Đề tài: Ảnh hưởng của vi khuẩn bacillus subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường Khánh Xuân thành phố Buôn Ma Thuột

Chia sẻ: Nguyen Thi Thuy Trinh | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

334
lượt xem 59
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu đề tài: nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn trong chế phẩm sinh học xử lý nước thải của Nhật Bản và đánh giá khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch của vi khuẩn Bacillus subtilis.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Ảnh hưởng của vi khuẩn bacillus subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường Khánh Xuân thành phố Buôn Ma Thuột

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ BỘ MÔN SINH HỌC THỰC NGHIỆM ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG VIỆC XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM RAU XANH SAU THU HOẠCH TẠI PHƯỜNG KHÁNH XUÂN, THÀNH PHỐ BUÔN MA THUỘT Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trinh Lớp: Cử nhân sinh K11 Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh hóa Đắk Lắk, ngày 09 tháng 10 năm 2014
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề. Việt Nam là một nước đang phát triển với nền tảng là một nước nông nghiệp. Từ một nước có hàng ngàn người chết vì nạn đói năm 1968. Đến nay, Việt Nam là một trong những nước có số lượng nông sản xuất khẩu đứng đầu thế giới. Đắk Lắk nói chung và phường khánh xuân nói riêng, là trung tâm sản xuất nông nghiệp của vùng tây nguyên. Từ nhiều năm nay, khu vực sản xuất rau an toàn ở tổ dân phố 12 thuộc hợp tác xã Nông nghiệp Thuận Hòa (Phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột) đã trở thành nơi tin cậy của nhiều người tiêu dung, các nhà nghiên cứu khoa học và các nhà quản lý sản xuất nông nghiệp. Tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Nông nghiệp Thuận Hòa được thành lập tháng 6 năm 2008 với số hội viên ban đầu là 28 hộ nông dân có tổng diện tích đất sản xuất là 5,6 ha, đến nay, số hội viên của HTX đã tăng lên 44 hộ với tổng diện tích là 6,6 ha [1][6]. Số diện tích đất sản xuất rau tăng lên cũng đồng nghĩa với l ượng phế phụ phẩm trong sản xuất nông nghiệp cũng tăng lên. Lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch được người nông dân sử dụng dung dung để đun nấu và một phần rất nhỏ được dung để sản xuất phân xanh. Tuy nhiên, hiện nay hầu hết các hộ dân đã chuy ển sang dung các loại nguyên liệu khác như: than, gas, điện…. Đặc biệt, vào mua mưa hoặc là những lúc gặp dịch bệnh, lượng phế phụ phẩm tăng lên nhiều. Lượng phế phụ phẩm quá nhiều, người dân không kịp xử lý và khi chúng tự phân hủy sẽ gây ra mùi hôi thối rất khó chịu làm ô nhiễm môi trường và tọa điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh cho hoa màu phát triển, gây ảnh hưởng đến hiệu quả của vụ canh tác tiếp theo. Để góp phần vào việc giúp đỡ người nông dân xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus Subtilis trong việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau thu hoạch tại phường Khánh Xuân, Thành phố Buôn Ma Thuột”. 2. Mục tiêu đề tài.
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn trong chế phẩm sinh học xử lý nước thải của Nhật Bản và đánh giá khả năng x ử lý phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch của vi khuẩn Bacillus subtilis. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. 3.1. Ý nghĩa khoa học. Đánh giá khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch (gốc rau và lá rau bị hỏng) của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học xử lý môi trường của Nhật Bản, từ đó bổ sung thêm nhóm vi khuẩn có giá trị này vào việc xử lý phế phụ phẩm rau xanh tại phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột. 3.3. Ý nghĩa thực tiễn. Việc nghiên cứu và sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng xử lý phế phẩm rau xanh góp phần quan trọng trong việc giảm ô nhiễm môi trường và hạn chế các mầm bệnh phát triển tại khu sản xuất rau an toàn ở phường khánh xuân, từ đó bảo vệ môi trường và cải thiện tình hình sản xuất nông nghiệp ở đây. 4. Giới hạn của đề tài. Trong quá trình thực hiện, vì lý do kinh phí có hạn nên đề tài không thể thực hiện lặp lại thí nghiệm nhiều lần. Địa điểm tiến hành thí nghiệm là tại khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa, tổ dân phố 12, phường Khánh Xuân, TP. Buôn Ma Thuột.
PHẦN I . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về phường Khánh Xuân 1.1.1 Điều kiện tự nhiên  Vị trí địa lý: Diện tích: tổng diện tích tự nhiên là 21,88 km2. Phường Khánh Xuân được thành lập ngày 21, tháng 1, năm 1995 Tọa độ: • 12o38’34”B • 107o59’17”Đ - Phía Đông tiếp giáp phường Ea Tam, thành phố Buôn Ma Thuột. - Phía Tây tiếp giáp xã Hòa Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột. - Phía Nam giáp xã Hòa Khánh, thành phố Buôn Ma Thuột. - Phía Bắc giáp Phường Tân Thành, thành phố Buôn Ma Thuột.  Địa hình, địa chất Phường Khánh Xuân có địa hình tương đối gồ ghề và có hướng nghiêng dần từ Đông sang Tây. Đất nâu vàng trên đá Bazan thích hợp với nhiều loại cây công nghiệp hàng năm và lâu năm. Đất đỏ vàng trên đá phiến sét. Đất đen trên sản phẩm đá Bazan.  Khí hậu, thủy văn: Phường Khánh Xuân nằm ở vùng khí hậu cận nhiệt đới, khí hậu gió mùa, một năm có hai mùa rõ rệt, mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10 và mùa nắng bắt đầu từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Các thông số về điều kiện khí hậu của phường Khánh Xuân được trung tâm dự báo khí tượng thủy văn tỉnh Đắk Lắk ( trạm Buôn Ma Thuột), ghi nhận từ năm 2004 – 2006 như sau: + Nhiệt độ, độ ẩm: Nhiệt độ bình quân khoảng 23,6oC. Độ ẩm bình quân là 84%, thấp nhất là 71%. Về mùa khô không khí thường khô hạn.
+ Lượng mưa: Lượng mưa bình quân hàng năm khoảng 1.900-2.000 mm tập trung vào mùa mưa (90%). Lượng mưa phân bố không đều, ảnh hưởng đến sản xuất nhất là sản xuất nông nghiệp và sinh hoạt của nhân dân. + Hệ thống sông suối: có suối Ea Knia và suối Ea Tam. + Hệ thống Hồ, Đập: có hồ Thống Nhất, hồ Đồi Thông và đập Giò Gà. 1.1.2. Điều kiện kinh tế xã hội  Dân số: Năm 1999 phường Khánh Xuân có khoảng 21583 người. Hiện nay, dân số của phường đã có khoảng 23.444 người với mật độ là 986 người/km2. ‘ Trên địa bàn phường có 16 thôn, buôn và có 2 dân tộc anh em cùng chung s ống, đó là dân tộc Kinh và Ê Đê. Người dân chủ yếu sống bằng nghề nông (lúa, cà phê, hoa màu)  Đất đai: Tổng diện tích đất tự nhiên: 2.184 ha. Trong đó được phân ra: - Đất nông nghiệp: 1.216,00 ha • Đất trồng cây hằng năm: 653,02 ha • Đất trồng cây lâu năm: 562,98 ha - Đất lâm nghiệp: 64 ha • Rừng tự nhiên: 0 ha • Rừng trồng: 38,8 ha  Nông nghiệp: Tổng diện tích đất gieo trồng cả năm là 1.673 ha. Trong đó trồng các loại cây sau: Bảng 1: Các loại cây trồng và sản lượng hàng năm tại phường Khánh Xuân TT TÊN CÁC LOẠI CÂYSỐ LƯỢNG/
TRỒNG SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM 1 Cà phê 990 tấn 2 Tiêu 84 tấn 3 Điều 112,8 tấn 4 Lúa 2.628 tấn 5 Rau các loại 3.300 tấn 6 Hoa màu 45 ha/270 tấn Chăn nuôi: Bảng 2: Các loại vật nuôi và sản lượng hằng năm tại phường Khánh Xuân TÊN CÁC LOẠI VẬTSỐ LƯỢNG/ TT NUÔI SẢN LƯỢNG HÀNG NĂM 1 Heo 700.000 kg 2 Gà 180.000 kg 3 Bò 375.000 kg 4 Ong 1.075 thùng 5 Cá 90.000 kg Bảng 3: Các đại lý, của hàng cung cấp thức ăn chăn nuôi, thuốc thú y, thủy sản, phân bón. TT TÊN ĐỊA CHỈ ĐIỆN THOẠI TDP 9 0500.3868631 1 HTX NN Thuận Hòa TDP 2 05003827402 2 HTX NN Thống Nhất 1.2. Phế phụ phẩm nông nghiệp 1.2.1. Khái niệm
 Khái niệm: Phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm tàn dư thực vật được để lại sau khi thu hoạch các sản phẩm trồng trọt và phế thải sau quá trình chế biến nông s ản bao gồm các hợp chất hydratcacbon, protein, photpho khó tan và một số các hợp chất hữu cơ khác. Sản phẩm sau quá trình phân hủy ngoài tác dụng cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng còn có khả năng làm cho đất tơi xốp, cải thiện các đặc tính của đất, nhất là khả năng giữ nước. 1.2.2. Các phương pháp xử lý: Phế phụ phẩm trong sản xuất nông nghiệp bao gồm phế phụ phẩm sau khi thu hoạch và các phế phụ phẩm sau khi chế biến. Lượng phế phụ phẩm thải ra hằng ngày là rất nhiều. Ở nhiều nơi như ở đồng bằng sông cửu long, lượng phé phụ phẩm thải ra quá nhiều mà người dân không có biện pháp xử lý đã gây ra hiện tượng ô nhiễm nghiêm trọng. Có nhiều biện pháp để xử lý các loại phế phụ phẩm nông nghiệp tùy thuộc vào loại phế phụ phẩm được thải ra. Tuy nhiên, các biện pháp này chỉ mang tính khu vực, phụ thuộc vào tập quán sản xuất của người dân.  Dùng Làm thức ăn cho gia súc: Các loại phế phụ phẩm như rơm rạ, thân cây bắp, cây mì… thường được người dân sử dụng để làm thức ăn cho các loại trâu bò.  Dùng làm nguyên liệu để đun nấu: Ở một số vùng quê nghèo, người dân vẫn thường dùng rơm rạ hay vỏ trấu để đun nấu phục vụ cho cuộc sống hằng ngày.  Dùng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ: Các loại phế phẩm như rơm rạ, vỏ cà phê, thân cây bắp… được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ t ại một khu vực nhỏ. Tuy nhiên, vẫn còn một số lượng lớn phế phẩm không được sử dụng, đặc biệt là phế phụ phẩm rau xanh. Chúng thường được người dân đem đổ bỏ sau khi thu hoạch, khi phân hủy thì chúng tạo ra mùi hôi thối rất khó chịu và gây ô nhiễm môi trường. 1.3. Vi sinh vật dùng trong xử lý. 1.3.1. Các nhóm vi sinh vật
 Các vi khuẩn hiếu khí: Chủ yếu là các vi sinh vật thuộc các chi Arzotobacter, Achromobacter, Pseudomonas, Cellumonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium….  Các vi khuẩn kị khí: Điển hình là các vi khuẩn có trong dạ dày của động vật nhai lại như các vi khuẩn thuộc các chi Ruminococcus flavefeciens, R. albus, R. parvum, Bacteroides succinpgenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium cellobioparum, Cillobacterium cellulosolvens….  Các xạ khuẩn hiếu khí: Là các vi khuẩn thuộc các chi Micromonospora, Proactinomyces, Actinomyces, Streptomyces…  Các nhóm vi nấm: Nẩm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một lượng lớn enzymes có đầy đủ các thành phần. Ví dụ như Nấm mốc ( thuộc các chi: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium…), Nấm đốm (ví dụ như các loài: Ceratocystis sp, Cladosporium sp, Aureobasidium sp, …), Nấm mục (là các loại nấm thuộc các chi: Chaetomium, Humocola và Phialophora).[2] 1.3.2. Vi sinh vật phân giải cenlulose Cenlulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật. Cenlulose là hợp chất rất bền vững, đó là loại polysaccharide cao phân tử. Trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật sinh ra các men xúc tác cho quá trình phân giải cenlulose. Chúng có ý nghĩa rất l ớn trong việc thực hiện vòng tuần hoàn Cacbon trong tự nhiên, góp phần quan trọng trong việc nâng cao độ phì nhiêu của đất. Cenlulose có thể bị phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện thoáng khí. Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia vào quá trình phân giải cenlulose. Ví dụ như các loài vi khuẩn: Cytophaga, Cellulomonas, giống Bacillus, giống Clostridium, Aspergillus, Penicillium….  Cơ chế phân giải cenlulose:[3] Chất hữu cơ là thành phần rất quan trọng trong quá trình hình thành và làm thay đổi độ phì của đất. Sự chuyển hóa các chất hữu cơ trong đất chủ yếu đi theo hai hướng là vô cơ hóa các chất hữu cơ và mùn hóa vật chất hữu cơ.
Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn. Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo ra mùn. Khi mùn được tạo thành, VSV lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển háo này giúp đất tích lũy NH3, quá trình tạo thành NH3 trong đất xảy ra rất chậm chạm, điều này thì rất có lợi cho cây trồng vì quá trình này giải phóng t ừ từ NH3 cho cây hấp thụ: Chất mùn + O2 + Vi sinh vật  CO2 + H2O + NH3 1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis. 1.4.1. Lịch sử phát hiện. Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 bởi Christion Erenberg và ông đã dặt tên cho loài vi khuẩn này là “Vibrio subtilis”. Hơn 30 năm sau, Casimir Davaine đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Đến năm 1872, Ferdimand Cohn đã quan sát loài vi khuẩn này có đ ầu hình vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 1941, tổ chức y học Nazi của Đức đã phát hiện được vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân ngựa. Lúc đầu chủ yếu được dùng trong phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ của Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949-1957, khi Henry và các cộng sự tách được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết. Từ đó, “thuốc subtilis” hay còn gọi là “subtilis therapy” ra đời và được sản xuất hàng loạt dùng trong diều trị các chứng viêm đại tràng, viêm ruột, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, nó được sử dụng rộngrãi trong y học, thực phẩm, chăn nuôi.[4] 1.4.2. Đặc điểm phân loại, sự phân bố và đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn Bacillus subtilis  Đặc điểm phân loại: Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis  Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc, chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng nhiều cư trú trong đất, đặc biệt là cỏ khô nên còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô, thông thường các loại đất trồng trọt có chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g. Các loại đất nghèo chất dinh dưỡng như đất ở vùng sa mạc, đ ất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Bào tử và tế bào của vi khuẩn cũng được tìm thấy ở vùng cửa sông và ở biển.[4] 1.4.3. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương,hình que, ngắn và nhỏ, hai đầu nhỏ, kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, các tế bào thường đứng riêng rẽ hoặc đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo thành chuỗi dài ngắn khác nhau. Vi khuẩn có 8 – 12 lông, có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do s ự n ứt của bào tử, không kháng a xít, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ. Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép l ồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo từ polypeptit chủ yếu là a xít polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu đ ược điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn.[4] 1.4.4. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon cho quá trình sinh tổng của bản thân, trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là vitamin và amino axit - Điều kiện phát triển: hiếu khí, là loài ưa nhiệt cao, nhiệt độ thích hợp là từ 36oC – 50oC, tối đa khoảng 60oC. - Nhu cầu oxy: Bacillus subtilis phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy và phát triển tốt trong môi trường giàu oxy vì vi khuẩn thuộc nhóm hiếu khí không bắt buộc. - Độ pH: Bacillus subtilis phát triển mạnh ở pH = 7,0 – 7.4. - Môi trường nuôi cấy: + Môi trường thạch đĩaTSA: khuẩn lạc tròn, rìa rang cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. + Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám. rìa nhăn gợn sóng. + Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. + Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. + Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vầng mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.[4] 1.4.5. Đặc điểm sinh hóa Khi lên men, vi khuẩn Bacillus subtilis không tạo ra các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Thử nghiệm Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).[4] Bảng 4: Kết quả các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis. Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol -
MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrat + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Manitol + Glucose + Lactose - Maltose + 1.4.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.6.1. Cấu tạo bào tử Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,8 – 1,8µm. Phía ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ của bào tử có nhiều lớp. Đây là những l ớp có tác dụng ngăn cản sự thẩm thấu của nước và các chất hòa tan trong nước. Bên dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong
các bào tử tự do không xảy ra sự trao đổi chất, vì vậy có thể giử ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm. Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và tính chất sinh lý.[4] 1.4.6.2. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu kì phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất l ợi ( khi dinh d ưỡng trong môi trường sống bị kiệt quệ). Bào tử phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì sinh sản của vi khuẩn Quá trình hình thành bào tử bao gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng vi khuẩn Bacillus subtilis cần khoảng 8 giờ để hoàn tất quá trình hình thành bào tử. Ban đ ầu khối nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào t ử phát triển và tr ở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng sẽ bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ có thể tạo ra một bào tử duy nhất nên đây không phải là một hình thức sinh sản của vi khuẩn mà nó chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi[4]. 1.4.7. Hệ enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis Trong tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis, cũng như trong các vi sinh khác đều có những enzymes xúc tác cho các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp và nằm trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có kkhar năng di chuy ển qua màng tế bào, chúng dược gọi là các enzyme nội bào. Các enzyme nội bào của vi khuẩn Bacillus subtilis bao gồm: các enzyme thủy phân như protease nội bào, penicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; Các enzyme tổng
hợp như aspagagin-syntetase; Các enzyme tham gia vào các quá trình oxy hóa – khử như Dehydrogenase, Oxydase, Cytochrom, Peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chatas có trong tế bào. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để thích nghi với điều kiện môi trường gọi là các enzyme ngoại bào. Chúng bao gồm các enzyme như: amylase (α-amylase), β-glucanase, xylanase, protease… [5] Bảng 6: Các enzymes của vi khuẩn Bacillus subtilis Nhiệt độ Enzyme pH tối ưu Phản ứng thủy phân tối ưu (oC) Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong α-amylase 70-80 5,6 – 6,2 tinh bột và những polysaccharide khác, tạo ra các dextrin và oligosaccharide. Thủy phân lien kết β-1,6-glucoside của β- β-glucanase 35-55 6,0 – 7,0 glucan tạo ra những chất có phân tử lượng thấp. Thủy phân lien kết xylan – một thành Xylanase 25 5,0 phần của hemicellulose. Thủy phân lien kết peptide, protein và các Protease 40 6,2 – 7,4 polypeptide, tạo ra các peptide có phân tử lượng thấp hơn và các amino axit. 1.4.8. Bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis. Trình tự bộ gen của vi khuẩn Bacillus subtilis đã được nghiên cứu giải mã thành công và công bố lần đầu tiên năm 1997. Bộ gen của vi khuẩn này chứa 4,2Mb, xấp xỉ 4.110 gen. Trong đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, có 79 gen được dự đoán là thiêt yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan tới quá trình trao đổi chất của tế bào.[4] 1.5. Tình hình nghiên cứu 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Việc xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp đã và đang được rất quan tâm, đã có rất nhiều nghiên cứu để xử lý và tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp.
Năm 2010 Nguyễn Duy Khang đã chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sản xuất giá thể trồng hoa lan từ các phế phụ phẩm nông nghiệp ở Lâm Đồng. Các nhà sinh học tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã hoàn thiện được quy trình này. [6] Nhóm nghiên cứu đã sử dụng các loại phế phẩm như bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận dụng trong sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, có khả năng phân giải các phế phụ phẩm này thành các giá thể trồng hoa, không chỉ hoa địa lan mà còn có thể trồng nhiều loại hoa cũng như các loại cây cảnh khác thay cho các giá thể truy ền thống. Hiện đề tài đang được tiếp tục phát triển theo hướng dự án thử nghiệm và sản xuất trên diện rộng để đáp ứng nhu cầu của bà con nông dân. Tại Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 diễn ra tại Đại học Đà Nẵng năm 2010 2 sinh viên trường Đại học Bách Khoa đã báo cáo đ ề tài nghiên c ứu s ử dụng các phế phẩm nông nghiệp để chế tạo tấm Panel cách nhiệt sử dụng trong dân dụng và công nghiệp[7]. Các tấm panel mặc dù được sản xuất thủ công nhưng chất lượng thẩm mỹ có thể sử dụng đượctrong công nghiệp và đời sống và có thể s ử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như la phông, trang trí trần… đây là đề tài mới và ý nghĩa thực tiễn cao. Năm 2013 Trần Thị Tâm, Lương Hữu Thành, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản, Phạm Bích Hiên đã nghiên cứu sử dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp[8]. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis, Streptomyces hygroscopicus, Bacillus polyfermenticus và Bacillus velezensis được lựa chọn từ microbial di truyền nguồn lực của viện thổ nhưỡng Nông hóa cá thể phá vỡ các hợp chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, lexetin và protein, và cân nặng của phế thải nông nghiệp giảm 60-70% sau 60 ngày xử lý bằng vi sinh vật.
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm tiến hành nghiên cứu  Đối tượng nghiên cứu: + Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ chế phẩm xử lý nước thải của Nhật Bản. + Phế phụ phẩm rau xanh sau khi thu hoạch thu tại tổ sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa, tổ dân phố 12, phường Khán Xuân, thành phố Buôn Ma Thuột.  Địa điểm tiến hành nghiên cứu: + Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc bộ môn Sinh học thực nghiệm, khoa KHTN & CN, trường Đại học Tây Nguyên. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng xử lý phế thải nông nghiệp trong chế phẩm sinh học. -Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis. -Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis. + Môi trường nuôi cấy + Nhiệt độ + Độ pH + Tốc độ lắc -Nghiên cứu một số yếu tố ảnh đến khả năng xử lý phế phụ phẩm rau xanh của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được tuyển chọn. + Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn xử lý. + Ảnh hưởng của thời gian xử lý 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu phế phụ phẩm rau xanh được thu gom tại vườn rau của một số hộ dân thuộc khu sản xuất rau an toàn thuộc HTX Thuận Hòa. Sau khi thu gom, ta sẽ tr ộn đ ều những thứ thu được rồi chia thành từng đống nhỏ để tiến hành nghiên cứu. 2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ chế phẩm sinh học xử lý nước thải Lấy 1g mẫu chế phẩm sinh học pha loãng bằng nước muối sinh lý; Cấy trải trên môi trường dinh dưỡng MPB, ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, thu từng khuẩn lạc đơn, cấy ria khuẩn lạc trên môi trường thạch nghiêng. Làm thuần khiết khuẩn lạc sau nhiều lần cấy ria trên đĩa thạch. Đánh dấu kí tự các chủng vi khuẩn. Quan sát, mô tả hình thí khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập. 2.3.3. Phương pháp đánh giá khả năng sử dụng oxy của vi khuẩn phân lập Nguyên tắc: dựa trên nhu cầu khác nhau của vi khuẩn đối với oxy. Căn c ứ vào quan hệ đối với oxy, vi khuẩn được chia thành 4 nhóm lớn như sau: 1. Hiếu khí bắt buộc: vi khuẩn sinh trưởng trên bề mặt và lớp trên cùng c ủa ống môi trường. 2. Vi hiếu khí: vi khuẩn sinh trưởng cách bề mặt môi trường. 3. Kỵ khí không bắt buộc: vi khuẩn phát triển dọc theo cả chiều dài của ống môi trường. 4. Kỵ khí bắt buộc: vi khuẩn chỉ phát triển dưới đáy ống môi trường. Dựa vào vị trí phân bố trong ống môi trường như trên để xác định nhu cầu oxy của vi khuẩn phân lập[11]. Cách tiến hành: - Chuẩn bị ống giống vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB lỏng (cao thịt 3g, pepton 10g, NaCl 5g, nước cất 1000ml; khử trùng ở áp suất 1atm trong 30 phút). - Tạo các ống chứa khoảng hơn ½ môi trường MPB đặc để xác định nhu cầu oxy của các vi khuẩn Bacillus subtilis. Sau khi khử trùng, không tạo thạch nghiêng, để ống nghiệm thẳng đứng. - Dùng que cấy đầu nhọn nhúng vào dung dịch giống và cấy giống vào đến đáy ống thạch đứng. Chú ý: cấy giống vào khi môi trường thạch chưa đông cứng. Tất cả các thao tác trên đều thực hiện trong box cấy vô trùng.
Thí nghiệm trên được lặp lại ba lần. Sau 20 ngày, quan sát và chụp hình kết quả về cách hiện diện của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong ống thạch đứng để đánh giá nhu cầu về oxy. 2.3.4. Phương pháp định danh vi khuẩn tuyển chọn 2.3.4.1. Phương pháp xác định hình thái, tính gram Phương pháp xác định hình thái và kích thước của khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn được tuyển chọn bằng phương pháp vi sinh truyền thống. Phương pháp đo kích thước tế bào: d ùng thước đo thị kính và thước đo vật kính quan sát dưới kính hiển vi quang học. Thước đo thị kính là một miếng thủy tinh tròn, ở chính giữa có một thước nhỏ 5 mm được chia thành 100 phần bằng nhau và đ ược đánh số từ 0 − 100. Thước đo vật kính là một tấm thuỷ tinh, ở giữa có một thước nhỏ 1mm được chia thành 100 khoảng đều nhau, vì vậy mỗi khoảng chia là 0,01mm hay 10 µm. Xác định giá trị mỗi khoảng của thước đo thị kính. Tiến hành đo kích thước theo trình tự sau: - Đặt tiêu bản có vi sinh vật cần đo lên bàn kính. Điều chỉnh bàn kính sao cho thấy rõ tế bào vi sinh vật và thước đo thị kính. - Điều chỉnh bàn kính sao cho tế bào vi sinh vật nằm gọn và dọc theo thước đo thị kính. - Đếm số khoảng mà tế bào vi sinh vật choán chỗ, nhân với giá trị của mỗi khoảng. Phương pháp xác định tính gram của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm. Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn. Dùng phương pháp nhuộm gram để xác định. - Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ t ẩy ph ức chất màu giữa Crystal violet và iốt (trong dung dịch Lugol). Kết quả bắt màu tím. - Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi tẩy màu thuốc nhuộm đầu, sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ xung (đỏ vàng với safranin, đỏ tía với Fuchsin). 2.3.4.2. Phương pháp định danh sinh học phân tử
Mẫu được gửi đến Công ty Nam Khoa, Tại địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7, thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.5. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lấy 0,1ml chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi trong 10ml môi trường MPB lỏng và đánh giá sự sinh trưởng của vi khuẩn qua phương pháp đo độ đục [9] (OD 610nm) của dung dịch nuôi cấy vào các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 giờ. Dựa trên nồng độ OD và thời gian nuôi cấy của chủng lập đồ thị đường cong sinh trưởng cho chủng được tuyển chọn. Mỗi thời điểm khảo sát lặp lại 3 lần. 2.3.6. Phương pháp xây dựng đường cong tuyến tính giữa nồng độ vi khuẩn và chỉ số OD 610nm Nhân nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trường MPB. Xác định độ đục của dung dịch vi khuẩn ở các độ pha loãng khác nhau. Tại mỗi độ pha loãng của dung dịch có OD trên được cấy trãi trên môi trường thạch đĩa. Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa môi trường ở các độ pha loãng. Mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 đĩa peptri. Kết quả được tính như sau: Trong đó: - A : Số tế bào vi khuẩn trong một mẫu ban đầu - N : Tổng số khuẩn lạc đếm được - n : Số đĩa có khuẩn lạc đếm được tại mỗi nồng độ pha loãng ( đĩa có số khuẩn lạc 25 – 250). - v : Dung tích mẫu cấy vào mỗi đĩa - fi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. Dựa vào phương trình tương quan trên để xác định nồng độ tế bào vi khuẩn c ủa dung dịch thông qua chỉ số OD 610nm. 2.3.7. Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn tuyển chọn 2.3.7.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy