Công nghệ tế bào động vật ứng dụng: Phần 2 - Trường ĐH Thủ Dầu Một

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:105

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của tài liệu "Công nghệ tế bào động vật ứng dụng" gồm có Ứng dụng kỹ thuật recombinant dna và tạo dòng gene để điều chế các sản phẩm sinh học; mô da dùng trong dòng hóa; lập trình của di truyền ngoài nhân DNA; xác định tính đa năng của tế bào;...Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 2 dưới đây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Công nghệ tế bào động vật ứng dụng: Phần 2 - Trường ĐH Thủ Dầu Một

CHƯƠNG III LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 3.1. Định nghĩa epigenetic Khái niệm epigenetic được Waddington đưa ra vào năm 1942, lúc này các tính chất vật lý và vai trò di truyền của gene vẫn chưa được khám phá, ông sử dụng epigenetic như là một mô hình khái niệm về cách thức gene có thể tương tác với môi trường xung quanh để tạo ra một kiểu hình. Theo Robin Holliday, định nghĩa epigenetic: “là sự nghiên cứu các cơ chế kiểm soát theo thời gian và không gian hoạt động của gene trong sự phát triển phức tạp của sinh vật”. Như vậy epigenetic có thể được dùng để mô tả bất cứ điều gì khác trình tự DNA có ảnh hưởng đến sự phát triển của một cơ quan. Ngày nay, sự lập trình epigenetic được hiểu là sự thay đổi trong quá trình nguyên phân hay giảm phân mà không gây nên sự thay đổi nào trong trình tự DNA, nhưng tạo ra tác động quan trọng cho sự phát triển thành một cơ thể (Russo và ctv, 1996). 3.2. Cơ sở phân tử của epigenetic Ở sinh vật nhân chuẩn, tồn tại những đặc tính cấu trúc của NST có ảnh hưởng đến sự phiên mã của gene, thường ở dạng thường biến trên DNA hay NST mà vẫn được di truyền ổn định sang các tế bào con. Những đặc tính này được gọi là ngoại di truyền bởi chúng xuất hiện ở ngoài phạm vi trình tự DNA và vẫn được duy trì từ tế bào này sang thế hệ kế tiếp. Bởi có những đặc tính ngoại di truyền, các dạng tế bào khác nhau sinh trưởng trong cùng một môi trường có thể giữ lại những đặc điểm riêng biệt của chúng. Hình 3.1. Khả năng phát triển và trạng thái epigenetic của các tế bào. Mô hình của C. H. Waddington về epigenetic. Các loại tế bào với tiềm năng phát triển khác nhau (trái) và các trạng thái epigenetic tương ứng (phải). Sự hạn chế phát triển được minh họa là những viên bi lăn xuống chỗ lõm. Màu viên bi tương ứng với trạng thái 93
biệt hóa khác nhau (tím – toàn năng, xanh – đa năng, đỏ - vạn năng, xanh lá cây – đơn năng). Quá trình tái lập trình được thể hiện bằng mũi tên đứt đoạn (Waddington, 1957). Cơ sở phân tử của epigenetic rất phức tạp, nó liên quan đến biến đổi kích hoạt gene nhất định, nhưng không thay đổi cấu trúc DNA. Ngoài ra, các protein NST có thể được kích hoạt hoặc tắt. Điều này giải thích tại sao các tế bào khác nhau trong cơ thể sinh vật đa bào chỉ biểu hiện các gene cần thiết cho hoạt động của mình. Epigenetic được bảo tồn khi tế bào phân chia. Hầu hết các thay đổi epigenetic chỉ xảy ra trong mỗi cá thể, nhưng nếu một đột biến DNA trong tinh trùng hoặc trứng khi thụ tinh thì các thay đổi epigenetic sẽ truyền đến thế hệ sau. Điều này đặt ra câu hỏi có hay không sự thay đổi epigenetic trong mỗi sinh vật từ đó thay đổi cấu trúc cơ bản DNA của nó.  Quy trình epigenetic gồm + Paramutation Đặc tính ngoại di truyền nhìn chung mang tính động trong tiến trình phát triển và không được giữ lại ở thế hệ sau của thế hệ kế tiếp, nhưng một số, như hiện tượng cận đột biến (paramutation), vẫn được di truyền qua nhiều thế hệ và tồn tại như những ngoại lệ hiếm hoi nằm ngoài quy luật chung của DNA. Cận đột biến là sự tương tác giữa hai allele của một locus, dẫn đến sự thay đổi di truyền của allele đó gây ra bởi allele khác. + Bookmarking là hiện tượng sinh học có chức năng như một cơ chế ngoại di truyền để truyền bộ nhớ tế bào của các mô hình biểu hiện gene trong tế bào, trong nguyên phân đến các tế bào thế hệ sau. Điều này rất quan trọng trong việc duy trì các kiểu hình trong một dòng tế bào. Ví dụ các tế bào gan phân chia thành tế bào gan và khác các loại tế bào khác. Đặc điểm của bookmarking là một số trình tự khởi đầu phiên mã gene không bị nén chặt. Cơ chế của bookmarking: Tại một số điểm trước khi khởi đầu nguyên phân, promoter của các gene tồn tại trong một trạng thái có chức năng phiên mã, bị "đánh dấu" bằng cách nào đó. “Đánh dấu” này vẫn tồn tại trong và sau khi nguyên phân. Các “đánh dấu” truyền đến bộ nhớ biểu hiện gene bằng cách ngăn cản sự nén chặt của DNA ở locus này trong phân bào, hoặc tạo điều kiện lắp ráp lại các phức hợp phiên mã trên promoter, hoặc cả hai. Trong một số trường hợp, đánh dấu qua trung gian bằng cách liên kết với các yếu tố đặc trưng cho promoter trước khi khởi đầu nguyên phân, nhưng trong một trường hợp khác việc đánh dấu được thực hiện qua trung gian là các mô hình biến đổi của histon hoặc sự hiện diện của các biến thể histon đặc trưng cho các gene hoạt động kéo dài suốt quá trình nguyên phân. 94
Ví dụ: Sự căng thẳng, cảm ứng bởi gene hsp70 bookmarking hoạt động như một cơ chế để đảm bảo các gene này có thể được sao chép vào đầu giai đoạn G1 nếu một căng thẳng xảy ra tại một thời điểm đó. Nếu các promoter gene bị nén chặt ở G1 thì các tế bào không thể phiên mã gene tổng hợp tác nhân bảo vệ tế bào, khiến tế bào tổn thương và chết do stress. + Imprinting là một hiện tượng di truyền mà một số gene được biểu hiện trong một cách cụ thể về nguồn gốc cha mẹ. Gen này in dấu biểu hiện allele thừa hưởng từ mẹ (ví dụ: H19 hoặc CDKN1C), hoặc trong trường hợp khác allele được thừa hưởng từ cha (ví dụ: IGF-2). Gene imprinting là một epigenetic có liên quan đến quá trình methyl hóa và sửa đổi histone. + Gene im lặng là thuật ngữ mô tả các epigenetic do gene quy định. Gene im lặng có khả năng “tắt” các gene của một cơ chế khác với biến đổi gene. Ngoài ra còn các quá trình như: bất hoạt NST X, hiệu ứng vị trí (position effect), lập trình (reprogramming), dị hoán (transvertion), đổi histone,... Các kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu epigenetic: chromatin immunoprecipitation (CHIP), fluorescent in situ hybridization (FISH), methyl hóa – các enzyme giới hạn nhạy cảm, DNA adenine methyltransferase identification (DamID) và trình tự bisulfit, tin sinh học. 3.3. Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu hiện gene Sự cải biên NST bao gồm methyl hóa DNA và histone tại một số vị trí, acetyl hóa, phosphoryl hóa và ubiquitine hóa histone. Sửa đổi histone: protein histone được tạo từ một chuỗi dài các amino acid, nếu các amino acid có trong chuỗi bị thay đổi sẽ dẫn đến hình dạng của histone có thể bị sửa đổi. Các histone sửa đổi sẽ kết hợp với DNA mới theo một cách khác. Từ đó sẽ tạo ra một tế bào sự khác biệt và không chuyển đổi trở lại tế bào gốc. Những nghiên cứu gần đây về chức năng của NST cho thấy có sự liên hệ chức năng cao của protein cấu trúc NST là histone H1 và HP1 (heterochromatin associated protein) khi so sánh giữa NST của những tế bào vạn năng và NST của những tế bào đã biệt hóa. Khi histone H1 thay cho vị trí của histone H3 thì liên kết trong NST chặt hơn ở những tế bào ES biệt hóa. Điều này cho thấy protein cấu trúc liên kết lỏng lẻo với NST trong tế bào vạn năng, nên có khả năng tái sắp xếp lại cấu trúc NST trong quá trình biệt hóa. Ngoài ra, gene đặc hiệu mô được cho là im lặng trong tế bào chưa biệt hóa có thể ít nhiều biểu hiện trong tế bào ES. Có một domain vừa ngăn cản histone H3-K27me3 (methyl hóa lysine 27 của histone 3) vừa kích hoạt H3-K4me3 làm cải biên những vùng rộng lớn những gene quan trọng mà bình thường im lặng trong tế bào ES trở thành hoạt động dưới quá trình biệt hóa. Điều quan trọng là không phải tất cả những gene đặc hiệu mô đều có những domain này, và cấu trúc NST cơ bản trong những gene này và sự tái cấu trúc của nó trong sự vạn năng còn những đặc trưng khác nữa. 95
Methyl hóa DNA: là một cơ chế chung khác điều khiển sự phiên mã ở động vật có xương sống, nó có liên quan đến cấu trúc của NST. Những phần dư cytosine trong DNA của động vật có xương sống có thể bị biến đổi bằng việc thêm vào các nhóm methyl tại vị trí carbone số 5 của base nitơ. DNA được methyl hóa tại những cặp C-G. Sự methyl hóa này có liên quan tới việc giảm hoạt tính phiên mã của những gen chứa nhiều C-G trong vùng lân cận của những promoter. Sự methyl hóa ức chế phiên mã những gen này nhờ vào hoạt động của một protein. MeCP2 (methyl CpG binding protein 2) nối một cách đặc hiệu tới DNA đã được methyl hóa và kìm hãm sự phiên mã. Những chức năng của MeCP2 như là một phức hệ với histone deacetylase, kết hợp với sự methyl hóa DNA dẫn đến những biến đổi trong acetyl hóa histone và cấu trúc nucleosome. Sự khử methyl hóa chủ động (active demethylation) xảy ra khi vắng mặt các nhân tố phiên mã hay sao chép DNA. Do đó đây còn được gọi là bước suy tàn của sự methyl hóa cho đến giai đoạn phôi dâu. Quá trình suy giảm này là kết quả thiếu vắng DNA methyl transferase, Dnmt1, trong suốt quá trình sao chép. Bởi vậy, sau khi sao chép mạch DNA mới vừa được tạo ra sẽ nhanh chóng bị methyl hóa. Sự mất khả năng methyl hóa phụ thuộc và sự sao chép được gọi là sự khử methyl bị động (passive demethylation). Khởi sự quá trình methyl hóa bắt đầu vào chu kì tế bào thứ năm cùng với thời gian sau biệt hóa xảy ra. Hình 3.2. Sự khử methyl DNA của các gene quan trọng. (A) Thành lập mô hình methyl hóa DNA thụ động, quá trình sao chép bởi sự cản trở của Dnmt do sự ràng buộc ngẫu nhiên của các yếu tố tái lập trình đến các vị trí mục tiêu hoặc bằng cách ức chế chức năng Dnmt1 gián tiếp. Hemi-methylated DNA sẽ dẫn đến mất methyl hóa sau khi chu kì phân chia tế bào tiếp tục. (B) Methyl hóa DNA chủ động bởi enzyme demethylase (Azuara V., 2007). Mặc dù sự methyl hóa DNA có thể ức chế sự phiên mã, nhưng ý nghĩa của nó trong sự điều hòa gene là chưa rõ ràng. Tuy nhiên, sự methyl hóa DNA có vai trò quan trọng của trong hiện tượng “in dấu hệ gene” (genomic imprinting), điều khiển sự biểu 96
hiện của một số gene tham gia trong quá trình phát triển phôi ở động vật có vú. Các allele có nguồn gốc từ bố và mẹ đều được biểu hiện trong tế bào lưỡng bội. Tuy nhiên, có một vài “gene được in dấu” biểu hiện phụ thuộc vào sự di truyền của chúng từ bố hay từ mẹ. Hoặc chỉ có gene được đánh dấu thuộc allele có nguồn gốc từ bố mới được biểu hiện. Một số trường hợp khác thì ngược lại. Mặc dù vai trò sinh học của “genomic imprinting” chưa điển hình, nhưng sự methyl hóa DNA góp phần phân biệt những “gene được đánh dấu” có nguồn gốc từ bố hay từ mẹ. Ví dụ gene H19 chỉ được phiên mã từ bản sao của mẹ. Gene này được methyl hóa một cách đặc hiệu trong suốt quá trình phát triển của con cái, ở con đực thì không. Vì thế, sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng trong thụ tinh sinh ra hợp tử, phát triển thành phôi chứa một allele được methyl hóa có nguồn gốc từ bố và một allele có nguồn gốc từ mẹ không được methyl hóa. Những khác nhau này trong sự methyl hóa được duy trì trong tái bản DNA nhờ vào một enzyme methyl hóa những trình tự CG của mạch DNA thế hệ con, mạch này được liên kết với một mạch được methyl hóa có nguồn gốc từ bố. Vì thế, allele chứa gen H19 có nguồn gốc từ bố vẫn duy trì sự methyl hóa, không hoạt động phiên mã trong những tế bào phôi và những mô soma. Tuy nhiên, allele chứa gen H19 có nguồn gốc từ bố được khử methyl trong dòng tế bào mầm phôi, cho phép một mô hình mới của sự methyl hóa được thiết lập cho thế hệ tiếp theo. 3.4. Các vấn đề cần quan tâm Sự tái lập trình ngoài nhân không phù hợp dẫn đến những hậu quả bất thường nguy hiểm đến sức khỏe động vật chuyển nhân. Phôi từ nguồn tế bào chuyển nhân phải được khử methyl và có mức độ methyl hóa cao trong nhân cho để duy trì tính vạn năng. Sự phân chia sớm bị sai lệch của phôi chuyển nhân chiếm tỷ lệ cao có thể do thiếu sự khử methyl. Trong tạo dòng từ chuyển nhân, việc tái lập trình epigeneetic cần được quan tâm. Để những cá thể tạo dòng này phát triển hoàn toàn, những gene được biểu hiện bình thường trong suốt quá trình phát triển phôi, những “im lặng” trong tế bào soma cho phải được tái kích hoạt. Hiện nay, hiệu quả của những clone từ động vật còn thấp và độc lập với nguồn gốc của loại tế bào được sử dụng để cho nhân, trừ một vài ngoại lệ. Những bất thường epigenetic hiện diện trong những clone là nguyên nhân gây ra các kiểu hình bất thường trên những động vật clone. Những nhân được phân tách từ tế bào ES và những phôi ở thời kỳ đầu của những clone có hiệu quả cao hơn so với bất kỳ loại tế bào soma cho nào khác. Như vậy, bộ gene của những tế bào trong thời kỳ đầu dễ dàng cho việc tái lập trình hơn so với tế bào soma. Bởi vì những yếu tố cần thiết trong việc tái lập trình được biểu hiện từ đó làm cho một tế bào tạo dòng có thể sống sót. 97
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Byrne E., Howells D. W. 2003. Stem cell therapies: a table of caution. MJA. 179:164-166. 2 Kirschstein R., Skirboll L. R. (2001). Stem cells: Scientific Progress and Future Research Direction. Report of The national Institutes of Health (US). 3 Lerman S. 2005. Stem cell research: an overview. Pushin’s On. 23 (1) 4 Nisbet M. C. (2004). Public opinion about stem cell researh and human cloning. Public Opinion Quarterly. 68(1): 121-154 5 Reya T. R., Morrision S. J., Clark M. R., Weissman I. L. (2001). Stem cells, cancer and cancer stem cells. Nature 144 (1). www.nature.com 6 Rosenfeld J. V., Gillet G. R. Ethics, stem cells and spinal cord repair. G. 2004. MJA. 180:637-639 98
CHƯƠNG IV XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO Trong vài thập kỷ gần đây, chúng ta đã được biết nhiều thành tựu quan trọng trong nghiên cứu về tế bào gốc, tính đa năng của tế bào và nhân bản cũng như những tranh cãi về đạo đức trong nghiên cứu lĩnh vực này. Nghiên cứu về tế bào gốc, tính đa năng của tế bào và nhân bản trang bị cho chúng ta những hiểu biết về quá trình hình thành cơ thể sinh vật từ một tế bào đơn lẻ và quá trình các tế bào khỏe mạnh thay thế các tế bào bị tổn thương trong các cơ thể trưởng thành, mang lại cho nhân loại hy vọng chữa được nhiều bệnh mãn tính và nan y mà hiện nay chưa có biện pháp điều trị hiệu quả. Trong thế kỷ 21, nhân loại đang đón đợi liệu pháp điều trị thay thế tế bào hay tế bào gốc trị liệu. Các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật đã chứng minh liệu pháp điều trị mới này là có thể và đã có nhiều bằng chứng cho phép chúng ta hy vọng vào triển vọng của tế bào gốc người. Tuy nhiên, công việc này mới đang ở giai đoạn đầu tiên và gặp không ít khó khăn về kỹ thuật cũng như các vấn đề liên quan đến đạo đức và pháp lý. Để biết rõ hơn tính đa năng của tế bào và vai trò to lớn của tính đa năng đó thì trước tiên chúng ta cần tìm hiểu tế bào nào là tế bào đa năng, và tại sao được gọi là tế bào đa năng. Để trả lời câu hỏi đó chúng ta tìm hiểu một số khái niệm về tế bào gốc, tế bào đa năng, tế bào toàn năng. 4.1. Khái niệm Tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa, có thể tự tái tạo (self renew) và phân chia nhiều lần. Trong những điều kiện sinh lý, thực nghiệm nhất định, tế bào gốc có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt như tế bào cơ tim, tế bào tuyến tụy, tế bào da, tế bào máu, tế bào thần kinh,… 4.2. Phân loại tế bào gốc Có hai phương pháp phân loại đó là theo nguồn gốc phân lập và theo mức độ biệt hóa. Theo nguồn gốc, tế bào gốc chia thành hai loại là tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành. Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) được lấy từ phôi, phôi thụ tinh trong ống nghiệm hoặc phôi được chuyển cấy nhân. Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell) bao gồm các loại: tế bào gốc trưởng thành của tủy xương, tế bào gốc trưởng thành của hệ thần kinh, tế bào gốc của mô máu, tế bào tiền thân trong da, tế bào gốc trong tụy và gan, tế bào gốc trong mô mỡ, cuống rốn và nước nhau. Theo mức độ biệt hóa có thể xếp tế bào gốc thành bốn loại: toàn năng (hay thủy tổ), vạn năng, đa năng và đơn năng. + Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ (totipotent stem cells) Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể từ một tế bào ban đầu. Tế bào toàn năng có khả năng phát triển thành thai nhi, tạo nên một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Trứng đã thụ tinh (hợp tử) và các tế bào được sinh ra từ những lần phân chia đầu tiên của tế bào trứng đã thụ tinh (giai đoạn 2 - 4 tế bào – 99
các blastosomer) là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phân chia và biệt hóa ra tất cả các dòng tế bào để tạo nên một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Các tế bào toàn năng có tiềm năng to lớn, chúng chuyên biệt hóa thành các tế bào vạn năng của những mô cần thiết cho sự phát triển của bào thai. Quan trọng hơn, tế bào toàn năng có thể biệt hóa không chỉ thành bất kỳ tế bào nào ở sinh vật mà còn thành các tế bào ngoài phôi liên quan đến sinh vật đó. Ví dụ: tế bào mầm ở người chỉ được xem là toàn năng nếu chúng phát triển thành bất cứ tế bào nào bên trong cơ thể hay thành các tế bào nhau thai mà không trở thành thành phần của bào thai đang phát triển. Điều này là một hướng quan trọng mở ra những cuộc tranh cãi mới. + Tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells) Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào của cơ thể có nguồn gốc từ ba lá mầm phôi là lá trong, lá giữa và lá ngoài. Ba lá mầm phôi này là nguồn gốc của tất cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể. Khác với tế bào gốc toàn năng, các tế bào gốc vạn năng không thể phát triển thành thai, không tạo nên được một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh mà chỉ có thể tạo nên được các tế bào, mô nhất định. Các tế bào gốc phôi lấy từ khối tế bào bên trong (inner cell mass) là những tế bào gốc vạn năng. + Tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells) Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể từ một tế bào ban đầu. Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ chỉ tạo nên các tế bào máu (bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu lympho…), hoặc chỉ tạo nên các tế bào của hệ thống thần kinh. Thường thì các tế bào gốc trưởng thành như tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc thần kinh chỉ có tính đa năng; nhưng trong những điều kiện nhất định, chúng vẫn có thể chuyển biệt hóa và trở nên có tính vạn năng. Hình 4.1. Tế bào gốc toàn năng, vạn năng và đa năng (Azuara V., 2006) + Tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells) 100
Tế bào gốc đơn năng, còn gọi là tế bào định hướng đơn dòng hay tế bào đầu dòng (progenitor cells), là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một dòng. Ví dụ mẫu tiểu cầu, tế bào định hướng dòng lympho, tế bào định hướng dòng hồng cầu, dòng bạch cầu... Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều tổ chức đã biệt hóa có tính đơn năng và có thể biệt hóa thành chỉ một dòng tế bào. Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào mô mới. 4.3. Đặc điểm sinh học 4.3.1. Tính vạn năng Tế bào gốc vạn năng, hay đa năng (pluripotent) có khả năng biệt hóa ra tất cả tế bào của cơ thể mà bình thường chúng được phát sinh từ ba lớp phôi, trừ các tế bào nhau thai. Để thẩm định tính đa năng của tế bào, người ta đã tiến hành dùng tế bào gốc phôi (mES) để thẩm định tính đa năng với ba thử nghiệm như sau: Thử nghiệm 1: tiêm mES vào khoang của phôi nang (blastocyst). Sau đó, phôi nang được chuyển vào tử cung của mẹ giả. Nếu các mSE là vạn năng, thế hệ con sẽ khảm, bởi nó chứa trộn lẫn các mô và cơ quan thu nhận từ cả những mSE và những tế bào có sẵn của phôi nang thu nhận. Trong một vài trường hợp, một thai có thể được tạo ra hoàn toàn từ các mES. Tuy nhiên, các tế bào mSE không thể tự nó hình thành nhau thai bởi các tế bào lá nuôi phôi lại có từ nguồn gốc khác (Nagy và cs, 1993). Thử nghiệm 2: tiêm mES vào tinh hoàn hay dưới da, hoặc vỏ thận của động vật khiếm khuyết miễn dịch. Nếu có tính đa năng, sau khi tiêm các tế bào bắt đầu hình thành khối u (teratoma) chứa các mô khác nhau phát sinh từ cả ba lá phôi. Một số cấu trúc như dạ dày, các lọai cơ, mô thần kinh, xương và tóc được hình thành nhưng chúng sắp xếp một cách rối loạn (Martine, 1981) Thử nghiệm 3: là biệt hóa in vitro (Wiles, 1993). Sự biệt hóa tự phát có thể xảy ra nếu các tế bào mES được nuôi trong huyền phù không có tế bào feeder hay nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (leukemia inhibitory factor - LIF). Chúng sẽ hình thành nhiều thể phôi (embryoid body). Nếu các thể phôi bám được đĩa nuôi, chúng sẽ biệt hóa thành nhiều kiểu mô, các khối u,... 4.3.2. Tính tự làm mới Tế bào gốc trong bất kì mô nào cũng là một quần thể có khả năng tự làm mới. Để đạt được điều này, mỗi tế bào gốc sẽ phân chia thành một tế bào gốc thay thế và một tế bào gọi là TAC (transit amplifying cell), do sự phân chia không đồng đều. bằng cách này, số lượng tế bào gốc được giữ hằng định. 4.3.3. Tính mềm dẻo Tính mềm dẻo của tế bào gốc trưởng thành là khả năng tế bào gốc trưởng thành có thể tạo ra kiểu tế bào biệt hóa của những mô khác. Các tế bào đã biệt hóa từ tính mềm dẻo thường có các đặc điểm kiểu hình của các tế bào đã biệt hóa, và biểu hiện các đặc điểm này lên marker bề mặt. 4.4. Những ứng dụng tính đa năng của tế bào 4.4.1. Trong nghiên cứu cơ bản 101
Để tìm hiểu về các tác nhân tham gia vào quá trình quyết định tế bào, tức là quá trình xác định hướng biệt hóa của tế bào. Ta biết sự đóng mở gene có vai trò quan trọng trong quá trình này, tuy nhiên còn biết ít số lượng các loại gene, tác nhân nào đóng, tác nhân nào mở. Đây là phương pháp rất quan trọng trong việc tạo cho một tế bào đã qua thao tác gene phát triển thành cơ thể. Các thao tác gene có thể là thay thế gene này bằng gene khác, đánh bật gene,... 4.4.2. Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) Là dùng tế bào gốc để thay thế, sửa chữa các phần cơ thể bị bệnh và tổn thương bằng các tế bào mới khỏe mạnh. Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật ghép tế bào trị liệu (cell transplantation therapy) hay kỹ thuật thay thế tế bào trị liệu (cell replacement therapy). a. Quy trình ứng dụng tế bào gốc trị liệu bao gồm các bước: - Sản xuất dòng tế bào gốc: + Thu tế bào gốc: từ phôi hoặc từ tổ chức trưởng thành. + Nuôi cấy các tế bào gốc này trong phòng thí nghiệm nhằm nhân lên về số lượng. - Với tế bào gốc phôi, cần nuôi cấy nhân tạo trong các điều kiện môi trường lý hóa thích hợp để định hướng biệt hóa thành các tế bào mong muốn. - Ghép tế bào gốc: đưa các tế bào gốc này vào các khu vực tổn thương cần sửa chữa. b. Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành trong điều trị Trên lâm sàng, tế bào gốc trưởng thành đã được sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn, tai biến mạch máu não, suy giảm miễn dịch, thiếu máu, nhiễm Estein-barr virus, tổn thương giác mạc, các bệnh máu và bệnh gan, tạo xương không hoàn chỉnh, tổn thương tủy sống, liền vết thương da, điều trị ung thư (kết hợp với hóa chất và xạ trị), u não, u nguyên bào võng mạc, ung thư buồng trứng, các khối u đặc, ung thư tinh hoàn, đa u tủy, ung thư vú, u nguyên bào thần kinh, u lympho Non-Hodgkin, carcinoma tế bào thận, tái tạo cơ tim sau cơn đau tim, tiểu đường type I, tổn thương xương và sụn, bệnh Parkinson,… c. Ứng dụng tế bào gốc phôi trong điều trị Tuy có nhiều triển vọng, các tế bào gốc phôi chưa được dùng trong tế bào gốc trị liệu trên người. Các bệnh có thể được điều trị bằng ghép các tế bào có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi người bao gồm bệnh Parkinson, đái tháo đường, chấn thương tủy sống, suy tim… Vấn đề là khi điều trị các bệnh này yêu cầu tế bào gốc phôi phải được định hướng biệt hóa thành các chủng loại tế bào đặc thù trước khi ghép. Một ưu điểm của dùng tế bào gốc phôi so với tế bào gốc trưởng thành là các tế bào gốc phôi có khả năng tăng sinh không giới hạn in vitro và có khả năng sinh ra nhiều chủng loại tế bào hơn khi được định hướng biệt hóa. Ưu thế này sẽ tăng lên nếu như trong quá trình ghép tế bào/mô, các tế bào gốc phôi không gây kích hoạt quá trình 102
thải ghép do miễn dịch. Có thể tránh tính sinh miễn dịch của các tế bào phát triển từ tế bào gốc phôi người bằng chuyển gene cơ thể nhận vào các tế bào gốc phôi làm cho chúng mang các phân tử kháng nguyên hòa hợp tổ chức (MHC) lớp I của cơ thể nhận, hoặc bằng kỹ thuật chuyển nhân để tạo ra các tế bào gốc phôi đồng nhất về gene với người nhận mô ghép. Nhược điểm của dùng tế bào gốc phôi cho ghép trị liệu là dễ hình thành các khối u teratoma. Điều này làm cho tế bào gốc phôi chưa được sử dụng trong ghép tế bào gốc trị liệu trên lâm sàng. Hiện đã có một số phương pháp nhằm loại bỏ các tế bào gốc phôi không biệt hóa trước khi ghép cho phép có thể tránh việc hình thành các khối u teratoma trên cơ thể nhận. 4.5. Phương pháp thu nhận tế bào gốc Hiện nay có 2 phương pháp:  Phương pháp của tiến sỹ James Thomson thuộc Đại học Wincosin (Học Kỳ) Các tế bào gốc vạn năng được tách rời trực tiếp từ các tế bào ICM của phôi trong giai đoạn phôi nang (blastocyst). Sau đó đem cấy vào một môi trường thích hợp, với những điều kiện thiết yếu cho việc phát triển, dần dần chúng sẽ sản xuất một loại tế bào gốc vạn năng.  Phương pháp của tiến sỹ Gearhart, thuộc Đại học Y Khoa – Harvard, Hoa Kỳ. Tách biệt các tế bào gốc vạn năng từ các mô của bào thai đã được hủy, vì không muốn tiếp tục nuôi dưỡng hoặc vì những lý do khác. Ông chọn những tế bào thuộc các vùng của bào thai mà biết chắc rằng sau này, chúng sẽ phát triển thành tinh hoàn hoặc buồng trứng. Mặc dù có sự khác biệt về hai nguồn cung cấp chất liệu để tạo nên các tế bào gốc vạn năng nhưng kết quả của việc hình thành các tế bào gốc này rất giống nhau. Người ta cũng đã tìm thấy tế bào gốc từ cuống rốn (umbilical cord) hoặc từ nhau thai (placenta) của các trẻ em sơ sinh, răng sữa của trẻ em, nước màng ối (amniotic fluid). Tất cả các tế bào gốc này đều có tiềm năng để biến hóa và trở thành các loại tế bào khác nhau với các chức năng khác biệt. Việc nghiên cứu về tế bào gốc ngày càng mở ra nhiều hướng đi mới với nhiều kết quả khả quan. Điều này hứa hẹn trong tương lai tế bào gốc sẽ được dùng để chữa trị được những căn bệnh nan y mà y học hiện nay đang lâm vào bế tắc. 103
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Azuara V., 2006. Profiling of DNA replication timing in unsynchronized cell populations. Nat Protoc. 1(4):2171-7. 2. Baba, Y., Garrett, K. P. and Kincade, P. W., 2005. Constitutively Active [beta]- Catenin Confers Multilineage Differentiation Potential on Lymphoid and Myeloid Progenitors. Immunity 23: 599-609. 3. Bartolomei, M.S., Zemei, S. and Tilghman, S.M. (1991). Parental imprinting of the mouse H19 gene. Nature, 351: 153–155. 4. Bortvin A, Eggan K, Skaletsky H, Akutsu H, Berry DL, Yanagimachi R, Page DC, Jaenisch R, 2003. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei. Development 130(8):1673-80. 5. Ding, S. and Schultz, P. G., 2004. A role for chemistry in stem cell biology. Nat Biotech 22: 833-840. 6. Gurdon J.B. and Melton D.A., 2008. Nuclear Reprogramming in Cells. Science 322: 1811-1815. 7. Konrad Hochedlinger and Kathrin Plath, 2009. Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development 136: 509-523 8. Martin, G.R., 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 78: 7634-7638. 9. Martins, S. B., Eide, T., Steen, R. L., Jahnsen, T., Skalhegg, B. S. and Collas, P., 2000. HA95 is a protein of the chromatin and nuclear matrix regulating nuclear envelope dynamics. J Cell Sci 113(21): 3703-13. 10. Matsumura, H., Tada, M., Otsuji, T., Yasuchika, K., Nakatsuji, N., Surani, A. and Tada, T., 2007. Targeted chromosome elimination from ES-somatic hybrid cells. Nat Meth 4: 23-25. 11. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C., 1993. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 8424-8428. 12. Nguyễn Anh Trí & Lê Xuân Hải, Tế bào gốc và nhân bản. Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương. www.nihbt.org.vn. 13. Nguyễn Mộng Hùng, 2004. Công nghệ tế bào phôi động vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 14. Phan Kim Ngọc - Phạm Văn Phúc, 2010. Công nghệ sinh học trên người và động vật. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 104
15. Russo V.E.A., Martienssen R.A., Riggs A.D., 1996. Epigenetic mechanisms of gene regulation. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY. 16. Suresh Kumar Swaminathan, 2007. Screening for nuclear reprogramming factors and analysis of DNA demethylation during in vitro myoblasts ifferentiation. Dissertation doctor of natural sciences, Combined Faculties for The Natural Sciences and for Mathematics of The Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany. 17. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C. and Surani, M. A., 1997. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybridcells. Embo J 16: 6510-6520. 18. Taranger, C. K., Noer, A., Sorensen, A. L., Hakelien, A.-M., Boquest, A. C. and Collas, P., 2005. Induction of Dedifferentiation, Genomewide Transcriptional Programming, and Epigenetic Reprogramming by Extracts of Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Mol. Biol. Cell 16: 5719-5735. 19. Waddington C. H.,1957. The Strategy of the Genes. London: Geo Allen and Unwin. 20. Wiles M V, 1993. Embryonic stem cell differentiation in vitro Meth. Enzymol 225900- 918. 105
CHƯƠNG V CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT Quá trình biệt hóa tế bào là quá trình các tế bào toàn năng tạo thành các tế bào có chức năng. Nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động vật là tìm hiểu cơ sở di truyền phân tử, tức là nền tảng của sự phát triển cơ thể đa bào từ một tế bào duy nhất có tính toàn năng là tế bào hợp tử, đặc biệt là nghiên cứu sự liên quan của các đại phân tử: DNA, RNA và protein. 5.1. Protein điều hòa Sự biểu hiện gene chịu sự kiểm soát của các cơ chế điều hòa. Các cơ chế điều hòa đó giữ vai trò rất quan trọng cho hoạt động sống, đáp lại các biến đổi của môi trường bên trong và ngoài cơ thể. Việc điều hòa được thực hiện ở nhiều mức độ khác nhau. Trong sự biệt hóa tế bào, ở sinh vật bậc cao, con người chứa nhiều tỷ tế bào bắt nguồn từ một hợp tử do phân chia nguyên nhiễm. Từ một hợp tử ban đầu cho đến khi trưởng thành, cơ thể con người có khoảng 200 loại tế bào khác nhau (tim, gan, thận, da…). Mỗi loại tế bào chỉ biểu hiện một phần thông tin của mình. Quá trình chuyên môn hóa chức năng của tế bào gọi là sự biệt hóa. Ở các sinh vật bậc cao cũng như ở con người, cơ thể trưởng thành gồm nhiều loại tế bào khác nhau. Các tế bào này đều bắt nguồn từ một hợp tử ban đầu, nhưng đã qua quá trình biệt hóa làm chức năng khác. Trong quá trình biệt hóa tế bào đến những tế bào chuyên biệt. Nhiều quá trình là chung cho tất cả các tế bào nên có nhiều protein giống nhau. Những protein này có số lượng nhiều như các protein cấu trúc của vách tế bào và nhiễm sắc thể. Một số protein căn bản của các bào quan (lưới nội chất, bộ máy golgi, các ribosome…). Những enzyme cũng là loại protein tham gia vào các phản ứng trung tâm của quá trình trao đổi chất. Bên cạnh đó còn có số lượng lớn tế bào chuyên hóa như hemoglobin chỉ có ở tế bào máu. Phần lớn các tế bào chuyên hóa của sinh vật đa bào có khả năng thay đổi phương thức biểu hiện gene để đáp lại các tác động bên ngoài. Các kiểu tế bào biệt hóa khác nhau thường phản ứng lại cùng một tín hiệu bên ngoài bằng nhiều cách khác nhau. Trên cơ sở đó, mỗi kiểu tế bào biệt hóa có một đặc tính ổn định thường xuyên. Các tính chất đó phản ánh sự biểu hiện lâu bền của các nhóm gene khác nhau. Các tế bào biệt hóa chỉ sử dụng một phần thông tin, nhiều loại tế bào chuyên hóa tổng hợp chủ yếu một số protein, ngoài các protein cấu trúc và các protein căn bản sử dụng cho các quá trình sinh lý bình thường.  Sự điều hòa ở mức phiên mã là nguồn gốc căn bản của các sai khác giữa những biệt hóa: 106
 Giả thiết được chấp nhận hiện nay là trong các tế bào biệt hóa số gene phiên mã, còn các gene khác thì không. Đối với phần lớn gene: kiểm soát phiên mã có tầm quan trọng hàng đầu vì sự kiểm soát đó đảm bảo cho sự tổng hợp không dư thừa các chất trao đổi.  Việc phát hiện có gene điều hòa và các gene đóng hoặc mở giúp hiểu được sự điều hòa quá trình phát triển cá thể và biệt hóa tế bào.  Trong sự biểu hiện của gene về căn bản đều được điều hòa nhưng đối với phần lớn các gene việc khởi sự phiên mã là điểm kiểm soát quan trọng nhất.  Nhờ các cơ chế điều hòa, cơ thể thực hiện đều đặn và hợp lý chương trình phát triển cá thể và thích nghi với điều kiện ngoại cảnh. Ở các sinh vật eukaryote có nhiều cơ chế điều hòa phức tạp, các nhân tố cis (enhancer) và các nhân tố trans, các hormone. Ngoài ra còn có một số gene và sự khuếch đại một số gene cần thiết cho hoạt động của tế bào. Sự biệt hóa tế bào được thực hiện chủ yếu sự điều hòa ở mức phiên mã. Sự biệt hóa của tế bào liên quan đến sự biểu hiện của gene, được kiểm soát ở mức độ khác nhau.  Các yếu tố điều hòa cis là nơi cố định yếu tố điều hòa trans. Nói cách khác: yếu tố điều hòa cis là đích của yếu tố điều hòa trans. Yếu tố điều hòa trans là protein liên kết với chất không có bản chất protein.  Khi một yếu tố điều hòa trans cố định trên một yếu tố điều hòa cis, mức độ sao mã tăng mạnh (điều hòa dương) nhưng đôi khi cũng giảm (điều hòa âm).  Điều hòa trans: là chỉ sự điều hòa được kiểm soát bởi các yếu tố điều hòa trans là các protein. Một vài protein kết hợp với CCAAT đã được xác định ở tế bào động vật hữu nhũ. Các nhân tố này có thể được phân biệt giữa các đơn vị của các phần tử CCAAT. Các hộp GC được nhận biết bởi các nhân tố phụ. Các nhân tố trans có đặc điểm chung là gồm ít nhất hai vùng cấu trúc và chức năng:  Vùng gắn với trans vào DNA  Vùng tác động lên sự phiên mã - Các nhân tố trans có 4 kiểu tác động như:  Ngón tay kẽm (zinc-finger)  Xoắn - nút - xoắn (helix-loop-helix)  Xoắn - vùng - xoắn (helix-turn-helix)  Dây kéo leucine (leucine-ziper) - Đặc tính chung của các cấu trúc vừa kể là chúng luôn luôn gắn lên các trình tự cis dưới dạng dimer (gồm 2 monomer). Giữa trình tự cis và nhân tố trans thường có các tương tác đặc hiệu do những liên kết yếu hình thành giữa các phân tử của nhân tố trans với các base của trình tự cis. 107
- Nhiều protein có tác động trans tham gia vào tiến trình phát triển của cơ thể Drosophisla, chúng có vai trò đặc biệt trong xác định sự sắp xếp các đoạn thân của ruồi. - Các gene của sinh vật eukaryote được hoạt hóa bởi hai trình tự DNA có tác động cis là promoter và enhancer, chúng được nhận biết các nhân tố protein có tác động trans. Các nhân tố trans này cho phép RNA polymerase khởi sự phiên mã và đạt tốc độ phiên mã tối đa.  Trong sự điều hòa trans, vai trò của hormone cũng rất quan trọng Các hormone có vai trò đặc biệt trong sự điều hòa trans. Ta phân biệt 3 kiểu hormone sau:  Các hormone hòa tan trong lipid (như thyroxine) có thể khuếch tán qua màng, di chuyển vào nhân và cố định trên các thể nhận trong nhân để giúp các thể nhận này cố định trên các trình tự nhận biết của DNA (như TRE – thyroxine responsive element).  Các hormone hòa tan trong nước (như adrenaline) không thể xuyên qua lớp phospholipid màng nguyên sinh chất. Các hormone này chỉ cố định trên thể nhận của màng và truyền tín hiệu hormone, thông tin thứ nhất vào tế bào chất, bằng cách hoạt hóa sự tổng hợp một thông tin thứ hai, cAMP. Khi vào trong nhân, cMAP dính vào một yếu tố sao chép có bản chất protein, giúp yếu tố này cố định trên môt trình tự chuyên biệt gọi là CRE (hay cAMP-RE = cAMP responsive element) và hoạt hóa sự sao mã.  Vài hormone (như insuline) hoạt động theo cách phức tạp, bằng cách cảm ứng sự tự phosphoryl hóa để có thể liên kết với một trình tự DNA chuyên biệt và hoạt hóa sự sao mã. Các hormone thường được vận chuyển đến các phần của cơ thể nhưng chỉ tác động đến các tế bào có các thụ thể (receptor) tương ứng. Sự tương tác giữa hormone với thụ thể gây ra tín hiệu tác động đến các vùng đặc hiệu của DNA làm hoạt hóa gene hoặc nhóm gene tương ứng. Các hormone có thể kích thích phiên mã bởi một trong các cơ chế sau:  Hormone có thể làm cho DNA tách khỏi histone và tạo điều kiện cho RNA polymerase bắt đầu phiên mã.  Có thể làm chất cảm ứng (inducer) gây bất hoạt phân tử receptor  Có thể gắn trực tiếp với đoạn DNA đặc hiệu tạo ra thuận lợi cho sự gắn kết RNA polymerase hoặc protein là nhân tố phiên mã.  Có thể hoạt hóa effector protein làm thành phức hợp gắn lên DNA và kích thích sự gắn kết RNA polymerase.  Có thể gắn với protein tạo phức hợp hoạt hóa kích thích sự gắn kết RNA polymerase. 108
Tác động của hormone estrogen là một ví dụ về tín hiệu hormone. Khi phôi phát triển trải qua các lần phân chia liên tiếp, các gene khác nhau phải được hoạt hóa trong các tế bào khác nhau ở các thời điểm khác nhau, dẫn tới các nhóm tế bào khác nhau trong các loại mô. Trong các lần phân chia lặp lại từ hợp tử đơn bào, các tế bào phân hóa để trở nên chuyên hóa trong trong một cơ thể đa bào. Một kiểu tế bào đã phân hóa (tế bào cơ, tế bào thần kinh, tế bào máu...) có cấu trúc thích hợp để tiến hành các chức năng riêng biệt. Sự phân hóa tế bào đòi hỏi sự kiểm soát biểu hiện gene chính xác và tinh tế. Protein activator ở sinh vật eukaryote mở gene bằng cách dính vào các trình tự chuyên biệt của DNA ở bên cạnh promoter và RNA polymerase nhận biết các activator để có thể bắt đầu sự sao mã. Activator dính vào enhancer, cho phép activator tương tác với nhân tố sao mã kết hợp với các RNA polymerase, dẫn tới sự hoạt hóa sao mã. Một số activator hoạt động bằng cách tương tác trực tiếp với phức hợp khởi đầu hay các coactivator. Các coactivator có thể làm biến đổi cấu trúc chromatin bằng cách gắn nhóm acetyl vào các acid amin. Sự thay đổi này làm giảm sự nén chặt, giúp DNA có thể tiếp nhận các yếu tố sao mã. Như vậy, DNA có thể sao mã khi các nucleosome vẫn tồn tại với điều kiện các histone bị acetyl hóa. Ngoài ra, coactivator còn là nhân tố sao mã truyền dấu hiệu từ protein activator tới các nhân tố căn bản. 5.2. Methyl hóa DNA Ngoài sự nén chặt, DNA của động vật hữu nhũ hay thực vật bậc cao bị methyl hóa. Cả hai hiện tượng đều ngăn cản sự biểu hiện gene.  Methyl hóa cytosine Nhiều người trước đây cho rằng sự methyl hóa có vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gene ở tế bào động vật có xương sống, vì DNA của một gene nào đó không bị methyl hóa trong tế bào sản xuất protein được mã hóa bởi gene này, nhưng DNA của gene này bị methyl hóa trong tế bào không sản xuất cùng loại protein. Chỉ có một base có khả năng bị methyl hóa là cytosine để cho 5- methyl cytosine. Sự methyl hóa xảy ra trên C5, và thường trên các dinucleotide CG. Vì nhóm methyl có vị trí trên, nên không gây xáo trộn cho cầu nối hydrogene của các cặp CG, tương tự như sự gắn nhóm methyl vào uracil để cho thymine không ảnh hưởng tới sự bắt cặp base với adenine. Hình 5.1. Sự methyl hóa cytosine (Alberts, B. và ctv.)  Sự methyl hóa DNA và hoạt hóa gene Sự methyl hóa xảy ra ở vi khuẩn, thực vật, động vật. Sự cải biến DNA là loại cải biến hóa học của DNA. Sự cải biến chất nhiễm sắc (chromatin) và DNA là hai điểm 109
quan trọng của epigenetics và cho phép duy trì cấu trúc ổn định của vật liệu di truyền. Tuy nhiên, mức độ methyl hóa DNA có biến động ở các sinh vật đa bào. Năm 1948, R.P.Hotchkiss khám phá ra: ở trên base thứ 5, cytosine hoạt hóa tạo ra 5-methylcytosine. Sự hoạt hóa cystosine này khi đi sau nó là guanosine. Promoter bất hoạt trở nên hoạt hóa cystosine. Sự methyl hóa cystosine của một gene gọi là sự methyl hóa DNA. Ở động vật có xương sống, sự methyl hóa DNA giúp điều hòa sao mã của gene, giúp ổn định nucleosome và ngăn chặn nhân tố sao chép liên kết lại gây ra sự ngăn cản sao mã DNA. Ngoài ra, sự methyl hóa DNA giúp tế bào trải qua sự giảm nhiễm mà vẫn duy trì đặc tính riêng biệt, giúp cho tế bào thủy tinh thể tiếp tục giữ nguyên và không bị hoạt hóa bởi những gene tạo cơ. Trong sự phát triển con người và tế bào máu còn non, DNA của gene khởi đầu globin hầu như không có sự methyl hóa. Ngược lại, những điểm khởi đầu (promoter) tương tự thì sự methyl hóa cao trong tế bào mà tế bào đó không sản sinh ra globin. Sự methyl hóa DNA xảy ra trong suốt quá trình phát triển. Những tế bào sản sinh ra hemoglobin trong phôi người không có điểm khởi đầu (promoter) methyl hóa trên gene sẽ mã hóa beta-globin của phôi 6 tuần tuổi sẽ tạo ra: beta-globin. (Van der Ploeg và Flavell, 1980; Groudine và Weintraub 1981; Mavilio và ctv, 1983). Khi không có sự methyl hóa ở promoter của gene beta-globin, gene sẽ hoạt hóa tạo ra beta-globin, khi có sự methyl hóa ở promoter sẽ bất hoạt gene tạo gama-globin. Trên phôi 12 tuần tuổi, hoặc những người trưởng thành điểm khởi đầu trên gene gama-globin hoạt hóa tạo ra gama-globin. Hình 5.2. Biểu hiện gene hoạt hóa ở tế bào máu (Reik W. et al., 1998) Sự tương quan giữa methyl hóa cytosine và sự ngăn cản sao mã được xác nhận thông qua thực nghiệm bởi những thông tin di truyền khác cùng với sự methyl hóa những mô hình khác trong tế bào. Busslinger và ctv (1983) cho thấy sự methyl hóa trên promoter và enhancer của gene tương quan cùng với sự ngăn cản sao mã. Sự phát triển động vật có xương sống, methyl hóa tương quan cao với sự ngăn cản một chuỗi những gene chuyên biệt. Drosophila, tuyến trùng, và hầu hết những động vật không có xương sống không có sự methyl hóa DNA. 110
Sự methyl hóa DNA gây ra sự ngăn cản sao mã, ngăn cản sự biểu hiện gene là do: phản ứng thuận nghịch giữa histone trong choromatin và DNA bao quanh chúng. Sự cạnh tranh trong sự cải biến tại lysine còn lại ở vị trí thứ 9 của histone H3. Nếu vị trí đó không được acetyl hóa, nó sẽ bị methyl hóa. Sự methyl hóa này làm tăng sự ổn định của nucleosome, ngăn cản sự phân ly hoặc cử động của nucleosome. Vì thế sự cải biến ở đuôi histone H3 có thể thực hiện vai trò như một “công tắc” giữa hoạt hóa (phân tán nucleosome) và không hoạt hóa (ổn định nucleosome) trong những trạng thái của gene. Sự methyl hóa gây ra sự ngăn cản phiên mã theo cơ chế: một giả thuyết là sự methyl hóa làm ổn định nucleosome. Tại đây, sự methyl hóa liên kết với histone được khử acetyl. Trong khi đó sự acetyl hóa histone tương đối ổn định và kết quả là các nucleosome bị phân tán, histone bị khử acetyl tách khỏi một nucleosome ổn định. Protein MeCP2 có xu hướng liên kết với vùng DNA đã methyl hóa và histone deacetylase. Do đó, khi protein MeCP2 liên kết với DNA đã được methyl hóa và sẽ ổn định nucleosome trong vùng chuyên biệt của chromatin. (Keshet và ctv., 1986; Jones và ctv, 1998; Nan và ctv, 1998). DNA được methyl hóa ưu tiên liên kết với histone H1 (McArthur và Thomas, 1996). Mô hình này duy trì xuyên suốt trong sự phân chia tế bào bởi enzyme DNA (cytosine-5)-methyltransferase. Trong suốt quá trình tái bản, một chuỗi DNA giữ lại khuôn của sự methyl hóa, trong khi đó sợi vừa tổng hợp sẽ không có sự methyl hóa. Tuy nhiên, enzyme DNA (cytosine-5)-methyltransferase hoạt động mạnh hơn trên DNA mà DNA đó chỉ có một sợi DNA được methyl hóa. Enzyme này nhận biết methyl –CpG trên một sợi DNA và methyl hóa vị trí C trên sợi DNA đơn đó (Gruenbaum và ctv, 1982; Bestor và Ingram, 1983). Enzyme tham gia vào sự methyl hóa DNA: ở người, quá trình methyl hóa DNA thực hiện bởi ba enzyme DNA methyltransferase 1, 3a, 3b (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b). DNMT3a và DNMT3b methyltransferasa sắp xếp vùng methyl hóa DNA trong giai đoạn phát triển sớm. Hình 5.3 Sự methyl hóa DNA điều khiển methyl hóa histone (Nguồn: http://www.web-books.com/mobio/free/ch7F2) 111
 Duy trì tình trạng methyl hóa Hình 5.4. Sự sao chép trình tự methyl hóa DNA (http://www.premierbioso ft.com/molecularbeacons/ dna-methyl) Sau lần tái bản thứ nhất, mỗi phân tử DNA con có một sợi với C methyl hóa và một sợi không. Nhờ các enzyme methylase đặc biệt (maintenance methylase) các cytosine sau đó được methyl hóa trên sợi mới. Những sợi của sự methyl hóa DNA được duy trì thông qua sự phân chia tế bào. Một trình tự DNA trên trong đó có hai cytosine trên mỗi sợi được methyl hóa. Kiểu này được duy trì xuyên suốt sự phân chia tế bào vì, ở sự tái bản trên, một methylase duy trì nhận diện sợi DNA bị methyl hóa một nửa, và thêm nhóm methyl vào cytosine không bị methyl hóa. Trình tự có hai sợi DNA không bị methyl hóa không được nhân diện bởi enzyme này, do đó vẫn duy trì sự không bị methyl hóa.  Ý nghĩa của methyl hóa Ở động vật hữu nhũ, sự methyl hóa gây bất hoạt gene vì gene bất hoạt bị methyl hóa. Tuy nhiên, nhiều người lại cho rằng sự methyl hóa chỉ có vai trò cản trở sự sao mã ngẫu nhiên của các gene “tắt”. Tế bào động vật có xương sống có một protein dính vào các nhóm 5-methylcytosine để các activator của sự sao mã tới DNA. Do đó, sự methyl hóa DNA chỉ bảo đảm rằng, khi một gene đã tắt trong một tế bào phân hóa thì nó sẽ tiếp tục “tắt”. Ngoài ra, sự methyl hóa cải biến nucleotide cho sự điều hòa những gene liên kết và bảo vệ DNA khỏi những enzyme endonuclease hạn chế.  5-methylcytosine Yếu tố 5-methylcytosine chiếm 2-3% trong tổng số cytosine ở bộ gene động vật hữu nhũ, chiếm ít hơn 1% số nucleotide trong bộ gene. 112