Đa hình thái đơn Nucleotid vùng gen ty thể HV1 và HV2 trên người dân tộc Kinh và dân tộc Mường của Việt Nam

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐA HÌNH THÁI ĐƠN NUCLEOTID VÙNG GEN TY THỂ HV1 VÀ HV2<br /> TRÊN NGƯỜI DÂN TỘC KINH VÀ DÂN TỘC MƯỜNG CỦA VIỆT NAM<br /> Trần Thị Thúy Hằng, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định đa hình nucleotid đơn (SNP) của vùng gen ty thể HV1, HV2<br /> trên 2 dân tộc Kinh và dân tộc Mường Việt Nam. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để phân tích 100<br /> mẫu DNA của 2 dân tộc (50 mẫu dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường), kết quả giải trình tự được so sánh<br /> với trình tự chuẩn rCRS, từ đó phân loại sơ bộ theo các nhóm đơn bội và dưới đơn bội. Kết quả cho thấy, đã<br /> xác định được tỷ lệ một số SNP hay gặp ở các mẫu nghiên cứu: SNP A73G và A263G gặp ở 100% mẫu<br /> nghiên cứu, 315insC là 97%, 309insC là 50%, C16223T là 44%, G16129A là 39%, T16189C là 32%,<br /> T16172C là 30%, A16183C là 26%, T16304C là 24%, C150T là 35%, 249Del A là 29%. Phân loại được 22<br /> nhóm đơn bội hoặc dưới đơn bội với tần số xuất hiện tương ứng là: F1a là 16%, M7b1 là 15%, B4 là 9%, B5<br /> là 10%, các nhóm có tỷ lệ thấp nhất chỉ gặp 1 cá thể trong 100 mẫu nghiên cứu là: D4, D4a, F1b, F2a,<br /> N9a, và nhóm Z. Tính đa hình nucleotid đơn vùng gen ty thể HV1 và HV2 đã được đánh giá trên hai dân tộc<br /> Kinh và Mường Việt Nam.<br /> Từ khóa: DNA ty thể, gen HV1, gen HV2, dân tộc Kinh, dân tộc Mường<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> đoạn điều khiển cho quá trình phiên mã của<br /> Bộ gen người đã được giải trình tự hoàn<br /> <br /> các gen chức năng trong vùng được mã hóa<br /> <br /> chỉnh và công bố trên hai tạp chí khoa học danh<br /> <br /> [1]. Đây được xem là vùng xuất hiện nhiều đột<br /> <br /> tiếng Nature và Science vào tháng 2 năm 2001.<br /> <br /> biến nhất với tần số cao hơn so với các vùng<br /> <br /> Hệ gen người gồm có hai phần: hệ gen nhân<br /> <br /> khác của DNA ty thể, đặc biệt là ở hai vùng<br /> <br /> (hệ gen nhiễm sắc thể) và hệ gen tế bào chất<br /> <br /> gen HV1 và HV2 [3]. Sự đa hình về trình tự<br /> <br /> (hệ gen ty thể). Hệ gen ty thể với kích thước<br /> <br /> của DNA ty thể người có ý nghĩa quan trọng<br /> <br /> 16569 bp đã được biết đến từ năm 1981 sau<br /> <br /> không chỉ trong nghiên cứu lịch sử mẫu hệ<br /> <br /> đó được chỉnh sửa lại vào năm 1999, đây<br /> <br /> của người hiện đại mà còn có ý nghĩa quan<br /> <br /> được coi là trình tự chuẩn (trình tự đối chứng)<br /> <br /> trọng trong việc xác định mối quan hệ về<br /> <br /> [1; 2]. Về cấu trúc, DNA ty thể người là phân<br /> <br /> chủng tộc giữa các vùng địa lý khác nhau [4;<br /> <br /> tử DNA mạch vòng có kích thước 16569 bp,<br /> <br /> 5]. Ngoài ra, thông tin về trình tự nucleotid trên<br /> <br /> bao gồm 37 gen, mã hóa cho 13 polypeptid<br /> <br /> DNA ty thể còn có ý nghĩa quan trọng trong<br /> <br /> tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 tRNA, 2<br /> <br /> chẩn đoán và điều trị các bệnh di truyền ty<br /> <br /> rRNA. Khoảng 7% DNA ty thể được gọi là<br /> <br /> thể, trong giám định cá thể và quan hệ huyết<br /> <br /> vùng điều khiển D-loop chứa các trình tự khởi<br /> <br /> thống, điều tra tội phạm và quản lý nhân sự.<br /> <br /> đầu cho quá trình tái bản DNA ty thể và các<br /> <br /> Cho đến nay, đã có trên 300 trình tự hoàn<br /> chỉnh của bộ gen ty thể người thuộc các<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn<br /> Ngày nhận: 23/12/2016<br /> Ngày được chấp thuận: 26/2/2017<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> chủng tộc người và dân tộc khác nhau được<br /> nghiên cứu và đăng ký trong Ngân hàng trình<br /> tự gen quốc tế (GeneBank). Các công bố này<br /> cho thấy trình tự DNA ty thể của các chủng<br /> <br /> 33<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> tộc và dân tộc khác nhau có những khác biệt<br /> <br /> tổng thể tích 20µl.<br /> <br /> [6]. Với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa<br /> <br /> Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC - 5<br /> <br /> hình nên vùng điều khiển D-loop, đặc biệt là<br /> <br /> phút; 30 chu kỳ [94oC- 30 giây, 54oC - 30 giây,<br /> <br /> vùng gen HV1, HV2 được tập trung nghiên<br /> <br /> 72oC - 30 giây]; 72oC - 5 phút; bảo quản mẫu ở<br /> <br /> cứu nhiều hơn cả, trong đó có các nghiên cứu<br /> <br /> 15oC.<br /> <br /> về các dân tộc người Trung Quốc, Thái Lan,<br /> Nhật Bản, Hàn Quốc là những chủng tộc<br /> người có mối quan hệ địa lý, chủng tộc rất gần<br /> gũi với các dân tộc người Việt Nam [7 - 9].<br /> Nghiên cứu này được thực hiện nhằm: xác<br /> định tính đa hình nucleotid đơn (SNP) của<br /> vùng gen ty thể HV1 và HV2 trên người 2 dân<br /> tộc Kinh và dân tộc Mường của Việt Nam.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> Giải trình tự gen theo qui trình BigDye<br /> terminator sequencing (Applied Biosystems,<br /> Foster city, USA). Tiến hành trên máy 3100Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM.<br /> So sánh với trình tự GeneBank để xác định đa<br /> hình. Kết quả giải trình tự gen được đối chiếu<br /> và so sánh với trình tự chuẩn J01415 trên<br /> GeneBank (National center for biotechnology<br /> information, NCBI) bằng phần mềm phân tích<br /> CLC Main Workbench 6.01 để xác định đa<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> 100 mẫu máu ngoại vi (chống đông EDTA)<br /> của người bình thường, khỏe mạnh thuộc 2<br /> dân tộc Kinh và Mường Việt Nam (50 mẫu<br /> dân tộc Kinh, 50 mẫu dân tộc Mường).<br /> <br /> hình hai vùng siêu biến HV1 và HV2.<br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức<br /> nghiên cứu trong Y học, được phê duyệt<br /> bản chấp thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN, ngày<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> 31/1/2013 của Hội đồng Đạo đức trong nghiên<br /> <br /> DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu<br /> <br /> cứu y sinh học, Trường Đại học Y Hà Nội.<br /> <br /> máu toàn phần theo phương pháp sử dụng<br /> enzym protease K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol.<br /> Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại vùng<br /> gen HV1 và HV2:<br /> HV1-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> Sau khi tách chiết, tinh sạch, các mẫu DNA<br /> được kiểm tra chất lượng, nồng độ và độ tinh<br /> sạch bằng cách đo phổ hấp thụ tử ngoại ở hai<br /> bước sóng 260 nm, 280 nm. Các mẫu DNA<br /> <br /> AAG C -3’.<br /> HV1-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA<br /> <br /> được tách chiết đạt nồng độ ≥ 40ng/µl, độ tinh<br /> <br /> TG -3’.<br /> HV2-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA<br /> <br /> được sử dụng làm khuôn để khuếch đại vùng<br /> <br /> sạch trong khoảng 1,8 - 2,0, không đứt gẫy<br /> gen HV1 và HV2.<br /> <br /> CCA C -3’<br /> HV2-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC<br /> <br /> đại đoạn gen HV1 từ vị trí nucleotid 15975 đến<br /> <br /> GCC A -3’<br /> <br /> nucleotid 16517, có kích thước 543 bp và<br /> <br /> Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch<br /> <br /> Thành phần của phản ứng PCR: 1X đệm<br /> <br /> đoạn gen HV2 từ vị trí nucleotide 8 đến nu-<br /> <br /> PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;<br /> <br /> cleotide 429, có kích thước 422 bp. Sản phẩm<br /> <br /> 0,5unit Taq polymerase; 50ng DNA và H 2 O,<br /> <br /> PCR thu được có chất lượng tốt, chỉ gồm 1<br /> <br /> 34<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> băng đặc hiệu, kích thước phù hợp với tính<br /> <br /> J01415) để xác định đa hình nuleotid đơn<br /> <br /> toán. Sản phẩm PCR được tiến hành giải trình<br /> <br /> (SNP). Một số kết quả giải trình tự gen hai<br /> <br /> tự gen trên máy 3100 - Avant Genetic<br /> <br /> vùng siêu biến HV1 và HV2 được thể hiện ở<br /> <br /> Analyzer của hãng ABI - PRISM. So sánh với<br /> <br /> các hình 1 và hình 2: tín hiệu các đỉnh cao, rõ<br /> <br /> trình tự GeneBank (trình tự chuẩn gen ty thể -<br /> <br /> nét, không bị nhiễu, tín hiệu đường nền thấp.<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh giải trình tự một số vùng SNP trên gen ty thể HV1<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh giải trình tự một số vùng SNP của gen ty thể HV2<br /> Kết quả giải trình tự gen HV1 và HV2 của 100 mẫu nghiên cứu được tiến hành so sánh với<br /> trình tự chuẩn cho thấy, có khá nhiều vị trí đa hình so với trình tự chuẩn. Mẫu có ít vị trí đa hình<br /> nhất là 6, trong khi mẫu có nhiều vị trí đa hình nhất là 16. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng, các vị<br /> trí đa hình tập trung nhiều hơn ở gen HV1. Các vị trí đa hình hay gặp ở các mẫu nghiên cứu là<br /> 315insC là 97%, 309insC là 50%, C16223T là 44%, G16129A là 39%, T16189C là 32%, đặc biệt<br /> là hai vị trí đa hình A73G và A263G gặp ở 100% mẫu nghiên cứu. Các đột biến thay thế là phổ<br /> biến nhất, các nucleotid thêm vào thường là C trong khi các nucleotide mất thường là A. Các kết<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> quả thu được về các vị trí đa hình trên hai vùng gen HV1 và HV2 phản ánh sự đa hình rất cao<br /> của hai vùng gen này.<br /> Bảng 1. Bảng các vị trí đa hình thường gặp trên gen HV1 và HV2<br /> Gen HV1<br /> <br /> %<br /> <br /> Gen HV2<br /> <br /> %<br /> <br /> T16189C<br /> <br /> 32/100 (32%)<br /> <br /> A73G<br /> <br /> 100/100 (100%)<br /> <br /> A16183C<br /> <br /> 26/100 (26%)<br /> <br /> 249DelA<br /> <br /> 29/100 (29%)<br /> <br /> C16223T<br /> <br /> 44/100 (44%)<br /> <br /> A263G<br /> <br /> 100/100 (100%)<br /> <br /> T16172C<br /> <br /> 30/100 (30%)<br /> <br /> C150T<br /> <br /> 35/100 (35%)<br /> <br /> T16304C<br /> <br /> 24/100 (24%)<br /> <br /> 309insC<br /> <br /> 50/100 (50%)<br /> <br /> G16129A<br /> <br /> 39/100 (39%)<br /> <br /> 315insC<br /> <br /> 97/100 (97%)<br /> <br /> Bảng 2. Phân loại theo các nhóm đơn bội dựa trên các vị trí đa hình đặc trưng<br /> Halogrou<br /> p (%)<br /> <br /> Các SNP đặc trưng<br /> (+A73G, A263G)<br /> <br /> Halogroup<br /> (%)<br /> <br /> Các SNP đặc trưng<br /> (+A73G, A263G)<br /> <br /> B4 (9)<br /> <br /> T16189C, T16217C<br /> <br /> G2 (6)<br /> <br /> C16278T, T16362C<br /> <br /> B4a (2)<br /> <br /> T16189C, T16217C,<br /> <br /> M (6)<br /> <br /> C16223T<br /> <br /> B4b (2)<br /> <br /> T16136C, T16189C,<br /> <br /> M10 (6)<br /> <br /> T16311C<br /> <br /> B5 (10)<br /> <br /> T16140C, T16189C<br /> <br /> M7 (2)<br /> <br /> T146C/A, T199C<br /> <br /> B5a (5)<br /> <br /> T16140, T16189C, C16226A,<br /> <br /> M7b (3)<br /> <br /> T16297C, T150C, T199C<br /> <br /> D4 (1)<br /> <br /> T16362C<br /> <br /> M7b1 (15)<br /> <br /> G16129A, C16192T, T16297C,<br /> <br /> D4a (1)<br /> <br /> G16129A, T16362C, T152C<br /> <br /> M7c (3)<br /> <br /> C16295T, T146C/A, T199C<br /> <br /> F1a (16)<br /> <br /> G16129A, T16172C,<br /> <br /> M9 (2)<br /> <br /> C16234T, A153G<br /> <br /> F1b (1)<br /> <br /> T16189C, T16304C, 249delA<br /> <br /> N9a (1)<br /> <br /> C16257A, C16261T, T150C<br /> <br /> F (3)<br /> <br /> T16304C, 249delA<br /> <br /> R9a (4)<br /> <br /> T16298C, C16355T, T16362C,<br /> <br /> F2a (1)<br /> <br /> C16291T, T16304C, 249delA<br /> <br /> Z (1)<br /> <br /> C16185T, C16260T, T16298C,<br /> <br /> Phân nhóm đơn bội DNA ty thể theo Yao và cộng sự năm 2002 (tác giả đã phân chia nhóm<br /> <br /> 36<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> đơn bội (Haplogroup) các dân tộc người Trung Quốc dựa vào các vị trí đa hình đặc trưng trên hai<br /> gen HV1 và HV2) [7].<br /> Kết quả cho thấy đã phân loại được 22 nhóm đơn bội hoặc dưới đơn bội với tần số xuất hiện<br /> tương ứng là: F1a là 16%, M7b1 là 15%, B5 là 10%, B4 là 9%, B5a là 5%, G2, M, M10 đều là<br /> 6%, R9a là 4%, M7c, M7b, F đều là 3%, B4a, B4b, M7, M9 đều là 2%, và nhóm D4, D4a, F1b,<br /> F2a, N9a, Z đều là 1% trong đó nhóm có tần số xuất hiện cao nhất là nhóm F1a chiếm 16%,<br /> nhóm có tần số xuất hiện thấp nhất là nhóm D4, D4a, F1b, F2a, N9a, Z đều là 1%.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Những nghiên cứu gần đây trên thế giới đã<br /> <br /> Đa hình tại vị trí T16189C đã tạo nên vùng<br /> <br /> phân loại các nhóm đơn bội của DNA ty thể<br /> <br /> lặp nucleotid Cystein (poly C) từ vị trí 16183-<br /> <br /> dựa vào các vị trí đa hình đặc trưng trên DNA<br /> <br /> 16193 trên vùng siêu biến HV1. Tỷ lệ đa hình<br /> <br /> ty thể mà đặc biệt là các vị trí đa hình trên gen<br /> <br /> T16189C thuộc vùng lặp nucleotid Cystein của<br /> <br /> HV1 và HV2. Năm 2002, một nghiên cứu trên<br /> <br /> gen HV1 là 25,14% và sự đa dạng di truyền<br /> <br /> 263 người thuộc 6 dân tộc người Trung Quốc<br /> <br /> trong vùng lặp nucleotid Cystein của gen HV1<br /> <br /> đã phân loại được các nhóm đơn bội theo các<br /> <br /> có ý nghĩa quan trọng trong việc giám định<br /> <br /> vị trí đa hình đặc trưng trên HV1 và HV2, [7].<br /> <br /> hình sự gen và di truyền quần thể [5]. Nghiên<br /> <br /> Cụ thể tác giả đã phân loại được 42 nhóm<br /> <br /> cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự<br /> <br /> đơn bội và dưới đơn bội trong đó nhóm D4<br /> <br /> tỷ lệ đa hình SNP T16189C là 32%.<br /> <br /> chiếm tỷ lệ cao nhất (27/263), nhóm A chiếm<br /> <br /> Đa hình tại vị trí A73G và A263G gặp ở<br /> <br /> (18/263), nhóm F1a chiếm (15/263), các nhóm<br /> <br /> 100% mẫu nghiên cứu, kết quả này phù hợp<br /> <br /> có tỷ lệ thấp nhất là G2, T1, D, N, B5 (chỉ có<br /> <br /> với kết quả nghiên cứu năm 2002 trên 263<br /> <br /> 1/263 cá thể nghiên cứu) [7]. Có được kết quả<br /> <br /> người thuộc 6 dân tộc người Trung Quốc<br /> <br /> như vậy có lẽ do số lượng mẫu, số lượng dân<br /> <br /> cũng cho thấy đa hình tại hai vị trí này là<br /> <br /> tộc trong nghiên cứu trên lớn hơn so với<br /> <br /> 100% [7]. Tỷ lệ đa hình A263G và A73G cũng<br /> <br /> nghiên cứu của chúng tôi.<br /> <br /> gặp ở 100% các mẫu nghiên cứu [11]. Một<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu trên 47 người Việt<br /> <br /> nghiên cứu năm 1999, trên 50 người Việt<br /> <br /> Nam (năm 2009) cho thấy, haplogroup F1a có<br /> <br /> Nam đã phát hiện được 20 đa hình vị trí các<br /> <br /> tỷ lệ cao nhất 10/47 và haplogroup D4 là 7/47,<br /> <br /> enzym cắt trên DNA ty thể, trong đó, 3 vị trí<br /> <br /> G2a là 6/47, B4 và N9a là 3/47 [10]. Trong<br /> <br /> của enzym HaeII-13Viet, MspI-19Viet, MspI-20Viet<br /> <br /> nghiên cứu này, chúng tôi đã phân loại được<br /> <br /> là các đa hình mới [12]. Năm 2005, khi giải<br /> <br /> 22 haplogroups, tỷ lệ haplogroup F1a trên 100<br /> <br /> trình tự 2 vùng gen HV1 và HV2 của các mẫu<br /> <br /> mẫu nghiên cứu của chúng tôi cũng chiếm tỷ<br /> <br /> dân tộc Kinh, dân tộc Tày và dân tộc H’Mông,<br /> <br /> lệ cao nhất 16% (16/100). Còn lại các<br /> <br /> đã phát hiện 26 vị trí đa hình trên HV1 và 5 vị<br /> <br /> haplogroup khác tương ứng là: M7b1 (15%),<br /> <br /> trí đa hình trên HV2 [13].<br /> <br /> B5 (10%), B4 (9%), B5a (5%), G2, M, M10<br /> <br /> Nghiên cứu cũng đã thống kê ra một số vị<br /> <br /> đều là 6%, R9a (4%), M7c, M7b, F đều là 3%,<br /> <br /> trí đa hình hay gặp trên gen HV1 và HV2 của<br /> <br /> B4a, B4b, M7, M9 đều là 2% và nhóm D4,<br /> <br /> DNA ty thể là C16223T (44/100), G16129A<br /> <br /> D4a, F1b, F2a, N9a, Z đều là 1%.<br /> <br /> (39/100), T16189C (32/100), A73G (100/100),<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 37<br /> <br />