cystein và proline, làm giảm ô nhiễm<br /> môi trường [9].<br /> Do tầm quan trọng của keratinase trong các<br /> ngành công nghiệp, keratinase đã được nghiên<br /> cứu khá nhiều. Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày<br /> càng tăng của keratinase trong ứng dụng công<br /> nghiệp, những nghiên cứu tập trung vào việc<br /> nâng cao năng suất và hoạt tính keratinase<br /> thông qua nhân bản gen và biểu hiện keratinase<br /> tái tổ hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nhân<br /> đoạn gen mã hóa keratinase bằng phản ứng PCR<br /> từ 2 chủng vi khuẩn B. licheniformis và B.<br /> subtilis, chọn dòng trong hệ vector pET và biểu<br /> hiện trong vi khuẩn E. coli.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> 51<br /> <br /> Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang<br /> <br /> B. licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2<br /> (mã số FN692035.1) đã được phân lập từ vùng<br /> đất chăn nuôi và giết mổ gia cầm tại Hà Nội đã<br /> được công bố bởi Nguyễn Huy Hoàng và nnk.<br /> (2010) [4].<br /> Phương pháp<br /> Chọn dòng gen keratinase<br /> Khuếch đại đoạn gen Ker<br /> <br /> Trình tự mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn<br /> gen Ker được thiết kế bằng cách phân tích độ<br /> tương đồng nucleotide từ đoạn gen keratinase<br /> của chủng B. subtillis và B. licheniformis đã<br /> được đăng kí trên Gen Bank (bảng 1). Theo<br /> phương pháp của Nguyễn Thị Minh và nnk.<br /> (2011) [8], đoạn mồi được gắn thêm trình tự các<br /> enzyme giới hạn để khuếch đại được đoạn gen<br /> Ker từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc.<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự các cặp mồi<br /> Chủng<br /> Mồi<br /> B. licheniformis ker-F1<br /> HT10 - Gen<br /> Ker1<br /> ker-R1<br /> B. subtilis<br /> Đnđ1.2 - Gen<br /> Ker2<br /> <br /> ker-F2<br /> ker-R2<br /> <br /> Trình tự mồi (chiều 5’ đến 3’)<br /> 5’-TCCATGGATGATGAGGAAAAAGAGTTTTGGC-3’<br /> Nco I<br /> 5’-TGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’<br /> BamHI<br /> 5’-CGTGGGATCCAAAAAATTGTGGATCAGC-3’<br /> BamHI<br /> 5’-TTATTCTCGAGCTGCTTGTACGTTGAT-3’<br /> XhoI<br /> <br /> Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể<br /> tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Taq Buffer, 10<br /> mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 100 ng DNA<br /> khuôn và 2U Dream Taq polymerase. Chu trình<br /> nhiệt: 95oC: 3 phút; (95oC: 1 phút; 60oC: 1 phút;<br /> 72oC: 3 phút) 30 chu kỳ; 72oC: 10 phút, giữ mẫu<br /> ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra<br /> trên gel agarose 0,8% và được tinh sạch bằng bộ<br /> kit GeneJETTM Gel Extration của Fermentas.<br /> Tách dòng phân tích trình tự gen Ker<br /> Sản phẩm gen Ker được khuếch đại từ phản<br /> ứng PCR sau khi tinh sạch được gắn vào vector<br /> chọn dòng. Gen Ker1 được gắn vào vector<br /> pCR2.1 (TA cloning Kit, Invitrogen). Gen Ker2<br /> được gắn vào vector pJET1.2/blunt (CloneJET™<br /> PCR Cloning Kit-Thermo Scientific). Các phản<br /> ứng được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản<br /> xuất. Tiến hành biến nạp sản phẩm ligase vào tế<br /> bào khả biến E. coli Top10 trên đĩa môi trường<br /> LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc để chọn lựa<br /> được tế bào mang vector tái tổ hợp. Để kiểm tra<br /> kết quả của phản ứng ligase, các khuẩn lạc được<br /> chọn lọc và tách plasmid sau đó được cắt kiểm<br /> tra bằng enzyme giới hạn.<br /> Biểu hiện gen keratinase trong vi khuẩn<br /> E. coli<br /> Thiết kế vector biểu hiện trong E. coli<br /> 52<br /> <br /> Xử lý vector pCR2.1-Ker1 và vector<br /> pET22b(+) bằng 2 enzyme NcoI và BamHI.<br /> Vector pJET1.2-Ker2 và pET32a(+) được xử lý<br /> bằng 2 enzyme BamHI và XhoI. Sản phẩm cắt<br /> sau khi tinh sạch được gắn vào vector tương<br /> ứng bằng enzyme T4 ligase ở 16oC, qua đêm.<br /> Biến nạp sản phẩm ligase vào tế bào khả biến<br /> E. coli Top 10. Thu nhận các khuẩn lạc mọc<br /> được trên đĩa môi trường có bổ sung kháng sinh<br /> chọn lọc ampicillin nồng độ 100 µg/ml để tách<br /> plasmid. Cắt kiểm tra plasmid bằng enzyme giới<br /> hạn để kiểm tra kích thước của đoạn gen và<br /> vector.<br /> Biểu hiện gen Ker1 và Ker2 tái tổ hợp<br /> Plasmid mang vector tái tổ hợp pET22bKer1 và pET32c-Ker2 được biến nạp vào tế bào<br /> khả biến E. coli BL21 bằng phương pháp sốc<br /> nhiệt. Khuẩn lạc sinh trưởng được trên môi<br /> trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc<br /> ampicillin nồng độ 100 µg/ml được lựa chọn.<br /> Nuôi cấy tế bào E. coli BL21 mang vector<br /> tái tổ hợp được nuôi trong 3 ml môi trường LB<br /> có bổ sung kháng sinh chọn lọc, qua đêm, điều<br /> kiện 200 vòng/phút, 37oC. Tiếp giống với tỉ lệ<br /> 1/50 thể tích trong 50 ml môi trường LB,<br /> ampicillin. IPTG nồng độ 1mM được bổ sung<br /> vào khi OD600nm dịch nuôi đạt 0,8. Sau 4 giờ<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> nuôi cấy, tế bào được thu sinh khối bằng<br /> phương pháp ly tâm. Cặn tế bào được hòa tan<br /> trong PBS pH 7 và bị xử lý bằng phương pháp<br /> siêu âm. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong<br /> 10 phút ở 4oC để thu lại lượng protein hòa tan,<br /> điện di trên gel polyacrylamid 12% được biến<br /> tính ở 95oC trong 10 phút.<br /> Thử hoạt tính keratinase<br /> Hoạt tính của keratinase tái tổ hợp được đo<br /> theo phương pháp của Riffel et al. (2003) và<br /> Zhang et al. (2009) [11, 17]. Chủng E. coli<br /> BL21 (DE3) được lên men trong điều kiện ở<br /> 37oC, tốc độ lắc 220 vòng/phút và cảm ứng<br /> IPTG với nồng độ cuối cùng 1 mM, dừng lên<br /> men sau 4 giờ từ khi cảm ứng. Tế bào được thu<br /> bằng ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở<br /> 4oC; sinh khối được hòa tan bằng đệm PBS,<br /> siêu âm phá vỡ tế bào ở tần số 22Hz với chu kỳ<br /> 15 giây phá, dừng 10 giây trong thời gian 2 phút<br /> ở 2-4oC. Dịch sau siêu âm được ly tâm ở 12.000<br /> vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, được sử dụng<br /> như enzyme. Phản ứng enzyme, cơ chất diễn ra<br /> trong môi trường đệm glycine/NaOH ở 60°C,<br /> 15 phút. Kết quả được đo ở bước sóng 440 nm.<br /> Trong đó, cứ 0,01 giá trị hấp thụ ánh sáng ở<br /> bước sóng 440 nm tương ứng với 1U hoạt tính<br /> enzyme.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Nhân dòng gen keratinase từ chủng B.<br /> licheniformis HT10, B. subtilis Đnđ1.2<br /> Gen Ker1 đã được nhân lên từ DNA tổng số<br /> của chủng B. licheniformis HT10. Dựa trên<br /> trình tự gen ker mã hóa cho protease serin kiềm<br /> của các B. licheniformis được đăng kí trên<br /> GenBank có kích thước khoảng 1,2 kb (hình 1).<br /> Tương tự, đoạn gen Ker 2 cũng được nhân lên<br /> từ DNA tổng số của chủng B. subtillis Đ.nđ1.2.<br /> Đoạn gen Ker2 cũng có chiều dài khoảng 1,2<br /> kb. Kết quả PCR trên gel điện di cho thấy một<br /> đoạn băng đặc hiệu đúng theo kích thước mong<br /> đợi (hình 1).<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch và được gắn<br /> vào vector chọn dòng, Ker1 được gắn vào<br /> vector pCR2.1, Ker2 được gắn vào vector<br /> pJET1.2. Sau đó, toàn bộ sản phẩm ligase được<br /> biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Top10.<br /> Trong quá trình sinh trưởng của E. coli, plasmid<br /> <br /> được nhân lên với số lượng lớn. Để chọn ra<br /> đúng các plasmid mang gen Ker, các dòng tế<br /> bào E. coli tái tổ hợp được chọn lọc trên môi<br /> trường có bổ sung kháng sinh và tách chiết<br /> plasmid để kiểm tra sự có mặt của gen ker trong<br /> plasmid. Các plasmid có kích thước cao hơn so<br /> với đối chứng là vector chọn dòng không mang<br /> gen được chọn và kiểm tra tiếp bằng phản ứng<br /> cắt enzyme. Plasmid Ker1-pCR21 được xử lý<br /> bằng hai enzyme NcoI và BamHI, Ker2-pJET12<br /> được xử lý bằng hai enzyme XhoI và BamHI.<br /> Kết quả điện cho thấy có một băng có kích<br /> thước đúng bằng kích thước của vector, băng<br /> còn lại có kích thước bằng kích thước của đoạn<br /> gen được chèn vào (không đưa hình ảnh).<br /> <br /> Hình 1. Sản phẩm PCR gen keratinase<br /> M. Thang DNA chuẩn; 1. Gen Ker1 từ chủng<br /> B. licheniformis HT10; 2. Gen Ker2 từ chủng<br /> B. subtillis Đ.nđ1.2.<br /> Phân tích trình tự gen Ker1, Ker2<br /> Gen Ker1, Ker2 được tiến hành giải trình tự<br /> gen và được phân tích trên phần mềm BioEdit.<br /> Toàn bộ trình tự gen Ker1 dài 1146 bp mã hóa<br /> cho protein gồm 381 axit amin. Khi so sánh các<br /> trình tự nucleotid của gen Ker1 của chủng B.<br /> licheniformis HT10 với các trình tự của các gen<br /> keratinase khác được tách ra từ các chủng vi<br /> khuẩn B. licheniformis đăng kí trên GenBank,<br /> trình tự nucleotid của keratin từ chủng B.<br /> licheniformis HT10 có độ tương đồng cao về<br /> trình tự nucleotid (97-99%). Đặc biệt, nucleotid<br /> của gen keratinase trong nghiên cứu có độ<br /> tương đồng tới 99,56% với trình tự của gen<br /> keratinase có mã số truy cập QG339614.<br /> Đoạn gen Ker2 có chiều dài 1138 bp, mã<br /> hóa 378 axit amin. Kết quả so sánh trên Gen<br /> Bank, trình tự Ker 2 có độ tương đồng cao với<br /> 53<br /> <br /> Nguyen Thu Hien, Hoang Thi Thu Hien, Khuat Huu Thanh, Nguyen Huy Hoang<br /> <br /> nhiều gen keratinase từ các chủng B. subtilis<br /> khác được công bố. Ker2 có độ tương đồng đến<br /> 99% với gen keratinase chủng B. subtilis strain<br /> YYW-1KerC có mã số truy cập EU362730.<br /> Từ các kết quả so sánh về trình tự nucleotid<br /> và trình tự acid amin có thể thấy, gen Ker1<br /> chúng tôi phân lập được từ chủng B.<br /> licheniformis HT10 và gen Ker2 từ chủng<br /> Đ.nđ1.2 là gen mã hóa cho keratinase thuộc<br /> nhóm subtilisin.<br /> Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli BL21<br /> (DE3)<br /> <br /> Hình 2. Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng<br /> enzyme cắt giới hạn<br /> 1. Thang DNA chuẩn; 2. Ker2-pET32 được xử<br /> lý bằng XhoI và BamHI; 3. Thang DNA chuẩn;<br /> 4. Ker1-pET22 được xử lý bằng NcoI và BamHI<br /> Gen Ker1 được thu hồi từ sản phẩm lai tách<br /> dòng Ker1- pCR2.1 bằng 2 enzyme cắt giới hạn<br /> NcoI và BamHI, sản phẩm lai Ker2-pJET12<br /> được xử lý bằng XhoI và BamHI để thu nhận<br /> gen Ker2. Gắn gen Ker1 vào vector pET22b và<br /> gen Ker2 vào pET32a tại hai vị trí cắt tương<br /> ứng để tạo vector biểu hiện trong E. coli. Phản<br /> ứng ghép nối được thực hiện ở 16oC qua đêm.<br /> Trong vector biểu hiện này, vùng nhân bản có<br /> sẵn điểm His•Tag® và S•Tag™ phục vụ cho<br /> việc nhận biết và tinh sạch các protein. Sản<br /> phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E.<br /> coli BL21(DE3) và chọn lựa những dòng tế bào<br /> có kích thước plasmid lớn hơn pET22b và<br /> pET32a. Xử lý đồng thời các dòng plasmid này<br /> với enzyme giới hạn tương ứng để chọn lựa<br /> chính xác dòng tế bào mang gen Ker1 và Ker 2<br /> (hình 2).<br /> 54<br /> <br /> Kết quả điện chứng tỏ, vector tái tổ hợp<br /> pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2 đã được thiết kế<br /> và biến nạp thành công vào chủng E. coli BL21<br /> (DE3).<br /> Biểu hiện gen Ker1, Ker2 trong E. coli<br /> BL21(DE3)<br /> Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng<br /> chủng chủ là E. coli BL21(DE3), đây là chủng<br /> chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và<br /> ompT protease (protease màng ngoài tế bào). Vì<br /> vậy, E. coli BL21(DE3) có ưu điểm là hạn chế<br /> sự phân cắt của protease đối với protein ngoại<br /> lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy<br /> và ổn định hơn sau khi tổng hợp. Ngoài ra,<br /> DNA hệ gen của E. coli BL21(DE3) có chứa<br /> gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn<br /> gốc từ bacteriophage T7. Gen này được đưa vào<br /> hệ gen của chủng E. coli BL21(DE3) và đặt<br /> dưới sự điều khiển của promoter lac. T7 RNA<br /> polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả<br /> năng sao chép hoàn toàn bất kỳ trình tự DNA<br /> nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter .<br /> Protein tái tổ hợp trong E. coli có thể tồn tại<br /> ở dạng thể vùi hoặc thể hòa tan. Hai trong<br /> những yếu tố quan trọng nhất trong việc biểu<br /> hiện một protein ngoại lai trong E. coli là nhiệt<br /> độ và nồng độ IPTG. Các yếu tố khác như nếp<br /> gấp nội bào protein, hoạt động protease nội<br /> sinh, tốc độ sinh trưởng của tế bào cũng có thể<br /> ảnh hưởng đến mức độ biệu hiện, điều này đã<br /> được đề cập đến trong công bố của Sambrook &<br /> Michal (1989) [13]. Theo Lin et al. (2009) [6],<br /> các vấn đề như khả năng biểu hiện thấp hoặc sự<br /> hình thành thể vùi thường gây ra bởi yếu tố kị<br /> nước được quy định bởi trình tự amino acid<br /> mang tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử<br /> protein mới được tổng hợp. Để đạt được mức độ<br /> biểu hiện cao nhất, các dòng tế bào mang vector<br /> tái tổ hợp hợp pET 22b-Ker1 và pET32a-Ker2<br /> được nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ<br /> IPTG, thời gian biểu hiện khác nhau. Qua các<br /> kết quả nghiên cứu, chủng E. coli mang gen Ker<br /> tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất ở điều kiện 200<br /> vòng/phút, 37oC, nồng độ IPTG 1mM. Protein<br /> ngoại lại được thu hồi sau 4 giờ cảm ứng và<br /> điện di trên gel SDS 12,5% (hình 3). Vì<br /> keratinase tái tổ hợp này có thể được thể hiện<br /> trong tế bào chất của vi khuẩn E. coli theo<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 51-57<br /> <br /> nghiên cứu của Lin et al. (2009) [6], nên chúng<br /> tôi tập trung thu hồi protein ở dạng hòa tan. Kết<br /> quả điện di cho thấy, mẫu protein được cảm ứng<br /> xuất hiện một băng đậm hơn hẳn so với mẫu<br /> không cảm ứng (hình 3). Với dòng tế bào<br /> E. coli mang vector tái tổ hợp pET22b-Ker1,<br /> khi cảm ứng IPTG, protein tái tổ hợp được tổng<br /> hợp có kích thước khoảng 28 kDa (giếng 3).<br /> Dòng tế bào E. coli mang vector pET32a-Ker2<br /> tổng hợp được protein ngoại lai có kích thước<br /> khoảng 36 kDa (giếng 6).<br /> <br /> Hình 3. Điện di protein trên<br /> gel polyacrylamide -SDS ở nồng độ 12,5%<br /> Giếng 1: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b]; Giếng 2: Thang protein chuẩn (14-116<br /> kDa); Giếng 3 Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b-Ker1] được cảm ứng bởi 1 mM IPTG;<br /> Giếng 4: Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3)<br /> [pET22b-Ker1] không cảm ứng IPTG; Giếng 5:<br /> Protein tổng số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a Ker2] không cảm ứng IPTG; Giếng 6: Protein tổng<br /> số từ E. coli BL21(DE3) [pET32a -Ker2] được cảm<br /> ứng bởi 1 mM IPTG.<br /> <br /> Theo các nghiên cứu về biểu hiện gen<br /> keratinase của Gupta & Ramnami (2006) [2],<br /> kích thước protein tạo ra có sự khác nhau tùy<br /> theo nguồn gốc của gen và hệ vector biểu hiện.<br /> Khối lượng phân tử của keratinase khoảng 18200 kDa, ngoại trừ một enzyme đặt biệt từ một<br /> loại nấm gây bệnh. Đối với gen keratinase từ<br /> chủng B. licheniformis, đã có nhiều nghiên cứu<br /> thành công trong việc biểu hiện gen này ở cả<br /> E. coli và tế bào nấm men Pichia đã được công<br /> bố bởi Radha & Gunasekaran (2009) và Hu et<br /> al. (2013) [10, 5]. Kích thước keratinase từ<br /> chủng B. licheniformis khoảng 33 kDa. Tuy<br /> nhiên, theo Hu et al. (2013) [5] khi biểu hiện<br /> gen này với vector pET30a và pET32a trong<br /> <br /> E. coli lại có kích thước 45 kDa và 55 kDa.<br /> Trong nghiên cứu Radha & Gunasekaran (2009)<br /> [10], khi biểu hiện gen này trong nấm men<br /> P. pastoris lại có kích thước khoảng 39 kDa.<br /> Gen keratinase được phân lập từ chủng<br /> B. licheniformis HT10, khi biểu hiện với vector<br /> pET22b trong E. coli, chỉ có kích thước khoảng<br /> 28 kDa, kích thước protein thu được nhỏ hơn<br /> nhiều so với các kích thước đã được công bố.<br /> Chủng B. subtilis là một trong những chủng vi<br /> khuẩn có khả năng thủy phân lông vũ cao nhất<br /> và là nguồn nguyên liệu gen keratinase rất phổ<br /> biến trong nghiên cứu. Kích thước của protein<br /> keratinase từ chủng này cũng có sự khác nhau<br /> trong các công bố trước đây của Suh & Lee<br /> (2001) [14] là 25,4 kDa, kích thước này nhỏ<br /> hơn kích thước 32 kDa được công bố bởi Tork<br /> et al. (2013) [16], nhưng cao hơn với kích thước<br /> 22 kDa đã được công bố bởi Nguyễn Văn Hiếu<br /> và nnk. (2010) [3]. Protein từ chủng B. subtilis<br /> Đ.nđ1.2 trong nghiên cứu của chúng tôi khi biểu<br /> hiện với vector pET32a trong E. coli lại có kích<br /> thước cao hơn, khoảng 36 kDa. Vì vậy, kích<br /> thước protein keratinase tái tổ hợp có sự chênh<br /> lệch có thể do hiện tượng cắt ngắn hoặc biến đổi<br /> trong quá trình hoàn chỉnh protein trước khi ra<br /> khỏi tế bào.<br /> Hoạt tính keratinase tái tổ hợp<br /> Hoạt độ keratinase của chủng E. coli tái tổ<br /> hợp được xác định bằng phản ứng thủy phân cơ<br /> chất azokeratin, đây là một cơ chất đặc hiệu<br /> được sử dụng để đo hoạt tính của enzyme<br /> keratinase và đã được Riffel et al. (2003) và<br /> Zhang et al. (2009) [12, 17] sử dụng. Trong<br /> phương pháp này một đơn vị hoạt động của<br /> enzyme được tính bằng lượng enzyme gây ra sự<br /> thay đổi hấp thụ của 0,01 giá trị OD ở bước<br /> sóng 440nm. Dịch enzyme được thu từ dịch sau<br /> sau biểu hiện của tế bào E. coli mang gen tái tổ<br /> hợp pET22(+)-ker1 và pET32(+)-ker2 được sử<br /> dụng như enzyme (bảng 2).<br /> So với nghiên cứu của Radha &<br /> Gunasekaran (2007) [9], Tiwary & Gupta<br /> (2010) [15] kết quả hoạt độ enzyme khá cao<br /> khoảng trên 70 U/ml, kết quả của chúng tôi có<br /> sự chênh lệch khá lớn. Các nghiên cứu về<br /> keratinase cho thấy, khả năng biểu hiện của gen<br /> này có thể bị ức chế bởi Cd2+, Cu2+, Hg2+, Ni2+,<br /> 55<br /> <br />