Đặc điểm sinh học và khả năng kháng nấm của chủng trichoderma phân lập được từ mẫu quả thể nấm Cordyceps militaris bị nhiễm bệnh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự vùng ITS của rDNA, chủng Trichoderma phân lập được thuộc về loài Trichoderma asperellum. Chủng nấm này có khả năng kháng mạnh chống lại ba loài nấm gây bệnh thực vật, đặc biệt ở giai đoạn sau thu hoạch là Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Penicillium digitatum.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đặc điểm sinh học và khả năng kháng nấm của chủng trichoderma phân lập được từ mẫu quả thể nấm Cordyceps militaris bị nhiễm bệnh

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00076 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG Trichoderma PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ MẪU QUẢ THỂ NẤM Cordyceps militaris BỊ NHIỄM BỆNH Trần Văn Tuấn1,*, Đinh Thị Bích Hằng1, Vũ Xuân Tạo2 Tóm tắt: Trong những năm gần đây, nhiều bệnh do nấm gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp ở nước ta. Việc kiểm soát nấm gây bệnh bằng chế phẩm sinh học đang được ưu tiên để hướng đến một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loài thuộc chi Trichoderma có khả năng đối kháng chống lại hàng loạt vi nấm gây bệnh trên cây trồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được chủng nấm Trichoderma từ mẫu quả thể nấm C. militaris bị nhiễm bệnh. Dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự vùng ITS của rDNA, chủng Trichoderma phân lập được thuộc về loài Trichoderma asperellum. Chủng nấm này có khả năng kháng mạnh chống lại ba loài nấm gây bệnh thực vật, đặc biệt ở giai đoạn sau thu hoạch là Aspergillus flavus, Aspergillus niger và Penicillium digitatum. Khi nuôi cấy trên môi trường Czapek-Dox có chứa các nguồn cacbon khác nhau, chủng Trichoderma cho thấy khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử mạnh trên nguồn succrose, galactose và glucose. Chủng nấm Trichoderma phân lập được trong nghiên cứu này có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học dùng phòng chống nấm gây hại cho sản xuất nông nghiệp. Từ khóa: Cordyceps militaris, Trichoderma, đối kháng nấm bệnh. 1. MỞ ĐẦU Hiện nay, có nhiều loài vi nấm gây bệnh ở cây trồng đã được ghi nhận và điều tra như Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium digitatum,… Trong đó đặc biệt là ba loài tồn tại phổ biến trong đất canh tác có thể gây hại cho sản xuất nông nghiệp ở giai đoạn sau thu hoạch, bao gồm A. flavus, A. niger và P. digitatum. Trong đó A. flavus có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại nguyên liệu ở giai đoạn tiền thu hoạch và sau thu hoạch. A. flavus sinh ra độc tố aflatoxin được cho là một trong những độc tố nấm nguy hiểm nhất đối với con người. Aflatoxin rất bền nhiệt và có thể gây ung thư gan (Klich, 2007). A. niger là loài mốc đen điển hình của chi Aspergillus, phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. A. niger gây thối quả thông qua các vết xước, gây mốc đen ở hành tỏi và các loại hạt ở giai đoạn sau thu hoạch. Ngoài ra một số chủng A. niger còn có khả năng sinh độc tố ochratoxin A (Palencia et al., 2010). Trong khi đó, các loại trái cây có múi như cam, quýt, bưởi thường dễ bị nhiễm mốc xanh trong quá trình thu hoạch và bảo quản, trong đó tác nhân gây bệnh P. digitatum có thể chiếm đến 90% tổng thiệt hại (Sharma et al., 2009). Có nhiều phương pháp xử lý nấm bệnh bao gồm các phương pháp vật lý và hóa học. Tuy nhiên, các phương pháp vật lý vẫn còn nhiều hạn chế như: khả năng giảm tỉ lệ bệnh còn thấp, hiệu quả chưa 1Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 2Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ *Email: tuantran@vnu.edu.vn
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 617 cao nên chưa đáp ứng nhu cầu của thực tiễn. Mặc dù, việc sử dụng thuốc hóa học để diệt nấm gây bệnh trên cây trồng có ưu điểm là phổ rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh. Nhưng việc sử dụng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, xuất hiện các chủng nấm bệnh kháng thuốc. Ứng dụng biện pháp kiểm soát sinh học thông qua sử dụng các chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật đối kháng để chống lại các nấm gây bệnh là một trong những ưu tiên hàng đầu trong sản xuất các sản phẩm nông nghiệp an toàn. Vi nấm Trichoderma được đánh giá là có khả năng kiểm soát sinh học tốt thông qua khả năng ức chế, tiêu diệt một số nấm gây bệnh cây trồng nhờ các cơ chế sinh kháng sinh, ký sinh và cạnh tranh (Verma et al., 2007). Việc phân lập và xác định được các chủng Trichoderma có hoạt tính kháng nấm bệnh sẽ góp phần vào việc đa dạng nguồn chủng giống vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu quả thể nấm C. militaris nhiễm bệnh được thu thập ở một xưởng nuôi trồng nấm C. militaris tại Hà Nội. Các chủng nấm gây bệnh thực vật A. flavus, A. niger, P. digitatum do Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phân lập và quan sát hình thái nấm Trichoderma Môi trường được sử dụng để phân lập nấm Trichoderma từ mẫu quả thể nấm C. militaris bị nhiễm bệnh là PDA có bổ sung 100 mg/L kháng sinh chloramphenicol. Kháng sinh chloramphenicol có tác dụng kháng khuẩn, ngăn không cho vi khuẩn sinh trưởng. Phương pháp phân lập được tiến hành bằng cách dùng que cấy gạt một đường trên vị trí có nấm bệnh, cấy ria trên môi trường PDA. Đĩa thạch được đặt ở 28 oC trong 5-7 ngày. Các khuẩn lạc có sợi trắng, bào tử xanh hoặc xanh vàng được tách riêng, làm thuần khiết và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Chủng nấm sau thuần khiết được nuôi cấy trực tiếp trên tiêu bản hiển vi vô trùng có chứa môi trường PDA. Tiêu bản được giữ trong hộp nhựa vô trùng có bổ sung giấy thấm và nước vô trùng để duy trì độ ẩm. Mẫu được ủ ở 28 oC trong 4-5 ngày trước khi hình thái của hệ sợi nấm và cuống sinh bào từ được quan sát dưới kính hiển vi (Vu et al., 2018). Thu bào tử nấm Chủng nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA hoặc CD (Czapek Dox). Sau 5 ngày nuôi ở 28 oC, tiến hành bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi, sau đó dùng que gạt vô trùng gạt nhẹ để tách bào tử ra khỏi hệ sợi nấm. Lọc dịch thu được từ đĩa qua màng lọc Miracloth (Calbiochem, Đức). Dịch qua màng được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, đổ bỏ phần dịch trong. Phần cặn bào tử được rửa hai lần với nước cất vô trùng. Cặn sau ly tâm chứa bào tử nấm được hòa vào nước cất vô
618 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM trùng và điều chỉnh đến nồng độ 106 bào tử/mL sử dụng buồng đếm Thoma. Dịch bào tử được bảo quản ở 4 ºC để sử dụng trong thời gian ngắn hoặc bổ sung thêm 20% glycerol và giữ ở -30 ºC trong thời gian dài (Vu et al., 2018). Định danh chủng Trichoderma bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA Chủng nấm được nuôi trong bình tam giác 100 mL chứa 50 mL môi trường dịch chiết khoai tây PDB ở 28 oC, lắc 200 vòng/phút trong 3 ngày. Sau đó, tiến hành thu hệ sợi nấm bằng cách lọc qua màng lọc Miracloth (Calbiochem, Đức) và được thấm khô bằng giấy lọc trước khi chia vào ống eppendorf 2 mL (khoảng 200 mg). DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của nhóm nghiên cứu đã công bố trước đây. Mẫu DNA được sử dụng để làm khuôn cho PCR khuếch đại vùng ITS của nấm (Tran et al., 2017). Cặp mồi đa năng có khả năng khuếch đại vùng ITS ở nhiều loài nấm khác nhau gồm ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) và ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). Bộ GoTaq® Green Master Mix của hãng Promega (Mỹ) được sử dụng cho PCR, với các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được tinh sạch và được giải trình tự bởi Công ty 1st Base (Singapore). Trình tự ITS thu được được phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.2, MEGA-X và so sánh với dữ liệu trong Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank) sử dụng chương trình BLAST. Đánh giá khả năng đối kháng của chủng Trichoderma với một số nấm gây bệnh Môi trường được sử dụng để đánh giá khả năng đối kháng của chủng Trichoderma với các nấm bệnh A. niger, A. flavus, P. digitatum là môi trường PDA. Trên mỗi đĩa môi trường PDA tiến hành nhỏ 10 μL dịch bào tử (106 bào tử/mL) của nấm Trichoderma và của nấm bệnh ở hai điểm đối diện nhau. Đĩa được giữ ở nhiệt độ 25 ± 2 oC trong 5 ngày. Sau đó, tiến hành đo đường kính của nấm gây bệnh trên đĩa đối kháng, tính phần trăm đối kháng bằng công thức: I = ((C-T)/C) x 100 trong đó I là phần trăm đối kháng, C là đường kính của nấm bệnh khi được cấy trên đĩa môi trường đối chứng, T là đường kính của nấm bệnh trên đĩa đối kháng (ElKomy et al., 2015). Xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng Trichoderma Đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng nấm Trichoderma trên môi trường CD với các nguồn cacbon là glucose, sucrose, mantose, galactose, lactose, pectin, cellulose, xylan, tinh bột. Trên đĩa môi trường với các nguồn cacbon khác nhau lần lượt nhỏ 10 μL dịch bào tử (nồng độ 106 bào tử/mL) của chủng nấm Trichoderma phân lập được. Sau 5 ngày nuôi cấy ở 28 oC, tiến hành quan sát sự sinh trưởng của chủng nấm và định lượng lượng bào tử hình thành. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và đặc điểm hình thái của chủng nấm Trichoderma Từ mẫu quả thể nấm dược liệu C. militaris bị nhiễm bệnh, chúng tôi đã được phân lập được một chủng nấm có đặc điểm giống với Trichoderma. Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28 oC, chủng nấm hình thành hệ sợi màu xanh lan phủ toàn bộ bề mặt
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 619 đĩa thạch tạo thành các vòng tròn đồng tâm. Khi quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần cho thấy hình dạng sợi nấm, cuống sinh bào tử có cấu trúc phân nhánh và có hình chai. Bào tử chủng nấm có dạng hình cầu, bề mặt bào tử trơn, nhẵn, màu xanh đậm (Hình 1). Các đặc điểm này là đặc điểm đặc trưng của nấm Trichoderma (Kubicek & Harman, 1998). Hình 1. Chủng nấm Trichoderma phân lập từ mẫu nấm C. militaris bị nhiễm bệnh. (a) Mẫu nấm C. militaris bị nhiễm bệnh, (b) Chủng nấm Trichoderma trên môi trường PDA, (c) Hệ sợi và cấu trúc sinh bào tử của chủng Trichoderma 3.2. Phân loại chủng nấm Trichoderma dựa trên trình tự ITS của rDNA Kết quả thu giải trình tự sản phẩm PCR sau tinh sạch thu được trình tự ITS với kích thước khoảng 560 bp. Trình tự được so sánh với dữ liệu trên GenBank và kết quả cho thấy chủng Trichoderma phân lập được có mức độ tương đồng rất cao (> 99%) so với các trình tự ITS của loài Trichoderma asperellum. Phân tích chủng loại phát sinh cho thấy chủng Trichoderma thu được thuộc về loài Trichoderma asperellum và có quan hệ gẫn gũi với các loài khác thuộc chi Trichoderma (Hình 2). Hình 2. Cây phát sinh chủng loại dựa theo phương pháp Neighbor Joining tích hợp trong phần mềm MEGA-X 3.3. Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma với một số vi nấm
620 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Chủng nấm Trichoderma đã phân lập được tiến hành đánh giá khả năng đối kháng với nấm gây bệnh A. flavus, A. niger và P. digitatum trên môi trường PDA. Sau 5 ngày nuôi cấy, chủng Trichoderma thể hiện khả năng đối kháng yếu với A. flavus, hiệu quả kháng nấm chỉ đạt 20%. Đối với nấm bệnh A. niger và P. digitatum, chủng Trichoderma thể hiện khả năng kháng mạnh, hiệu quả kháng nấm tương ứng đạt 60% và 85% (Hình 3). Nấm Trichoderma đã được công nhận là vi nấm có khả năng đối kháng chống lại một số nấm gây bệnh cây trồng (Lopes et al., 2012). Theo kết quả nghiên cứu của Kotasthane Anil và các cộng sự (2015) về khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập được với nấm bệnh Sclerotium cho kết quả về mức độ đối kháng nằm trong khoảng 49,5- 81% (Kotasthane et al., 2015). Với hiệu quả kháng nấm đạt được, chủng Trichoderma phân lập được trong nghiên cứu này hoàn toàn có thể sử dùng cho nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học kháng nấm A. niger và P. digitatum. Hình 3. Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma với 3 loài nấm gây bệnh thực vật 3.4. Nguồn cacbon ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng Trichoderma Phần lớn các chế phẩm Trichoderma hiện nay đều ở dạng bột chứa bào tử nấm. Việc xác định được nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng và hình thành bào tử ở nấm Trichoderma là rất quan trọng. Trong nghiên cứu này, 9 nguồn cacbon gồm glucose, sucrose, mantose, galactose, lactose, pectin, cellulose, xylan và tinh bột được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng nấm Trichoderma. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 5 ngày nuôi cấy, chủng nấm Trichoderma đều sinh trưởng và hình thành bào tử khá tốt trên cả 9 nguồn cacbon. Tuy nhiên, sự sinh trưởng chủng nấm Trichoderma trên các nguồn cacbon có sự khác nhau. Với nguồn cacbon là succrose, chủng nấm Trichoderma sinh trưởng mạnh nhất, hệ sợi nấm hình thành nhiều và dày hơn so với các nguồn cacbon khác (Hình 4a). Nguồn cacbon là cellulose và pectin được nhận định là không thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma. Kết quả định lượng bào tử cho thấy, trên môi trường có nguồn cacbon là succrose thu được lượng bào tử lớn nhất, trung bình là 95,5x106 bào tử/mL. Đây cũng là nguồn cacbon được ghi nhận tốt nhất cho sinh trưởng các chủng nấm Trichoderma (Danielson & Davey, 1973). Trên hai nguồn cacbon là galactose và glucose lượng bào tử hình thành tương đối cao, đạt trung bình 89,3x106 và 83,6x106 bào tử/mL. Với ba nguồn cacbon là succrose, galactose và glucose lượng bào tử hình thành gấp 4-5 lần so với các nguồn cacbon còn lại (Hình 4b). Như vậy, succrose, galactose và glucose là nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng nấm Trichoderma.
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 621 Hình 4. Sự sinh trưởng và hình thành bào tử của chủng Trichoderma trên các nguồn cacbon khác nhau. (a) Sự sinh trưởng trên môi trường đĩa thạch, (b) Lượng bào tử hình thành 4. KẾT LUẬN Đã phân lập được chủng nấm Trichoderma từ mẫu nấm C. militaris bị nhiễm bệnh. Chủng nấm Trichoderma được phân loại thuộc loài Trichoderma asperellum dựa trên hình thái và phân tích trình tự vùng ITS của rDNA. Chủng Trichoderma phân lập được có khả năng sinh trưởng và hình thành bào tử mạnh trên các nguồn cacbon là succrose, galactose và glucose. Chủng nấm này có khả năng đối kháng mạnh với hai loài nấm gây bệnh thực vật là A. niger và P. digitatum, nhưng lại có hoạt tính đối kháng yếu với A. flavus. TÀI LIỆU THAM KHẢO Palencia E. R., Hinton D. M., Bacon C. W., 2010. The black Aspergillus species of maize and peanuts and their potential for mycotoxin production. Toxins, 2(4): 399 - 416. Danielson R., Davey C., 1973. Carbon and nitrogen nutrition of Trichoderma. Soil Biology and Biochemistry, 5(5): 505-515. ElKomy M. H., Saleh A. A., EranthodiA., Molan, Y. Y., 2015. Characterization of novel Trichoderma asperellum isolates to select effective biocontrol agents against tomato Fusarium wilt. The Plant Pathology Journal, 31(1): 50-60. Klich M.A., 2007. Aspergillus flavus: the major producer of aflatoxin. Molecular Plant Pathology, 8(6):713-722. Kotasthane A., Agrawal T., Kushwah R., Rahatkar O. V., 2015. In-vitro antagonism of Trichoderma spp. against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani and their response towards growth of cucumber, bottle gourd and bitter gourd. European Journal of Plant Pathology, 141(3): 523-543. Kubicek, C. P., Harman, G. E. (1998). Trichoderma and Gliocladium. Volume 1: Basic biology, taxonomy and genetics. Taylor and Francis Ltd.
622 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Lopes F. A. C., Steindorff A. S., Geraldine A. M., Brandão R. S., Monteiro V. N., Júnior M. L., Silva R. N., 2012. Biochemical and metabolic profiles of Trichoderma strains isolated from common bean crops in the Brazilian Cerrado, and potential antagonism against Sclerotinia sclerotiorum. Fungal Biology, 116(7): 815-824. Sharma R., Singh D., Singh R., 2009. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: A review. Biological Control, 50(3): 205-221. Tran V. T., Do T. B. X., Nguyen T. K., Vu X. T., Dao B. N., Nguyen H. H., 2017. A simple, efficient and universal method for the extraction of genomic DNA from bacteria, yeasts, molds and microalgae suitable for PCR-based applications. Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 59(4): 66-74. Verma M., Brar S. K., Tyagi R. D., Surampalli R. Y., Valero J. R., 2007. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: panoply of biological control. Biochemical Engineering Journal, 37(1): 1-20. Vu X. T., Ngo T. T., Mai T. D. L., Bui T. T., Le H. D, Bui T. V. H., Nguyen Q. H., Ngo X. B., Tran V. T., 2018. A highly efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system for the postharvest pathogen Penicillium digitatum using DsRed and GFP to visualize citrus host colonization. Journal of Microbiological Methods, 144: 134-144. BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND ANTAGONISTIC ABILITY OF THE Trichoderma STRAIN ISOLATED FROM AN INFECTED Cordyceps militaris FRUITING BODY SAMPLE Tran Van Tuan1,*, Dinh Thi Bich Hang1, Vu Xuan Tao2 Abstract: In recent years, many fungal diseases have seriously affected agricultural production in our country. Control of pathogenic fungi with microbial bioproducts is being prioritized towards use in organic and sustainable agriculture. Many studies have shown that numerous species of the Trichoderma genus have the ability to antagonize a wide range of plant pathogenic fungi. In this study, we have isolated a strain of Trichoderma from the infected Cordyceps militaris fruiting body sample. Based on morphological characteristics and sequencing data of the ITS region of rDNA, the Trichoderma isolate belongs to the species Trichoderma asperellum. This strain has strong antagonistic activity against three different plant pathogenic fungi, especially involved in the post-harvest stage Aspergillus flavus, Aspergillus niger and Penicillium digitatum. When cultured on the Czapek-Dox medium containing different carbon sources, the Trichoderma strain showed strong growth and sporulation on sucrose, galactose and glucose. The Trichoderma isolate in this study has the potential to be used in the production of bioproducts, which help to aid the prevention of fungal pathogens in agricultural production. Keywords: Cordyceps militaris, Trichoderma, fungal antagonism. 1University of Science, Vietnam National University, Hanoi 2Center of Experimental Biology, National Center for Technological Progress *Email: tuantran@vnu.edu.vn