Định lượng đồng thời dexamethason acetat betamethason và prednisolon bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra một số chế phẩm đông dược

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI DEXAMETHASON ACETAT<br /> BETAMETHASON VÀ PREDNISOLON BẰNG SẮC KÝ LỎNG<br /> HIỆU NĂNG CAO ĐỂ KIỂM TRA MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC<br /> Đào Văn Đôn*; Nguyễn Hồng Hải**<br /> Nguyễn Thị Thủy*; Nguyễn Thị Thanh Phương**<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời đồng thời dexamethasone acetate (DA),<br /> betamethasone (BE) và prednisolone (PR) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).<br /> Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha động ACN:H 2O<br /> (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl. Quy trình định lượng này đã được<br /> thẩm định đầy đủ. Trong khoảng 5 - 200 g/ml, diện tích peak và nồng độ có tương quan tuyến tính với<br /> hệ số tương quan ~ 1. Giới hạn định lượng của 3 chất DA, BE và PR lần lượt là 1,0 g/ml, 0,5 g/ml<br /> và 0,5 g/ml. Độ chính xác < 2%. Độ đúng 92 - 100%. Quy trình này hoàn toàn có thể ứng dụng để<br /> kiểm tra DA, BE và PR trong các chế phẩm đông dược trên thị trường.<br /> * Từ khóa: Glucocorticoid; Dexamethason acetat; Betamethason; Prednisolon; S¾c ký láng hiÖu<br /> n¨ng cao; Thuốc đông dược.<br /> <br /> SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DEXAMETHASONE<br /> ACETATE, BETAMETHASONE AND PREDNISOLONE IN<br /> HERBAL MEDICINES BY HPLC<br /> Summary<br /> A HPLC method for the simultaneous determination of 3 glucocorticoids (dexamethasone acetate,<br /> betamethasone and prednisolone) in herbal medicines was validated. Using acetonitrile and water as<br /> the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 240 nm and flow at<br /> 1.5 ml/min, the glucocorticoids were separated satisfactorily within 12 minutes. The quantitation limits<br /> of dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone were about 1.0 g/ml, 0.5 g/ml and<br /> 0.5 g/ml, respectively. The calibration curve of each glucocorticoid had a correlation coefficient<br /> close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 92 - 100% for<br /> all glucocorticoids. This method can be used to detemine dexamethasone acetate, betamethasone<br /> and prednisolone simultaneously in herbal medicines.<br /> * Key words: Glucocorticoid; Dexamethasone acetate; Betamethasone; Prednisolone; HPLC;<br /> Herbal medicines.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> * Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm<br /> PGS. TS. Nguyễn Văn Minh<br /> <br /> 18<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Thuốc đông dược được cho là những<br /> thuốc tương đối an toàn, ít tác dụng phụ<br /> nên được nhiều người tin tưởng sử dụng.<br /> Tuy nhiên, nhược điểm của thuốc là tác<br /> dụng thường chậm. Lợi dụng tâm lý này<br /> của người sử dụng, một số cơ sở sản xuất<br /> thuốc đông dược đã trộn lẫn thuốc tân<br /> dược vào chế phẩm đông dược để tạo ra<br /> được tác dụng nhanh, tuy nhiên người sử<br /> dụng vẫn tin là an toàn do loại tân dược<br /> trộn quan sát khó có thể phát hiện. Trong<br /> các loại tân dược, nhóm thuốc glucocorticoid<br /> (GC) là được sử dụng nhiều hơn cả. Đặc<br /> biệt là hoạt chất dexamethason acetat (DA),<br /> betamethason (BE) và prednisolon (PR)<br /> vì chúng có tác dụng chống viêm mạnh, dễ<br /> kiếm và rẻ tiền. Ở nước ta, đã có một số<br /> nghiên cứu về phát hiện GC trong chế phẩm<br /> đông dược [1, 2]. Nếu áp dụng mỗi quy<br /> trình này để kiểm tra từng GC sẽ gây tốn<br /> kém cả về thời gian và vật chất. Thực tế đòi<br /> hỏi cần có một quy trình phân tích đồng thời<br /> nhiều GC trong chế phẩm đông dược. Vì<br /> vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm<br /> mục tiêu: Định lượng đồng thời dexamethason<br /> acetat, betamethason và prednisolon bằng<br /> HPLC để kiểm tra một số chế phẩm đông<br /> dược.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Địa hoàng 8 g, Đỗ trọng 8 g, Ngưu tất 8 g,<br /> Đương quy 8 g, Phòng phong 8 g, Phục linh<br /> 8 g, Quế nhục 8 g, Cam thảo 8 g, Tế tân 8 g,<br /> Tần giao 8 g, Nhân sâm 8 g.<br /> - Mẫu trắng: 2,0 g mẫu tự tạo ở trên.<br /> - Mẫu thử: 2,0 g mẫu tự tạo được bổ<br /> sung 1 mg từng chất DA, BE và PR.<br /> * Dung môi, hoá chất:<br /> - Chất chuẩn: DA, BE, PR do Viện Kiểm<br /> nghiệm Thuốc TW sản xuất.<br /> - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu<br /> chuẩn HPLC.<br /> - Các hoá chất, dung môi khác: ethanol,<br /> methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether,<br /> H2SO4 đặc... đạt tiêu chuẩn phân tích.<br /> * Thiết bị và dụng cụ phân tích:<br /> Các thiết bị phân tích đều được chuẩn<br /> hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005 bao gồm:<br /> - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC Alliance<br /> Waters 2695D, 4 kênh dung môi, bơm mẫu<br /> tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector<br /> PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm,<br /> 5 µm)... Phần mềm xử lý số liệu Empower® 2.<br /> - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích<br /> Sartorius độ chính xác 0,1 mg, bình chạy<br /> sắc ký lớp mỏng, đèn tử ngoại có bước<br /> sóng 254 nm và 366 nm, bình phun thuốc<br /> thử hiện màu; các dụng cụ thủy tinh, bình<br /> định mức, pipet có độ chính xác phù hợp.<br /> <br /> 1. Nguyên vật liệu nghiên cứu.<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> <br /> * Đèi tượng nghiên cứu:<br /> <br /> * Khảo sát quy trình định lượng:<br /> <br /> - Mẫu tự tạo: chiết và tạo bột cao khô từ<br /> 10 thang thuốc “Độc hoạt ký sinh thang”.<br /> - Thành phần 1 thang thuốc độc hoạt<br /> tang ký sinh: Độc hoạt 12 g, Tang ký sinh<br /> 8 g, Xuyên khung 8 g, Bạch thược 8 g,<br /> <br /> Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [1, 2,<br /> 3, 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu<br /> như sau:<br /> Cân chính xác 2,0 g bột mẫu tự tạo vào<br /> bình nón có nút mài 100 ml và bổ sung<br /> <br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> thêm 1 mg từng chất DA, BE, PR. Thêm 20 ml<br /> ethyl acetat vào bình, đun nóng trên bếp<br /> cách thuỷ trong 10 phút. Lọc nóng qua giấy<br /> lọc, chiết tiếp 2 lần như vậy. Tráng giấy lọc<br /> bằng ethyl acetat nóng. Gộp các dịch chiết<br /> ethyl acetat và bốc hơi trên cách thuỷ tới<br /> cắn. Cắn được hoà tan trong 5 ml MeOH,<br /> lắc siêu âm trong 10 phút. Lọc qua giấy lọc<br /> và chuyển vào bình định mức 10 ml. Tráng<br /> bình và rửa cắn trên giấy lọc bằng 3 ml<br /> MeOH, thêm MeOH đến vạch, lắc đều. Dịch<br /> chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước<br /> khi phân tích bằng HPLC.<br /> <br /> * Điều kiện sắc ký [1, 2, 3, 4]:<br /> Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),<br /> detector PDA quét phổ 200 - 400 nm, tốc độ<br /> dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl.<br /> Tiến hành khảo sát pha động ACN: H2O với<br /> các tỷ lệ 30/70, 45/55 và 60/40 (v/v).<br /> * Thẩm định quy trình định lượng:<br /> Thẩm định quy trình định lượng theo<br /> ICH, gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của<br /> hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu,<br /> khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát<br /> hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác,<br /> độ đúng.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Khảo sát quy trình định lƣợng.<br /> Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình ®ịnh lượng<br /> ghi sắc ký đồ. Phân tích kết quả, đã lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC để định lượng<br /> đồng thời 3 chất DA, BE, PR như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector<br /> PDA; pha động ACN:H2O (45:55, v/v); tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl.<br /> 2. Thẩm định quy trình định lƣợng.<br /> * Tính tương thích hệ thống sắc ký:<br /> Tiêm sắc ký 5 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất DA, BE, PR có nồng độ mỗi<br /> chất là 20 µg/ml. Chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn.<br /> Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br /> DA<br /> STT<br /> <br /> BE<br /> <br /> PR<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Speak (μV.s)<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Speak (μV.s)<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Speak (μV.s)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 9,656<br /> <br /> 342818<br /> <br /> 4,556<br /> <br /> 388354<br /> <br /> 3,475<br /> <br /> 404278<br /> <br /> 2<br /> <br /> 9,677<br /> <br /> 343544<br /> <br /> 4,549<br /> <br /> 382184<br /> <br /> 3,454<br /> <br /> 399624<br /> <br /> 3<br /> <br /> 9,673<br /> <br /> 340630<br /> <br /> 4,551<br /> <br /> 385761<br /> <br /> 3,483<br /> <br /> 396339<br /> <br /> 4<br /> <br /> 9,664<br /> <br /> 351654<br /> <br /> 4,544<br /> <br /> 389145<br /> <br /> 3,489<br /> <br /> 401248<br /> <br /> 5<br /> <br /> 9,697<br /> <br /> 348503<br /> <br /> 4,539<br /> <br /> 394348<br /> <br /> 3,467<br /> <br /> 406105<br /> <br /> X<br /> <br /> 9,673<br /> <br /> 345430,2<br /> <br /> 4,548<br /> <br /> 387958,4<br /> <br /> 3,474<br /> <br /> 401518,8<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,16<br /> <br /> 1,31<br /> <br /> 0,14<br /> <br /> 1,16<br /> <br /> 0,40<br /> <br /> 0,97<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích peak cả 3 chất đều < 2%. Điều này<br /> chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu với kết<br /> quả tin cậy.<br /> <br /> 22<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> * Độ chọn lọc - đặc hiệu:<br /> Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của DA, BE, PR có nồng độ 5 µg/ml, mẫu trắng<br /> và mẫu thử.<br /> a<br /> <br /> PR<br /> <br /> BE<br /> DA<br /> <br /> b<br /> <br /> a<br /> <br /> BE<br /> <br /> PR<br /> <br /> DA<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của DA, BE, PR trong mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng.<br /> a. Mẫu chuẩn hỗn hợp DA, BE, PR pha trong MeOH.<br /> b. Mẫu trắng không có chất phân tích.<br /> c. Mẫu thử có chất phân tích.<br /> Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của DA, BE và PR không<br /> xuất hiện các peak như ở mẫu chuẩn. Các peak của chất phân tích trong mẫu thử cân đối và<br /> tách hoàn toàn khỏi peak tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao.<br /> * Khoảng nồng độ tuyến tính:<br /> Pha một dãy dung dịch chuẩn DA, BE, PR nồng độ khoảng 5 - 200 µg/ml và chạy sắc ký.<br /> Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của DA, BE và PR.<br /> C (µg/ml)<br /> <br /> 5<br /> <br /> 20<br /> <br /> 50<br /> <br /> 100<br /> <br /> 150<br /> <br /> 200<br /> <br /> Speak (DA) (μV.s)<br /> <br /> 81369<br /> <br /> 342818<br /> <br /> 747125<br /> <br /> 1616455<br /> <br /> 2540421<br /> <br /> 3436877<br /> <br /> Speak (BE) (μV.s)<br /> <br /> 90786<br /> <br /> 388354<br /> <br /> 824518<br /> <br /> 1790089<br /> <br /> 2824083<br /> <br /> 3813497<br /> <br /> Speak (PR) (μV.s)<br /> <br /> 90296<br /> <br /> 404278<br /> <br /> 842144<br /> <br /> 1838438<br /> <br /> 2891513<br /> <br /> 3908626<br /> <br /> 2<br /> <br /> y(DA) = 16481x - 830; R = 0,9985<br /> Phương trình hồi quy tuyến tính<br /> <br /> 2<br /> <br /> y(BE) = 18325x - 293; R = 0,9983<br /> 2<br /> <br /> y(PR) = 17255x + 917; R = 0,9978<br /> <br /> 22<br /> <br /> TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013<br /> <br /> Hình 2: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của DA, BE và PR.<br /> Diện tích peak và nồng độ DA, BE, PR trong khoảng khảo sát cã tương quan chặt chẽ<br /> víi R2 ≈ 1.<br /> * Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:<br /> Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn, ngoại suy giới hạn phát<br /> hiện của DA, BE và PR lần lượt bằng 0,3 µg/ml; 0,2 µg/ml và 0,2 µg/ml. Giới hạn định<br /> lượng dưới của 3 chất DA, BE và PR lần lượt là 1,0 µg/ml; 0,5 µg/ml và 0,5 µg/ml.<br /> * Độ chính xác:<br /> Pha các mẫu LQC (10 µg/ml), MQC (80 µg/ml) và HQC (160 µg/ml). Mỗi nồng độ pha 5<br /> mẫu độc lập. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC.<br /> D iÖ n<br /> STT<br /> <br /> (µV*s)<br /> <br /> e a ëk<br /> <br /> DA<br /> <br /> BE<br /> <br /> PR<br /> <br /> LQC<br /> <br /> MQC<br /> <br /> HQC<br /> <br /> LQC<br /> <br /> MQC<br /> <br /> HQC<br /> <br /> LQC<br /> <br /> MQC<br /> <br /> HQC<br /> <br /> 1<br /> <br /> 161547<br /> <br /> 1317459<br /> <br /> 2668028<br /> <br /> 173099<br /> <br /> 1425516<br /> <br /> 3023572<br /> <br /> 167169<br /> <br /> 1365628 2736538<br /> <br /> 2<br /> <br /> 156487<br /> <br /> 1352527<br /> <br /> 2689305<br /> <br /> 177673<br /> <br /> 1467955<br /> <br /> 2991015<br /> <br /> 165014<br /> <br /> 1323995 2782875<br /> <br /> 3<br /> <br /> 163165<br /> <br /> 1367089<br /> <br /> 2605408<br /> <br /> 179561<br /> <br /> 1476597<br /> <br /> 2977847<br /> <br /> 166869<br /> <br /> 1302562 2828710<br /> <br /> 4<br /> <br /> 158745<br /> <br /> 1305185<br /> <br /> 2621529<br /> <br /> 181071<br /> <br /> 1463504<br /> <br /> 2961584<br /> <br /> 171122<br /> <br /> 1322851 2763549<br /> <br /> 5<br /> <br /> 161808<br /> <br /> 1339778<br /> <br /> 2649713<br /> <br /> 177628<br /> <br /> 1435685<br /> <br /> 3056980<br /> <br /> 162608<br /> <br /> 1352944 2743346<br /> <br /> X<br /> <br /> 160350<br /> <br /> 1336408<br /> <br /> 2646797<br /> <br /> 177806<br /> <br /> 1453851<br /> <br /> 3002200<br /> <br /> 166556<br /> <br /> 1333596 2771004<br /> <br /> SD<br /> <br /> 2691,7<br /> <br /> 25231,1<br /> <br /> 33976,7<br /> <br /> 2997,7<br /> <br /> 22036,1<br /> <br /> 38162,3<br /> <br /> 3133,9<br /> <br /> 25353,2<br /> <br /> 37011,3<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,68<br /> <br /> 1,89<br /> <br /> 1,28<br /> <br /> 1,68<br /> <br /> 1,52<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> 1,88<br /> <br /> 1,90<br /> <br /> 1,34<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối đều, < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt, đáp ứng<br /> yêu cầu phân tích.<br /> <br /> 23<br /> <br />