Đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể - PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương

Chia sẻ: Nga Nga | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:42

Thêm vào BST

Báo xấu

162
lượt xem 20
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể được thực hiện nhằm mục tiêu hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y; ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y; ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể - PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ PGS. TS. Trần Thị Thanh Hương
• DTBS: 2,7% tổng số đẻ TVDT & • Ng/nhân: ĐB gen, ĐB NST... CĐTS • Thu thập mẫu: TB ối, ối tua rau, máu cuống rốn, sinh thiết thai, TB thai tự do trong máu mẹ... • KT phát hiện: – DT tế bào: phân tích NST  tiêu chuẩn C§RLNST – DT phân tử – DT tế bào – phân tử
CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN DTTB Tiêu chuẩn phát - phân tích NST băng G hiện ĐB NST THU THẬP MẪU: - Chọc ối - Sinh thiết rau DTPT: PCR, Sequencing, phát hiện - Máu cuống rốn Southerblot, Northerblot... BĐ gen - Soi phôi thai - ADN tự do máu mẹ Phát hiện ĐB DTTB – PT: FISH NST: SL, RL nhỏ
Các loại ADN dò ADN dß đ?u ADN dß t? ADN d ß l?p đ?c ADN d ß p h?n m út c h?c h?c h hi?u trên b ăng R tâm nhân ADN dß ADN d ß đ?c hi?u ADN d ß đ?c hi?u lo c us to ànb? NST nhánh NST
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH  THẾ GIỚI  VIỆT NAM • 2003 B.V.M.Hoàng-T/p • 1969 bắt đầu, HCM: áp dụng CĐTS 1980 đầu dò huỳnh quang Thập kỷ 90 ứng dụng rộng rãi • 2004 BM YSH – DT ĐHYHN: hoàn chỉnh, • Phát hiện trước sinh các RL CĐTS HC Down NST:HC Down, Edward, • 2007 viện HH-TM: CĐ Patau, Turner... leceumia • Mất đoạn nhỏ
1 Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y 2 Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y 3 Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST X
Mục tiêu 1 Mục tiêu 2 Mục tiêu 3 Cần KQ FISH  Đầu dò ADN 73 đối chiếu: 13, 18, 21, X, Y: thai + 2 bệnh nhân: + 3 mẫu ối: 1518w phụ RLCT NST 21, X + 3 mẫu ối: 2832w  Siêu âm (+): + 1 mẫu ối RLCT NST 13 Nang BH Đầu dò ADN Cần KQ FISH  Dày da gáy TelXp/Yp & chẩn đoán: Dị dạng chi, TelXq/Yq: + 2 bệnh nhân: nội quan 3 mẫu ối: 1518w NST marker  Triple test (+) hoặc (-) + 1 trẻ nam 46,XX
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis) Lấy mẫu – làm tiêu bản Lấy mẫu - Nuôi cấy – Làm nhân TB gian kỳ tiêu bản NST kỳ giữa Biến tính ADN Lai ADN dò và ADN đích Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Phân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang (50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu)
QUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis) 1. Làm tiêu bản TB ối ở gian kỳ hoặc nuụi cấy làm tiêu bản NST kỳ giữa  2. Biến tính ADN dò và ADN đích của mẫu XN  3. Lai ADN dò với ADN đích của thai (2024h)  4. Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quang  5. Phân tích dưới KHV huỳnh  quang tìm tín hiệu lai Kết quả sau 23 ngày
CÁC ĐẦU DÒ ADN VÀ PHIN LỌC TƯƠNG ỨNG Phin lọc Aqua Phin lọc green Đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y Phin lọc orange Phin lọc green Phin lọc orange Đầu dò ADN Tel Xp/Yp (TTAGGG)n Telomere ADN Đầu dò ADN TelXp Phin lọc green
BẢNG ĐÁNH GIÁ TÍN HIỆU LAI (VYSIS) 1 Không đánh giá vì hai tế bào chồng lên nhau Đếm là 2 tín hiệu lai, 2 1 tín hiệu bị khuếch tán 3 Không đánh giá vì các tế bào chồng lên nhau 4 Đếm là 2 tín hiệu lai, 1 tín hiệu bị chia nhỏ 5 Đếm là 3 tín hiệu lai 6 Đếm là 4 tín hiệu lai 7 Đếm là 3 tín hiệu lai, 1 tín hiệu bị chia nhỏ
SƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTS LÀM HỒ SƠ Thai phụ 35 tuổi XN triple test Siêu âm TS sinh con DT AFP, HCG, uE3 XĐ thai phụ nguy cơ cao sinh con bất thường NST TV di truyền – Sản khoa Chọc ối – CĐ trước sinh XN: DTTB – phân tích NST KT FISH Tư vấn DT – Theo dõi QT mang thai, sau sinh
1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISH 2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NST 3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ RỐI LOẠN NST
1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISH Bảng 1. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳ KẾT QUẢ FISH (s è tÝn hiÖu lai) KÕt qu¶ Mẫu TuÇn thai NS T 13 NS T 18 NS T 21 NS T X NS T Y DTTB 1 15 2 2 2 2 0 46, XX 2 18 2 2 2 1 1 46,XY 3 18 2 2 2 1 1 46,XY 4 28 2 3 2 2 0 47, XX +18 5 30 2 2 3 1 1 47,XY,+21 6 32 2 2 2 1 1 46, XY
HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG • Thể tích dịch ối: – Thai 15-18w: 5ml – Thai 28-32w: 10ml • Xử lý nhân TB – Loại trừ máu mẹ (nếu lẫn) – Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thai • Biến tính ADN: 730C x 3’ • Lai ADN dò và ADN đích: – thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm – Thời gian lai 20-22h • Phân tích tín hiệu lai – Tín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước ổn định – Tín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước không ổn định
Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thường NST 13 NST 21 NST 21 NST 13 Đầu dò ADN 13, 21 NST 18 NST Y NST X NST 18 Đầu dò ADN 18, X, Y
Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bình thường NST 13 NST 21 NST 13 NST 21 Đầu dò ADN 13, 21 TRƯỚC SINH NST 18 NST 18 NST X NST X Đầu dò ADN 18, X, Y
Bảng 2. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữa KÕt quả FISH (sè tÝn hiÖu lai) ĐÇu dß ĐÇu dß ĐÇu dß 13, 18, 21, X, Y KÕt Ký TuÇ Tel Xp/Yp Tel Xq/Yq quả di hiÖu n truyÒn mÉu thai NS T NS T NS T NS T NS T Xp Yp Xq Yq tÕ bµo 13 18 21 X Y 1 15 2 2 2 2 0 2 0 2 0 46, XX 2 15 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY 3 18 2 2 2 1 1 1 1 1 1 46, XY
HOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNG • Thu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt thanh, carnoy... • Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng cồn 70%/2’, 80%/2’, 100%/2’. • Biến tính ADN: 730C x 5’ • Lai ADN dò và ADN đích: – thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mm – Thời gian lai 420C: 20-22h (13, 18, 21, X, Y) 22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq) • Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST  đánh giá dễ hơn nhân gian kỳ