CYTOKINE (Kỳ 3)

Chia sẻ: Barbie Barbie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

122
lượt xem 29
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tinh chế bằng phương pháp hoá sinh Việc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phải một số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiều cytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chức năng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khăn khác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thể lympho bào không thuần nhất và sự đáp...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CYTOKINE (Kỳ 3)

CYTOKINE (Kỳ 3) Tinh chế bằng phương pháp hoá sinh Việc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phải một số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiều cytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chức năng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khăn khác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thể lympho bào không thuần nhất và sự đáp ứng của chúng với các cytokine được thử thường đưa đến các kết quả không rõ ràng. Một khó khăn tiếp theo nữa là dịch nổi nuôi tế bào có một nồng độ cytokine rất thấp. Có hai phát minh đã cho phép các nhà nghiên cứu vượt qua được những khó khăn này và có thể xác định được các đặc trưng hoá sinh của các cytokine. Phát minh thứ nhất là sự phát hiện ra các dòng tế bào ung thư có khả năng tiết cytokine. Những dòng tế bào ung thư này đã cung cấp các quần thể tế bào thuần nhất có khả năng tiết ra một cytokine nhất định với nồng độ cao hơn khi nuôi các tế bào dạng lympho này. Phát minh thứ hai là sự phát hiện ra các dòng tế bào mà
sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào sự có mặt của một cytokine nhất định. Những dòng tế bào này đã cung cấp một hệ thống thực nghiệm đơn giản, đó là một quần thể tế bào thuần nhất có khả năng tăng sinh khi đáp ứng với một yếu tố sinh trưởng nhất định. Khi sử dụng hệ thống thử nghiệm này để đánh giá hoạt tính sinh học của các cytokine đã phát hiện từ trước có các chức năng khác nhau, người ta đã phát hiện thấy rằng trước đây tưởng như có rất nhiều cytokine và mỗi một cytokine được đặt tên theo hoạt tính sinh học của nó, nhưng thực ra đó lại chỉ là một cytokine có các hoạt tính sinh học khác nhau. Vì vậy người ta đã đưa ra một bảng thuật ngữ chuẩn trong đó phần lớn các cytokine được gọi là interleukin dựa theo vai trò của nó trong việc truyền thông tin giữa các tế bào bạch cầu. Những interleukin đầu tiên được phát hiện được gọi là interleukin-1 (IL-1) và interleukin- 2 (IL-2). IL-1 có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau mà trước đây đã được mô tả ít nhất là có 8 yếu tố, IL-2 trước đây được phát hiện những hoạt tính và đặt tên cho 4 yếu tố khác nhau. Trong thập kỷ 80 người ta đã phát hiện được 10 interleukin và một số cytokine khác còn vẫn được đặt tên theo hoạt tính sinh học của chúng. Sự tương ứng giữa các lymphokine đã được tinh chế và các yếu tố được đặt tên trước đây đã được sắp xếp lại một cách rõ ràng (xem bảng 11.1). Kỹ thuật tinh chế các interleukin bằng phương pháp hoá sinh gồm có một số kỹ thuật tinh chế protein và thường sử dụng nước nổi chứa cytokine khi nuôi các tế bào có khả năng sản xuất một cytokine nhất định với số lượng lớn. Ví dụ các dòng tế bào mono bị ung thư
hoá được chọn lọc để sản xuất IL-1 và các dòng tế bào lymphoma thuộc loại tế bào T được chọn để sản xuất IL-2. Người ta nuôi các tế bào này trong các bình nuôi cấy lớn và dùng các chất kích thích phân bào, phorbon este hoặc các chất kích thích thích hợp khác kích thích chúng để chúng sinh ra các cytokine. Sau đó tiến hành tinh chế cytokine từ dịch nổi nuôi cấy. Trong phần lớn các trường hợp người ta cô đặc cytokine bằng lọc màng và tiếp theo bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, lọc gel, kỹ thuật tập trung đẳng điện và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sau mỗi bước tinh chế người ta phải xác định lại mức độ hoạt tính sinh học của cytokine. Việc tinh chế IL-2 là một ví dụ điển hình. Thử nghiệm sinh học quyết định trong quá trình tinh chế này dựa vào khả năng kích thích tăng sinh của IL-2 đối với một số tế bào nhất định. Thông thường dòng tế bào được dùng là dòng tế bào CTLL-2, đó là một dòng tế bào Tc của chuột nhắt có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2; tế bào HT-1, đó là tế bào Th mà có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2. Sau mỗi bước tách phần tinh chế người ta cho phần tinh chế được vào các dòng tế bào và đánh giá sự tăng sinh của tế bào thông qua khả năng thâu nhận thymidine [3H]. Hiệu xuất tinh chế bằng phương pháp hoá sinh còn rất kém mặc dù các tế bào có thể sinh ra một lượng lớn interleukin. Ví dụ từ 10 lít nước nổi thu được từ nuôi cấy dòng tế bào ung thư chuột nhắt sản sinh ra IL-2 khi được kích thích bằng PHA thì người ta chỉ thu được khoảng 50(g IL-2 mà thôi. Thường thì hiệu xuất của việc tinh chế bằng phương pháp hoá sinh là không cao và độ tinh khiết cũng không lớn trong hầu hết các trường hợp.
Clone hoá các gene cytokine Người ta có thể thu được khối lượng lớn cytokine tinh khiết khi sử dụng các kỹ thuật tái tổ hợp ADN từ các gene mã hoá cytokine. Ngày nay người ta đã lập được một kho ADN bổ cứu từ các dòng tế bào sản xuất cytokine thích hợp (xem hình 2.4). Sau đó sàng lọc kho này bằng cách làm xuất hiện các clone ADN bổ cứu trong tế bào COS. Khi thử nghiệm các hoạt tính cytokine trong nước nổi nuôi cấy tế bào COS người ta nhận ra những tế bào COS nào đã được nạp đoạn ADN bổ cứu mã hoá cytokine. Có một kỹ thuật khác được dùng để nhận dạng đoạn ADN bổ cứu mã hoá cytokine đó là kỹ thuật lai tạo đoạn gien. Do cytokine chỉ được sản xuất sau khi tế bào được kích thích bằng kháng nguyên, chất kích thích phân bào hoặc tác nhân kích thích khác, nên ARN thông tin của một tế bào cảm ứng sẽ chứa các đoạn ARN thông tin mã hoá cytokine trong khi ARN thông tin của tế bào không cảm ứng sẽ không có các đoạn ARN thông tin mã hoá cytokine này. Vì vậy người ta có thể tách ARN thông tin từ những tế bào cảm ứng và sao mã ngược để có được đoạn ADN bổ cứu xoắn đơn tương ứng với các gene được xuất hiện trong các tế bào cảm ứng. Bằng phương pháp lai ADN bổ cứu với ARN thông tin của tế bào không cảm ứng người ta sẽ loại bỏ được những đoạn ADN bổ cứu có trong cả hai loại tế bào (cảm ứng và không cảm ứng) và chỉ còn lại những đoạn ADN bổ cứu không bị lai (chỉ có trong các tế bào cảm ứng - đó chính là ADN mã hoá cytokine), sau đó tiến hành làm giầu các ADN này. Các đoạn ADN này sẽ được chuyển nạp vào các vi khuẩn hoặc các tế bào của động vật
có vú để chúng sản xuất ra các cytokine. Vào giữa những năm 1980 người ta đã thành công trong việc clone hoá các gene của các cytokine đã biết và chuyển nạp chúng vào các tế bào vi khuẩn, nấm men, côn trùng hoặc tế bào động vật có vú và thu được một lượng lớn các cytokine do các tế bào này sản sinh ra.