zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Định danh xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ cây có múi

Chia sẻ: Kethamoi5 Kethamoi5 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Báo xấu

49
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tiến hành định danh đến loài xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh và trình tự gene vùng 16S-rRNA. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Định danh xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm Fusarium solani gây bệnh vàng lá thối rễ cây có múi

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 sâu bệnh hại rừng trồng” NXB Nông nghi p, H 8 Ph m Quang Thu, 6 Danh mục sinh vật gây N i, hại trên 17 loại cây lâm nghiệp ở Việt Nam NXB Nông 7 Nguyễn Viết Tùng, 6 Bảng tra phân loại các nghi p H N i, 6 bộ côn trùng (theo pha trưởng thành), NXB Nông nghi p, H N i Phản biện: PGS.TS. Lê Văn Trịnh ĐỊNH DANH XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM FUSARIUM SOLANI GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CÂY CÓ MÖI Identification of Actinomycete as Potential Antagonistic Ability Control Yellow Leaf and Root Rot Disease on Citrus Lê Minh Tƣờng, Ngô Thành Trí và Nguyễn Hồng Quí Nghiên cứu viên ngành Bảo vệ hực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần hơ Ngày nhận bài: 16.07.2018 Ngày chấp nhận: 08.08.2018 Abstract Three actinomyces isolates that have inhibit growth of Fusarium solani cause yellow leaf and root rot on citrus are collected and isolated from citrus fields in Long My district, Hau Giang province (LM6 and LM25) and Lai Vung district, Dong Thap province (LV74) of the Mekong delta in 2017 (Le Minh Tuong et al., 2018). In this research, the these actinomycete isolates were identified based on morphological characteristics of cultured colony on the ISP mediums and their biochemical characteristics. In addition, the these isolates were also identified based on the 16S- rRNA gene sequence. The results showed that LM6 and LM25 isolates are straight form of spore-bearing mycelium and spore chains; LV isolate’s spore-bearing mycelium belongs to straight form, spore chains with hooks form; surface spores was smooth with three isolates. The colors of substrate of the LM6 isolate belongs to red group, LM25 isolate belongs to light yellow group and LV74 isolate be long to white group. The LM6 and LM25 isolates can product melanin pigment, the LV isolate can’t product melanin pigment and all isolates have ability to product extracellular enzymes such as protease, lipase, amylase. Comparison of the 16S-rDNA gene sequence with existing on Gene bank indicated that LM6 isolate showed 99% similarity with Streptomyces capoamus isolate, LM25 isolate showed 100% similarity with Streptomyces bacillaris isolate and LV74 isolate showed 99% similarity with Streptomyces lavendulae isolate. The results of this study will be a basis for further researchs, contributing in applications of actinomycetes as biocontrol to yellow leaf and root rot disease on citrus. Key words: Actinomycete, biochemical characteristics, identification, morphological characteristics. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ tăng sức kh ng với m m b nh v g p ph n gia tăng năng suất (Watve et al., 2001). Theo Nhằm ph t tri n nông nghi p theo hướng b n nghiên cứu c a Lê Minh Tường v cs (2018) vững v khắc phục những như c i m c a thuốc phân l p ư c ba ch ng x khuẩn l LM6, LM h a học, nhi u bi n ph p quản lý dịch h i bằng v LV c khả năng ối kh ng với nấm F. solani bi n ph p sinh học ư c s dụng như k ch th ch gây b nh v ng l thối rễ trên cây c m i Bên t nh kh ng b nh, s dụng vi sinh v t ối kh ng c nh , 3 ch ng x khuẩn n y c ng c khả Hi n nay, vai tr c a x khuẩn trong vi c ph ng năng tiết ra enzyme chitinase v β-glucanase trị b nh cây tr ng ng y c ng ư c quan tâm cao, m t ặc t nh quan trọng trong cơ chế ấu nghiên cứu v ứng dụng nhi u bởi vì những ặc tranh sinh học ph ng tr nấm b nh c a x khuẩn i m tốt ối kh ng với m m b nh thông qua g p ph n tăng hi u quả ối kh ng c a x khuẩn nhi u cơ chế như khả năng tiết enzyme ngo i ối với b nh Tuy nhiên chưa c ịnh danh ến b o, tiết kh ng sinh, c nh tranh dinh dưỡng,… lo i c a ba ch ng x khuẩn n y Do , mục tiêu v cả k ch th ch sinh trưởng cho cây tr ng 38
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 c a nghiên cứu n y ịnh danh ến lo i x khuẩn phân giải protein ở thời i m , , 6 v 8 ng y d a v o ặc i m hình th i, ặc t nh h a sinh v sau th nghi m trình t gene vùng 6S-rRNA. Khả năng tiết enzym lipase của các chủng xạ khuẩn 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Th nghi m ư c th c hi n theo phương ph p 2.1 Vật liệu c a Ertuğrul et al., (2007). C c ch ng x khuẩn ư c nhân nuôi trên môi trường MS trong ng y Ba mẫu x khuẩn LM6, LM v LV dùng nhân m t số X khuẩn ư c cấy th nh 3 i m, trong nghiên cứu ư c cung cấp bởi B môn mỗi i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh Bảo v th c v t, Trường Đ i học C n Thơ Ba mm c tẩm huy n phù x khuẩn trên ĩa petri c mẫu x khuẩn n y ư c thu th p v phân l p t chứa môi trường Tween 8 agar Sau , tiến h nh vườn tr ng cây c m i ở t i huy n Long Mỹ, t nh o b n k nh v ng phân giải lipid ở thời i m 3, v H u Giang LM6 v LM v huy n Lai Vung, ng y sau th nghi m t nh Đ ng Th p LV Khả năng tiết enzym amylase của các 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu chủng xạ khuẩn Th nghi m ư c th c hi n theo phương 2.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ph p c a Santos X khuẩn ư c nhân Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ nuôi trên môi trường MS trong ng y nhân sợi cơ chất và sắc tố tan m t số X khuẩn ư c cấy th nh 3 i m, mỗi Th nghi m ư c tiến h nh theo phương i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh ph p c a Shirling and Gottlieb (1966). C c ch ng mm c tẩm huy n phù x khuẩn trên ĩa petri x khuẩn ư c nuôi cấy trên môi trường ISP c chứa môi trường tinh b t Sau , tiến h nh International Streptomyces Project ở i u ki n o b n k nh v ng phân giải tinh b t ở thời i m nhi t ph ng Ch tiêu ghi nh n l quan s t , , 6, 8 ng y sau th nghi m m u sắc h s i cơ chất, h s i kh sinh v sắc tố Sự hình thành sắc tố melanin của các tan tiết ra ngo i môi trường nuôi cấy ở thời i m chủng xạ khuẩn có triển vọng , v ng y sau th nghi m Ghi nh n c c Th nghi m ư c th c hi n theo phương ph p m u v ng nâu, v ng nâu nh ỏ hoặc da cam, c a Shirling and Gottlieb (1966 X khuẩn ư c v ng nâu nh xanh da trời hoặc t m, v ng nâu nuôi cấy trên môi trường ISP6 ở nhi t ph ng lẫn xanh l cây Shirling v Gottlieb, 66 . Sau , quan s t m u c a môi trường ở thời i m Quan sát cuống sinh bào tử và hình dạng , ng y sau th nghi m Nếu sinh sắc tố melanin, bề mặt bào tử thì m u c a môi trường nuôi cấy sẽ chuy n t Th nghi m ư c tiến h nh theo phương ph p m u v ng sang m u nâu cho ến m u en c a Tresner et al 6 C c ch ng x khuẩn ư c 2.2.3 Định danh đến loài các chủng xạ khuẩn nuôi cấy trên môi trường MS trong ng y nhân bằng phương pháp sinh học phân t m t số Chuỗi b o t ư c quan s t dưới k nh hi n T ch chiết DNA c a 3 ch ng x khuẩn ư c vi quang học x c ịnh d ng chuỗi b o t c a x th c hi n theo phương ph p c a Weisburg et al., khuẩn như sau d ng thẳng, d ng hình m c câu v (1991). Cặp m i ư c s dụng khuyếch i o n d ng xoắn ốc Hình d ng b o t ư c quan s t gen 16S-rRNA c a c c ch ng x khuẩn trong nghiên dưới k nh hi n vi i n t x c ịnh c c d ng b o cứu l R ’-TACGGTTACCTTGTTACGACT- t như sau b o t d ng trơn, b o t d ng gai, b o 3’ v ’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ t d ng khối u, b o t d ng c lông… (Weisburg et al., 1991). Th nh ph n phản ứng PCR 2.2.2 Đặc tính sinh hóa hỗn h p phản ứng PCR c th t ch µl với th nh Khả năng tiết enzym protease của các ph n h a chất g m 3,3 µl nước; , µl buffer; chủng xạ khuẩn MgCl2 µl; dNTPS µl; DMNSO , µl; , µl Taq Th nghi m ư c th c hi n theo phương polymerase; , µl m i F; , µl m i Rv ph p c a Mitra and Chakrabartty C c µl DNA c a x khuẩn Phản ứng PCR với chu kì ch ng x khuẩn ư c nhân nuôi trên môi trường nhi t bắt u bằng giai o n biến t nh DNA ở o C MS trong ng y nhân m t số X khuẩn ư c trong ph t, tiếp theo l 3 chu kỳ lặp l i c a giai cấy th nh 3 i m, mỗi i m l m t khoanh giấy o n biến t nh ở o C trong ph t, giai o n bắt cặp thấm c ường k nh mm c tẩm huy n phù o ở 3 C trong 3 giây v giai o n kéo d i ở o C x khuẩn trên ĩa petri c chứa môi trường Skim trong giây Tiếp theo l giai o n kéo d i trong milk agar Sau , tiến h nh o b n k nh v ng ph t ở o C chắc chắn rằng c c s i DNA 39
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 ư c b sung ho n to n bởi dTNPS Sau sản Kết quả v ặc i m nuôi cấy, ặc i m o phẩm PCR sẽ ư c ưa v o bảo quản ở C. Sản hình th i v ặc i m sinh lý c a 3 ch ng x phẩm PCR ư c i n di trên agarose gel , % Tinh khuẩn th nghi m ư c trình b y ở bảng 1, s ch sản phẩm PCR bằng b QIA quick PCR hình v hình Purification Kit c a QIAGEN Mẫu phân t ch ư c Ch ng x khuẩn LM6 c chuỗi b o t d ng giải trình t t i ph ng th nghi m B nh cây, Khoa thẳng R , cuống sinh b o t d ng thẳng RF v Nông nghi p, trường Đ i học Nông nghi p v Công b mặt b o t c d ng trơn Ch ng LM6 c hình ngh Tokyo, Nh t Bản (Giải trình t trên h thống th nh sắc tố tan trên c c môi trường nuôi cấy v m y ABI 3 3 XL Phân t ch kết quả bằng ph n c khả năng sinh melanin Bên c nh d av o m m sequecing analysis 6 v so s nh với kết quả c c ặc i m chung c a x khuẩn ư c trên ngân h ng gen x c ịnh tên c a x khuẩn nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn v x c ịnh ư c ch ng x 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN khuẩn LM6 thu c Gram dương v c khả năng 3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm tiết c c enzyme ngo i b o như protease, hình thái và đặc điểm sinh hóa amylase v lipase Bảng 2). Bảng 1. Đặc điểm về hình thái và đặc điểm sinh lý - sinh hóa của ba chủng xạ khuẩn thí nghiệm Ch ng x khuẩn th nghi m Đặc i m LM6 LM25 LV74 Chu i b o t Thẳng R Thẳng R G n s ng F Cuống sinh b o t Thẳng RF Thẳng RF Mốc câu RA B mặt b o t Trơn Trơn Trơn M u sắc Đỏ V ng nh t Trắng Sắc tố tan C Không Không Sắc tố melanin C C Không Tiết enzym Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Gram dương dương dương Ch ng LM c chuỗi b o t d ng thẳng R , (F), cuống sinh b o t d ng mốc câu RA v c b cuống sinh b o t thu c d ng thẳng RF , b mặt mặt b o t trơn. Ch ng LV không hình th nh b o t trơn Ch ng LM c hình th nh sắc tố sắc tố tan trên c c môi trường nuôi cấy v không tan trên c c môi trường nuôi cấy v c khả năng c khả năng sinh melanin Bên c nh d av o sinh melanin Bên c nh d a v o c c ặc i m c c ặc i m chung c a x khuẩn ư c chung c a x khuẩn ư c nghiên cứu trước nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn nh n d ng x khuẩn v x c ịnh ư c ch ng x v x c ịnh ư c ch ng x khuẩn LM25 thu c khuẩn LM25 thu c Gram dương v c khả năng Gram dương v c khả năng tiết c c enzyme tiết c c enzyme ngo i b o như protease, ngo i b o như protease, amylase v lipase amylase v lipase Bảng 2). Ch ng x khuẩn LV c chuỗi b o t d ng g n s ng A B C Chuỗi bào tử Chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử Hình 1. Hình dạng chuỗi bào tử dạng thẳng A ; chuỗi b o t d ng g n s ng B ; cuống sinh b o t d ng mốc câu B v b mặt b o t trơn C 40
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 3.2 Định danh các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Ba ch ng x khuẩn ư c ly tr ch DNA v th c hi n phản ứng PCR với cặp m i chung Fv 1492R (Weisburg et al., 1991). Hình 2 Khả năng tạo sắc tố melanin (A) v không t o sắc tố melanin B trên môi trường nuôi cấy ISP6 c a x khuẩn ở NSKC Bảng 2. Khả năng tiết enzyme amylase, lipase và protease của các chủng xạ khuẩn B n k nh v ng phân giải cơ chất Nghi m mm c a 3 ch ng x khuẩn ở thức ng y sau khi th nghi m Hình 3. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại amylase protease lipase với cặp mồi thuộc vùng 16S-rRNA LV74 8,4a 15,6a 15,4a của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu LM6 3,2 c 14,4 b 15,4a LM25 6,6 b 10,4 c 6,6 b Sản phẩm PCR thu ư c c k ch thước Mức ý khoảng bp Hình 3 , phù h p với trọng * * * nghĩa lư ng phân t c c ch ng x khuẩn thu c lo i CV (%) 20,85 4,07 21,42 Streptomyces. Ghi chú: Các trung bình trong cùng một cột D a v o kết quả bảng 3 cho thấy c c ch ng được theo sau bởi một hay những chữ cái giống x khuẩn th nghi m c mức tương ng t nhau thì khác biệt không có ý ngh a thống kê 99 – % khi so s nh với lo i chuẩn d a v o trong phép th Duncan. (*) khác biệt ở mức ý trình t gen vùng 6S rRNA Cụ th l ch ng ngh a 5 . LM6 c mức tương ng với lo i Streptomyces capoamus l %; ch ng LM c mức tương Sau khi tiến h nh so s nh c c ặc i m nuôi ng với lo i Streptomyces bacillaris l %v cấy, ặc i m hình th i, sinh lý với kh a phân lo i x khuẩn c a International Streptomyce ch ng LV c mức tương ng với lo i lo i Project Shirling v Gottlieb, ; Pridham et al., Streptomyces lavendulae l % ; Waksman, 6 ta c th xếp 3 ch ng Theo kết quả nghiên cứu c a Lê Minh Tường x khuẩn LM6, LM v LV v o chi v ctv , (2015) x c ịnh ư c ch ng x Streptomyces. Trong , ch ng LM6 c th l khuẩn c tên khoa học l Streptomyces bacillaris lo i Streptomyces capoamus, ch ng LM c th v Streptomyces capoamus l ch ng x khuẩn l lo i Streptomyces bacillaris v ch ng LV c c khả năng ph ng trị b nh ch y bìa l l a ở th l lo i Streptomyces lavendulae. ng bằng sông C u Long Theo kết quả nghiên Đ c th x c ịnh ch nh x c ến tên lo i c a cứu c a Dương Thị Ngọc cho thấy ch ng c c ch ng x khuẩn trên c n phải kết h p c c x khuẩn c khả năng ph ng trị b nh o ôn h i ặc i m phân lo i theo phương ph p truy n l a ở ng bằng sông C u Long c tên khoa học thống với vi c x c ịnh bằng phương ph p sinh l Streptomyces lavendulae. học phân t 41
Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Bảng 3. Kết quả xác định ba mẫu xạ khuẩn dựa trên trình tự vùng 16S-rDNA M số c a ch ng Mẫu x k ch thước trình Mức tương Lo i x c ịnh tương ng trên khuẩn t (bp) ng % GenBank LM6 Streptomyces capoamus 1484 99 NR_040856.1 LM25 Streptomyces bacillaris 1468 100 NR_041146.1 LV74 Streptomyces lavendulae 1515 99 DQ645958.1 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ R. G. (1970). A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups. - Ba ch ng x khuẩn nghiên cứu thu c lo i Placement of strains in morphological sections. App. Streptomyces capoamus, lo i Streptomyces Microbiol. 6: 52 bacillaris, v lo i Streptomyces lavendulae. 7. Santos, É R D , Z N S Teles, N M Campos, - Đ nghị nh gi khả năng ph ng trị b nh D.A.J.D. Souza, A.S.D.R. Bispo and R.P.D. v ng l thối rễ cây c m i c a 3 ch ng x khuẩn Nascimento, Production of α-amylase from trên ở i u ki n ngo i ng Streptomyces sp. SLBA-08 strain using agro-industrial by-products. Brazilian Archives of Biology and TÀI LIỆU THAM KHẢO Technology, 55(5): 793-800 8. Shirling, E.T. and D. Gottlieb (1966). Methods 1. Dương Thị Ngọc, 2014 Định danh c c ch ng for characterization of Streptomyces species. x khuẩn c tri n vọng trong quản lý m t số b nh h i International journal of systematic bacteriology, 16(3): l a Lu n văn tốt nghi p th c sĩ ng nh Bảo v Th c 313-340 v t. Trường Đại học Cần hơ. 9. Shirling, E.T. and Gottlieb, D., 1972. 2. Ertuğrul, S , G Dönmez and S Takaç Cooperative description of type strains of Isolation of lipase producing Bacillus sp. from olive mill Streptomyces V. Additional descriptions. International wastewater and improving its enzyme activity. Journal Journal of Systematic Bacteriology, 22(4): 265-394 of Hazardous Materials, 149(3): 720-724 10. Waksman, S.A, 1961. The Actinomycetes: 3. Lê Minh Tường, Lý Văn Giang, Ph m Tuấn Classification, identification and descriptions of V 2015 Định danh x khuẩn c tri n vọng trong genera and species. The Williams & Wilkins Co., ph ng trị b nh ch y bìa l h i l a T p ch Khoa học Baltimore, 2, USA Trường Đ i học C n Thơ 1. Tr 46-52 11. Watve, M.G., R. Tickoo, M.M. Jog and B.D. 4. Lê Minh Tường, Nguyễn Ngọc Sơn, Lê Thị Bhole, 2001. How many antibiotics are produced by Ngọc Xuân v Nguyễn Trường Sơn 8 Khả năng the genus Streptomyces?. Archives of ối kh ng c a c c ch ng x khuẩn ối với nấm microbiology, 176(5): 386-390 Fusarium solani gây b nh v ng l thối rễ trên cây c 12. Weisburg, W.G., S.M. Barns, D.A. Pelletier, m i T p ch Bảo v th c v t, 3 tr 6-32. and D.J. Lane, 1991. 16S ribosomal DNA 5. Mitra, P., and P. Chakrabartty (2005). An amplification for phylogenetic study. Journal of extracellular protease with depilation activity from bacteriology,173(2),697-703 Streptomyces nogalator. Journal of Scientific and Industrial Research, 64(12): 978 Phản biện: TS. Nguyễn Đức Huy 6. Pridham, T. G., Hesseltin, C. W., and Benedict, 42

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.