Đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè tại Thái Nguyên

Đỗ Thị Tuyến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 107(07): 97 - 102<br /> <br /> ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CHỦNG XẠ KHUẨN HT17.8 CÓ KHẢ NĂNG<br /> KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CHÈ TẠI THÁI NGUYÊN<br /> Đỗ Thị Tuyến*, Vi Thị Đoan Chính<br /> Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nấm ký sinh gây bệnh trên chè gây thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp sản xuất chè ở Thái<br /> Nguyên. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại<br /> và khả năng kháng nấm mốc gây bệnh trên chè của chủng xạ khuẩn HT17.8 được phân lập tại Thái<br /> Nguyên. Chủng HT17.8 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, có khả năng kháng vi khuẩn Gram<br /> dương (Bacillus subtilis), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli), nấm mốc (Fusarium oxysporum,<br /> Fusarium solani) và 4 chủng nấm gây bệnh trên chè: N1, Đ1, PL3, TB4. Chủng HT17.8 có cuống<br /> sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử nhẵn, có khả năng sinh trưởng được ở nồng độ muối tối đa<br /> 9%, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng trong khoảng 250 - 350C, pH thích hợp trong khoảng 6 – 8,<br /> có khả năng sinh các enzyme ngoại bào amylase, protease, cellulase. Trên cơ sở các đặc điểm hình<br /> thái, nuôi cấy, sinh lý sinh hóa và trình tự gen 16S rRNA, chủng HT17.8 được định tên là<br /> Streptomyces sp. HT17.8. Trình tự gen 16S rRNA của chủng HT17.8 được đăng ký trên ngân hàng<br /> gen với mã số JQ012795. Chủng Streptomyces sp. HT17.8 sinh trưởng tốt và cho hoạt tính kháng<br /> sinh mạnh nhất trên môi trường Gause 2.<br /> Từ khóa: chất kháng sinh, kháng nấm, hoạt tính kháng sinh, xạ khuẩn, gen 16S rRNA<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ1<br /> Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh<br /> thực vật đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho<br /> mùa màng. Thêm vào đó, việc sử dụng thuốc<br /> hóa học để trừ nấm thường gây ảnh hưởng<br /> nghiêm trọng tới sức khỏe con người, làm<br /> mất cân bằng sinh thái và gây ô nhiễm môi<br /> trường. Vì vậy, đấu tranh sinh học chống<br /> bệnh ở thực vật đã được Hội nghị tư vấn khu<br /> vực châu Á – Thái Bình Dương của FAO năm<br /> 1992 khẳng định là nền tảng của Chương<br /> trình quản lý thống nhất các bệnh dịch. Trong<br /> đó, việc sử dụng một hay nhiều loại vi sinh<br /> vật để kiềm chế bệnh ở thực vật được quan<br /> tâm hàng đầu [3].<br /> Ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học<br /> nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp đấu<br /> tranh sinh học trong bảo vệ thực vật. Bùi Thị<br /> Việt Hà (2006) đã phân lập và định tên được<br /> chủng 3 chủng xạ khuẩn Streptomyces<br /> antimycoticus<br /> T41,<br /> Streptomyces<br /> diastatochromogenes D42, Streptomyces<br /> hygroscopicus TC 54 có khả năng kháng nấm<br /> Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ ở cà<br /> *<br /> <br /> Tel: 0974056143; Email: tuyendodhkh@gmail.com<br /> <br /> chua, đậu Hà Lan, chuối… và đã bước đầu<br /> ứng dụng chế phẩm sản xuất từ 3 chủng xạ<br /> khuẩn này thu được kết quả khả quan [3].<br /> Trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết<br /> quả nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại<br /> chủng xạ khuẩn HT17.8 có khả năng sinh<br /> chất kháng sinh (CKS) kháng nấm gây bệnh<br /> trên chè phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên,<br /> Việt Nam nhằm làm cơ sở cho việc nghiên<br /> cứu ứng dụng.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên liệu<br /> - Chủng nghiên cứu: chủng xạ khuẩn HT17.8<br /> có hoạt tính kháng sinh (HTKS) cao được lưu<br /> giữ tại Phòng thí nghiệm Sinh học, trường<br /> Đại học Khoa học.<br /> - Chủng kiểm định: Escherichia coli VTCCB-883, Bacillus subtilis VTCC-B-888,<br /> Fusarium<br /> oxysporum<br /> VTCCF-1301,<br /> Aspergillus niger VTCCF-001, Fusarium<br /> solani VTCCF-1302 do Viện Bảo tàng giống<br /> chuẩn vi sinh vật cung cấp; 4 chủng nấm mốc<br /> gây bệnh trên chè, bao gồm: chủng Đ1 - gây<br /> bệnh đốm đen, chủng N2 – gây bệnh đốm<br /> nâu, chủng TB4 – gây bệnh khô búp, chủng<br /> 97<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Đỗ Thị Tuyến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> PL3 – gây bệnh phồng rộp lá chè. Các chủng<br /> này nhận được từ Phòng thí nghiệm Sinh học,<br /> Trường Đại học Khoa học.<br /> - Các môi trường: Môi trường Gause 1 nuôi<br /> cấy xạ khuẩn, môi trường Czapek nuôi cấy<br /> nấm mốc, các môi trường nuôi cấy cho phân<br /> loại: ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6,<br /> ISP 9, 79, Glycerin - nitrat, hữu cơ – agar…<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> - Xác định hoạt tính kháng sinh: Sử dụng<br /> phương pháp khuếch tán trên thạch [2].<br /> - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại:<br /> Đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý và sinh<br /> hóa: theo mô tả trong khóa phân loại của<br /> Shirling và Gottlieb [7].<br /> Xác định trình tự gen 16S rRNA: Tách chiết<br /> DNA tổng số theo kit của hãng QIAamp<br /> DNA Mini Kit. Gen 16S rRNA được thu nhận<br /> bằng phản ứng nhân bản gen (PCR) với cặp<br /> mồi có trình tự:<br /> 341F : 5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’<br /> 907R : 5’- CCG TCA ATT CCT TRA GTT T -3’<br /> Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được xác định<br /> trình tự trên thiết bị đọc trình tự tự động ABI<br /> PRISM® 3100 Avant Geneetic Analyzer. Trình<br /> tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI<br /> PRISM 3100 Avant Data Collection v 1.0 và<br /> DNA Sequencing Analysis, so sánh với trình tự<br /> gen 16S rRNA của các sinh vật prokaryote đã<br /> được công bố trên ngân hàng gen thế giới bằng<br /> chương trình BLAST.<br /> <br /> 107(07): 97 - 102<br /> <br /> - Nghiên cứu môi trường lên men thích hợp<br /> cho sinh tổng hợp chất kháng sinh [1].<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Khả năng kháng nấm mốc gây bệnh trên<br /> chè của chủng xạ khuẩn HT17.8<br /> Chủng xạ khuẩn HT17.8 được phân lập từ<br /> đất Thái Nguyên, có hoạt phổ rộng, đặc biệt<br /> có hoạt tính kháng nấm mốc gây bệnh chè<br /> nên được lựa chọn để nghiên cứu phân loại.<br /> Kết quả xác định khả năng kháng với các<br /> chủng vi sinh vật kiểm định của chủng<br /> HT17.8 thể hiện trên bảng 1 và hình 1.<br /> Kết quả bảng 1 cho thấy chủng HT17.8 sinh<br /> chất kháng sinh hoạt phổ rộng, có khả năng<br /> kháng với cả vi khuẩn Gram dương, Gram<br /> âm, nấm mốc và 4 chủng nấm gây bệnh trên<br /> chè. Đặc biệt, chủng HT17.8 kháng mạnh với<br /> chủng nấm Đ1 - được phân lập từ những lá<br /> chè non bị các bệnh đốm đen. Đây là bệnh<br /> gặp rất phổ biến trên các vùng trồng chè ở<br /> nước ta, trong đó có các vùng chè ở Thái<br /> Nguyên. Khi chè bị dịch hại này thì không<br /> những ảnh hưởng đến năng suất mà chất<br /> lượng chè cũng bị ảnh hưởng. Với hướng<br /> nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có<br /> hoạt tính kháng nấm cao, có khả năng ứng<br /> dụng vào thực tiễn, chúng tôi tiến hành lựa<br /> chọn chủng HT17.8 để tiếp tục nghiên cứu<br /> các đặc điểm phân loại và khả năng sinh tổng<br /> hợp CKS của chủng này.<br /> <br /> Bảng 1. Khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của chủng HT17.8<br /> Ký hiệu E.coli<br /> B. subtilis<br /> chủng VTCC-B- VTCC-B883<br /> 888<br /> <br /> Hoạt tính kháng sinh (D - d, ± m, mm)<br /> F. solani<br /> F. oxysporum<br /> VTCCFĐ1<br /> N2<br /> VTCCF-1301<br /> 1302<br /> <br /> HT 17.8 10,2±0,1<br /> <br /> 19,3±1,4<br /> <br /> 10,2±0,2<br /> <br /> 20,1±1,1<br /> <br /> PL3<br /> <br /> TB4<br /> <br /> 23,1 ± 0,5 10,2 ± 1,2 10,3 ± 0,1 4 ± 1,5<br /> <br /> Hình 1. Khả năng kháng nấm mốc<br /> của chủng xạ khuẩn HT17.8<br /> <br /> 98<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Đỗ Thị Tuyến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Phân loại chủng xạ khuẩn<br /> Đặc điểm sinh học của chủng HT17.8<br /> - Đặc điểm hình thái: Chủng xạ khuẩn được<br /> nuôi trên môi trường Gause 1 sau 5 – 7 ngày,<br /> quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính<br /> hiển vi điện tử quét nhận thấy: Cuống sinh<br /> bào tử của chủng HT17.8 có dạng xoắn (S),<br /> bề mặt bào tử nhẵn (Sm) (Hình 2).<br /> - Đặc điểm nuôi cấy: Chủng HT17.8 sinh<br /> trưởng tốt trên các môi trường Gause 1,<br /> Gause 2, ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 6, 79, hữu<br /> cơ-agar, mọc kém trên môi trường ISP4, ISP<br /> 5 và Glycerin - nitrat. Khuẩn ty khí sinh và<br /> khuẩn ty cơ chất có màu sắc đa dạng, không<br /> tạo sắc tố melanin trên môi trường ISP 6.<br /> <br /> 107(07): 97 - 102<br /> <br /> - Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Chủng HT17.8<br /> sinh trưởng tốt trên các nguồn đường lactose,<br /> manitol, inositol, xylose, và sinh trưởng kém<br /> trên môi trường chứa các nguồn đường<br /> raffinose, maltose rhamnose, arabinose; có<br /> khả năng sinh trưởng được ở nồng độ muối<br /> tối đa là 9%, nhiệt độ thích hợp cho sinh<br /> trưởng trong khoảng 250 - 350C, pH thích hợp<br /> từ 6 – 8, có khả năng sinh các enzyme ngoại<br /> bào amylase, protease, cellulase. Kết quả so<br /> sánh các đặc điểm hình thái và nuôi cấy của<br /> chủng HT17.8 và chủng Streptomyces<br /> carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov.<br /> được thể hiện ở bảng 2.<br /> <br /> Hình 2. Hình thái khuẩn lạc, cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng HT17.8<br /> Bảng 2. So sánh một số đặc điểm phân loại chủng HT17.8 với loài chuẩn<br /> Streptomyces carpaticus Maximova et Terekhova sp. nov.<br /> Môi<br /> trường<br /> <br /> Gause1<br /> <br /> Glycerinnitrat<br /> ISP 4<br /> Gause 2 và<br /> 79<br /> Gause 1<br /> <br /> Đặc điểm phân<br /> loại<br /> KTKS<br /> KTCC<br /> CSBT<br /> Bề mặt bào tử<br /> Sắc tố tan<br /> KTKS<br /> KTCC<br /> Sắc tố tan<br /> KTKS<br /> KTCC<br /> Sắc tố tan<br /> KTKS<br /> KTCC<br /> Sắc tố tan<br /> Hình thành<br /> kháng sinh<br /> Chủng tiêu biểu<br /> <br /> Chủng HT17.8<br /> Xám<br /> Nâu<br /> Xoắn (S)<br /> Nhẵn (Sm)<br /> Nâu ánh vàng<br /> Trắng<br /> Trắng<br /> Không màu<br /> Trắng<br /> Trắng<br /> Không màu<br /> Vàng<br /> Vàng<br /> Vàng chanh<br /> CKS chống nấm,<br /> vi khuẩn G(+) và G(-)<br /> HT17.8<br /> <br /> Loài chuẩn<br /> Streptomyces carpaticus Maximova<br /> et Terekhova sp. nov.<br /> Xám<br /> Nâu<br /> Xoắn (S)<br /> Nhẵn (Sm)<br /> Nâu ánh vàng nhạt<br /> Xám – Nâu<br /> Nâu đến đen<br /> Nâu đến nâu đậm<br /> Xám nhạt<br /> Không màu<br /> Không màu<br /> Nâu nhạt<br /> Nâu xanh<br /> Nâu đậm đỏ<br /> Streptomyces carpaticus NRRL B16359T<br /> <br /> 99<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Đỗ Thị Tuyến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Qua so sánh với mô tả của Gause và cộng sự<br /> (1983), cùng với những mô tả theo Chương<br /> trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) về đặc điểm hình<br /> thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng xạ<br /> khuẩn, chủng HT17.8 có nhiều đặc điểm<br /> tương đồng với loài Streptomyces carpaticus<br /> Maximova et Terekhova sp. nov. (theo<br /> Catalogue Odobren, 1980) [4], [8]. Để có<br /> thêm căn cứ phân loại, chúng tôi tiến hành<br /> xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng<br /> HT17.8 và so sánh với trình tự gen 16S của<br /> các loài đã biết trên Genebank.<br /> Phân tích trình tự gen 16S rRNA<br /> DNA tổng số của chủng HT17.8 được tách<br /> chiết theo Kit của hãng QIAamp DNA Mini<br /> có cải tiến. Sử dụng DNA tổng số làm<br /> khuôn, cặp mồi đặc hiệu (341F, 907R), sản<br /> phẩm PCR thu được là một băng DNA duy<br /> nhất có kích thước khoảng 550 bp đúng theo<br /> tính toán lý thuyết (hình 3).<br /> <br /> Hình 3. Sản phẩm nhân gen mã hóa 16S rRNA<br /> của chủng HT17.8<br /> <br /> M: Marker 1kb<br /> 1: Sản phẩm PCR của chủng HT17.8<br /> Một phần đoạn gen mã hóa 16S rRNA của<br /> chủng HT17.8 được giải trình tự trực tiếp từ<br /> sản phẩm PCR với cặp mồi cặp mồi (341F,<br /> 907R) trên máy đọc trình tự tự động. Kết quả<br /> so sánh trình tự một phần gen 16S rRNA của<br /> chủng HT17.8 với các trình tự gen trong<br /> GenBank cho thấy:<br /> Trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA của<br /> chủng HT17.8 có độ tương đồng 97% so với<br /> trình tự gen tương ứng của chủng<br /> Streptomyces carpaticus NRRL B-16359T<br /> (có mã số DQ442494). Với độ tương đồng<br /> <br /> 107(07): 97 - 102<br /> <br /> thấp hơn 98,6% có thể sơ bộ khẳng định<br /> chủng HT17.8 không thuộc loài Streptomyces<br /> carpaticus [9]. Tuy nhiên, khi phân tích các<br /> đặc điểm phân loại truyền thống, chủng<br /> HT17.8 lại có nhiều đặc điểm giống với<br /> chủng Streptomyces carpaticus Maximova et<br /> Terekhova sp. nov mặc dù vẫn có một vài sai<br /> khác về đặc điểm nuôi cấy và khả năng hình<br /> thành chất kháng sinh như đã chỉ ra ở bảng 2.<br /> Sự giống nhau này rất có thể đó là những biến<br /> dị tự nhiên xuất hiện khi xạ khuẩn phát triển<br /> trong các môi trường khác nhau. Tính biến dị<br /> cao là một trong các đặc điểm của xạ khuẩn<br /> nên phần lớn các đặc điểm hình thái, sinh lý –<br /> sinh hóa cũng như các đặc điểm nuôi cấy<br /> thường không ổn định, dễ bị thay đổi và có<br /> giá trị thấp về mặt phân loại. Điều này cho<br /> thấy, để phân loại chính xác một chủng,<br /> không chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh<br /> hóa mà cần phải dựa vào một số chỉ tiêu khác<br /> nữa, trong đó có việc phân tích trình tự của<br /> đoạn gen 16S rRNA.<br /> Như vậy, dựa vào tất cả các đặc điểm về hình<br /> thái, sinh lý – sinh hóa và trình tự đoạn gen<br /> 16S rRNA nhận thấy chủng HT17.8 có thể là<br /> một loài mới thuộc chi Streptomyces. Tuy<br /> nhiên, để khẳng định chắc chắn được điều này<br /> cần phải có những nghiên cứu sâu hơn. Từ<br /> những kết quả trên, chúng tôi tạm thời đặt tên<br /> chủng HT17.8 là Streptomyces sp. HT17.8.<br /> Trình tự gen 16S rRNA của chủng này được<br /> đăng ký trên ngân hàng gen thế giới với mã số<br /> là JQ012795.<br /> Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp<br /> cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của<br /> chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. HT17.8<br /> Theo kết quả nghiên cứu về xạ khuẩn sinh<br /> chất kháng sinh đã công bố, xạ khuẩn thường<br /> sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh trên một<br /> số môi trường cơ bản như: Gause 1, Gause 2,<br /> A-4, A-4H, ISP 4 và 79 [1], [3]. Từ các môi<br /> trường cơ bản này, có thể lựa chọn môi<br /> trường thích hợp cho sinh tổng hợp CKS<br /> chủng xạ khuẩn HT17.8. Quá trình lên men<br /> được tiến hành trong bình nón dung tích 250<br /> ml chứa 25 ml môi trường, trên máy lắc tròn<br /> có tốc độ 220 vòng/phút, ở 28 – 300C. Sau 7<br /> <br /> 100<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Đỗ Thị Tuyến và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> ngày thu dịch lên men và xác định hoạt tính<br /> kháng sinh theo phương pháp đục lỗ thạch với<br /> vi sinh vật kiểm định là chủng nấm Đ1 gây<br /> bệnh đốm đen trên chè. Kết quả xác định hoạt<br /> tính kháng nấm của chủng xạ khuẩn HT17.8<br /> được thể hiện trên hình 4.<br /> <br /> Hình 4. HTKS của chủng HT17.8<br /> trên các môi trường lên men<br /> <br /> Kết quả trên hình 4 cho thấy chủng<br /> Streptomyces sp. HT17.8 khi lên men trên<br /> môi trường Gause 2 sinh trưởng tốt (sinh khối<br /> đạt 4,58mg/ml) và hoạt tính kháng nấm mạnh<br /> nhất (kích thước vòng vô khuẩn đạt 30mm).<br /> Vì vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường Gause<br /> 2 để sử dụng cho các nghiên cứu ứng dụng<br /> tiếp theo.<br /> Tuy nhiên, để nâng cao khả năng ứng dụng<br /> của chủng HT17.8 cần phải tiếp tục nghiên<br /> cứu cải tiến, tối ưu hóa môi trường và các<br /> điều kiện nuôi cấy để chủng sinh trưởng và<br /> cho hoạt tính kháng sinh cao hơn.<br /> KẾT LUẬN<br /> 1. Chủng HT17.8 có hoạt phổ rộng, đặc biệt<br /> có khả năng kháng mạnh với các chủng nấm<br /> gây bệnh trên chè.<br /> 2. Dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy,<br /> sinh lý sinh hóa kết hợp với trình tự gen 16S<br /> rRNA, chủng HT17.8 được định tên là<br /> Streptomyces sp. HT17.8. Trình tự gen 16S<br /> <br /> 107(07): 97 - 102<br /> <br /> rRNA của chủng này được đăng ký trên ngân<br /> hàng gen thế giới với mã số là JQ012795.<br /> 3. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chất<br /> kháng sinh của chủng Streptomyces sp.<br /> HT17.8 cao nhất trên môi trường Gause 2.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Vi Thị Đoan Chính (2011), Tuyển chọn và<br /> nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng với<br /> một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện,<br /> Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp<br /> Bộ, Mã số B2009 - TN07 – 02.<br /> [2]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu,<br /> Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân<br /> Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp<br /> nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, Nxb KH&CN,<br /> Hà Nội.<br /> [3]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn<br /> thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh<br /> chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án<br /> tiến sĩ sinh học, Hà Nội.<br /> [4]. Gause G. F., Terekhova L. P.,<br /> Preobrazhenskaya T. P., Sveshnikova M. A.,<br /> Maximova T. S. (1983), “A guide for the<br /> determination<br /> of<br /> actinomycetes”,<br /> Genera<br /> Streptomyces, Streptoverticillium, and Chaina,<br /> USA.<br /> [5]. Keswanit J., Whitman W. B. (2001),<br /> “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to<br /> DNA hybridzation in prokaryotes”, International<br /> Journal of Systematic and Evolutionary<br /> Microbiology, 51, 667 - 678.<br /> [6]. Lane D. J. (1991). 16S-23S rRNA sequencing.<br /> In Nucleic Acid Techniques in Bacterial<br /> Systematics, pp. 125–175. Edited by E.<br /> Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester:<br /> Wiley.<br /> [7]. Shirling E. B., Gottlieb D. (1996), “Methods<br /> for characterization of streptomyces species”,<br /> International Journal of Systematic Bacteriology,<br /> 16 (3).<br /> [8]. Waksman S. A. (1961), “The Actinomycetes:<br /> Classification, identification and descriptions of<br /> genera and species”, The Williams & Wilkins<br /> Co., Baltimore, 2, USA.<br /> [9]. Whitman W. B., Keswanit J. (2001),<br /> “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to<br /> DNA hybridzation in prokaryotes”, International<br /> Journal of Systematic and Evolutionary<br /> Microbiology, 51, 667 - 678.<br /> <br /> 101<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />