Định týp (Genotyping) virus viêm gan vịt type 3 phân lập tại Việt Nam từ 2009-2013

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 274­278<br />  DOI: 10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ĐỊNH TÝP (GENOTYPING) VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE 3 <br /> PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM TỪ 2009­2013<br /> <br /> Đỗ Thị Roan, Đoàn Thị Thanh Hương*, Lê Thị Kim Xuyến, <br /> Nguyễn Thị Khuê, Vũ Thị Tiến, Lê Thanh Hòa<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *doantthuong74@gmail.com <br /> <br /> TÓM TẮT: Gen VP1 của 10 mẫu bệnh phẩm virus viêm gan vịt phân lập từ  6 tỉnh của Việt  <br /> Nam trong thời gian 2009­2013 đã được thu nhận và giải mã. Phân tích tỷ  lệ  đồng nhất (91­<br /> 100%) về  nucleotide và amino acid cho thấy tất cả  các chủng phân lập đều thuộc genotype 3  <br /> (DHAV­3). virus DHAV­3 của Việt Nam có một vùng “siêu biến đổi” ở đầu tận cùng C của gen <br /> VP1, trong đó 6/10 số chủng có 4 vị trí sai khác đồng nhất và hoàn toàn khác biệt với tất cả các <br /> chủng DHAV­3 của thế giới (bao gồm các vị trí T184M, Q200H, K207N, K214R). Phân tích phả <br /> hệ cho thấy các chủng DHAV­3 trên thế giới gồm 3 clade chính, trong đó 4/10 chủng DHAV­3  <br /> của Việt Nam thuộc về một clade cùng với các chủng của Trung Quốc, 6 chủng còn lại thuộc  <br /> về  một clade riêng biệt và có mối quan hệ  gần gũi nhất với chủng B63 của Trung Quốc. Bốn <br /> chủng của Hàn Quốc thuộc về một clade riêng. <br /> Từ khóa: DHAV­3, genotyping, viêm gan vịt, vùng siêu biến đổi, VP1, Việt Nam.<br /> <br /> MỞ ĐẦU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Viêm gan vịt (DHAV)  là một bệnh truyền  Mẫu bệnh phẩm và tách chiết RNA tổng <br /> nhiễm cấp tính xảy ra  ở vịt con 1­6 tuần tuổi,   số<br /> và đặc biệt mẫn cảm với vịt con dưới 1 tuần   Bệnh phẩm  viêm  gan vịt   được  thu  nhận <br /> tuổi.   Bệnh   lây   lan   nhanh   với   tỷ   lệ   chết   rất  tại   6   tỉnh   thành:   Thành   phố   Hồ   Chí   Minh, <br /> cao, có khi lên đến 95­100% toàn đàn  [7]. Cho  Hưng Yên, Đồng Nai, Ninh Thuận, Long An  <br /> đến  nay,   bệnh  vẫn  tồn  tại  và   gây  thiệt   hại  và Khánh Hòa. Các mẫu bệnh phẩm được tiếp <br /> nặng nề  về  kinh tế  cho nhiều nước trên thế  truyền   qua   phôi   trứng   vịt   11   ngày   tuổi,   thu <br /> giới, trong đó có Việt Nam [1, 4].  nước trứng hoặc phôi chết sau 48 giờ, 72 giờ.  <br /> Virus   viêm   gan   vịt   (DHAV)  gồm   3  RNA  tổng số   được  tách  chiết  bằng  bộ   sinh <br /> genotype là DHAV­1, DHAV­2 và DHAV­3 [6,  phẩm RNeasy Mini Kit (Qiagen) theo hướng  <br /> 3, 1, 4], trong đó, DHAV­1 là phổ  biến nhất.  dẫn của nhà sản xuất và bảo quản  ở  ­20 oC <br /> DHAV­2 chỉ  mới phát hiện  được hai chủng  cho đến khi sử  dụng. DNA bổ  sung (cDNA)  <br /> phân   lập   tại   Đài   Loan   [5].   DHAV­3   gồm  được tổng hợp theo phương pháp chuyển đổi <br /> khoảng 20 chủng mới được phân lập  ở  Hàn  từ  RNA hệ  gen của virus bằng mồi xác suất <br /> Quốc,   Trung   Quốc   và   một   số   chủng   vừa   (hexamer   primers),   sử   dụng   bộ   kit   của   hãng <br /> được chúng tôi phân lập tại Việt Nam   [3,  6,  Fermentas.<br /> 2].  Thu   nhận  gen  VP1  và   phân   tích  xử   lý   số <br /> Từ  trước tới nay, virus viêm gan vịt thuộc   liệu<br /> genotype 1 (DHAV­1) được ghi nhận là phổ <br /> Cặp mồi gen VP1 của DHAV­3  [2] được <br /> biến tại Việt Nam, gồm cả  các chủng cường <br /> sử dụng cho phản ứng PCR, thực hiện với chu  <br /> độc và một số  chủng virus vaccine hiện đang <br /> trình   nhiệt:   94oC/5  phút,   35  chu   kỳ   [94oC/60 <br /> sử dụng [4]). Trong bài báo này, chúng tôi công <br /> giây,   50oC/60   giây,   72oC/90   giây]   và   chu   kỳ <br /> bố   định   týp   genotype   3   (DHAV­3)   tại   Việt  <br /> cuối   cùng   ở   72oC/10   phút.   Sản   phẩm   PCR <br /> Nam và phân tích một số đặc tính phân tử của  <br /> được   tinh   sạch   bằng   bộ   kit   Accuprep   Gel  <br /> chúng qua so sánh với các chủng của thế giới. <br /> <br /> 18<br /> Purification   Kit   (Bioneer,   Hàn   Quốc)   và   giải  Bằng   cặp   mồi   đặc   hiệu   đã   trình   bày   ở <br /> trình tự trực tiếp. Các chuỗi gen VP1 được thu  trên, chúng tôi đã thu nhận được 10 phản  ứng  <br /> nhận, so sánh trình tự nucleotide và amino acid  PCR dương tính (bao gồm các mẫu BM, HY, <br /> với các chủng của thế  giới, sử  dụng chương   DN1,   DN2,   NC,   LA1,   KHO1,   KHO2,   NT, <br /> trình   GENEDOC2.7;   phân   tích   phả   hệ   bằng  NT2).   Các   sản   phẩm   PCR   dương   tính   trên <br /> chương   trình   MEGA6.06   với   hệ   số   tin   cậy  được tinh sạch và giải trình trình tự  trực tiếp. <br /> 1000 bootstrap. Kết   quả   giải   trình   tự   và   xử   lý   chuỗi   gen, <br /> chúng tôi đã thu được toàn bộ  gen VP1 có độ <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  dài   720   nucleotide,  <br /> Kết quả  thu nhận gen VP1 của các chủng   mã hóa cho 240 amino acid. Các trình tự  gen <br /> DHAV­3 Việt Nam VP1 được đăng ký trên Ngân hàng gen với mã <br /> số   JF925119­JF925121,   KM361877­<br /> KM361883 (bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách gen VP1 c ủa virus viêm gan vịt DHAV­3 phân lập tại Việt Nam s ử d ụng  <br /> trong nghiên cứu<br /> Chủng  Năm  Vật chủ/  Độ dài <br /> STT Nơi phân lập Số đăng ký NHG<br /> virus  phân lập bệnh phẩm (bp)<br /> 1 DN1 Đồng Nai 2009 Vịt/ Gan 720 JF925120<br /> 2 DN2 Đồng Nai 2009 Vịt/ Gan 720 KM361877<br /> 3 LA1 Long An 2011 Vịt/ Gan 720 KM361881<br /> 4 NC TP. Hồ Chí Minh 2009 Vịt/ Gan 720 JF925121<br /> 5 BM Hưng Yên 2009 Vịt/ Gan 720 JF925119<br /> 6 KHO1 Khánh Hòa 2012 Vịt/ Gan 720 KM361879<br /> 7 KHO2 Khánh Hòa 2012 Vịt/ Gan 720 KM361880<br /> 8 HY Hưng Yên 2010 Vịt/ Gan 720 KM361878<br /> 9 NT2 Ninh Thuận 2013 Vịt/ Gan 720 KM361882<br /> 10 NT Ninh Thuận 2013 Vịt/ Gan 720 KM361883<br /> <br /> * 200 * 220 * 240<br /> C-HRY-CN(F : TTHTLLNKIETMNLHDQSDQPDCHLCKICRKMKKWSRNHRPFRFCLRLKTLAFELHLEIE : 240<br /> CLX-CN(FJ6 : ...............N.............K.............................. : 240<br /> C-NXC-CN(F : ...............N............................................ : 240<br /> C-PJK-CN(K : ...........I..............E..S.............................. : 240<br /> C-PSY-CN(F : ............................................................ : 240<br /> YT-63-CN(K : ...............N..........E................................. : 240<br /> YT-BX-CN(K : ........................VSET.......F........................ : 240<br /> B-N-CN(JX2 : ...............N........V.E........F........................ : 240<br /> B63-CN(EU7 : ..P....EL.................E......G..C.Y..................... : 240<br /> AP03337-KR : .AP.RS.GL.I....E......................L..................... : 240<br /> AP04009-KR : .AP.RS.G..I....E......................L..................... : 240<br /> AP04203-KR : ..P.RS.GL.I....E......................L..................... : 240<br /> AP04114-KR : .AP.RS.AL.I....E......................L..................... : 240<br /> BM-VN(JF92 : ............................................................ : 240<br /> HY-VN(KM36 : ............................................................ : 240<br /> NT-VN(KM36 : .......R................V.E........F........................ : 240<br /> NT2-VN(KM3 : .......R................V.E........F........................ : 240<br /> DN1-VN(JF9 : ..PMRS.EL..........H......N......R....Y..................... : 240<br /> DN2-VN(JF9 : ..PMRS.EL..........H......N......R....Y..................... : 240<br /> KHO1-VN(KM : ..PMRS.EL..........H......N......R....Y..................... : 240<br /> KHO2-VN(KM : ..PMRS.EL..........H......N......R....Y..................... : 240<br /> LA1-VN(KM3 : ..PMRS.EL..........H......N......R..C.Y..................... : 240<br /> NC-VN(JF92 : ..PMRS.EL..........H......N......R....Y..................... : 240<br /> * * * *<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 19<br /> Hình 1. Kết quả so sánh tương đồng về  amino acid  ở đầu tận cùng C của protein VP1 giữa các  <br /> chủng thuộc DHAV­3. Mười chủng của Việt Nam được xếp ở hàng cuối cùng và bôi đậm. Các  <br /> vị trí sai khác đặc biệt được đánh dấu trong khung.<br /> <br /> Phân   tích   mức   độ   tương   đồng   về   amino  chủng   B63   của  Trung   Quốc   (95­96%).  <br /> acid giữa các chủng thuộc DHAV­3<br /> Các   chủng   virus   viêm   gan   vịt   của   Việt   Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, có một <br /> Nam   có   mức   độ   tương   đồng   91­100%   về  vùng siêu biến đổi  ở  đầu tận cùng C giữa các <br /> amino acid với 26 chủng DHAV­3 đã công bố  chủng DHAV­3, trong số đó, 6 chủng DHAV­3 <br /> trên Ngân hàng gen quốc tế, trong đó, 4 chủng   của   Việt   Nam   DN1,   DN2,   NC,   LA1,   KHO1,  <br /> BM, HY, NT và NT2 có mức độ  tương đồng  KHO2  có  4  vị   trí  sai   khác  so với   tất  cả   các  <br /> cao với các chủng của Trung Quốc; 6 chủng   chủng DHAV­3 đã công bố  trên thế  giới (bao <br /> còn lại (DN1, DN2, NC, LA1, KHO1, KHO2)   gồm các vị trí: T184M, Q200H, K207N, K214R) <br /> có tỷ  tương đồng rất cao (98­100%) và gần  (hình  1).   Đồng  thời,   4  chủng   của   Hàn   Quốc <br /> gũi nhất với cũng sở hữu 4 trình tự hoàn toàn khác biệt với <br /> các chủng còn lại của Việt Nam và Trung Quốc <br /> (hình 1). Điều này cho thấy, đặc điểm di truyền <br /> gen   VP1   của   quần   thể   virus   viêm   gan   vịt <br /> genotype 3 có khác nhau theo phân bố vị trí địa <br /> lý.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 20<br />  98 CLX-CN(FJ626667)<br /> 54 CYCW-CN(GU066824)<br /> 86 C-PSY-CN(FJ626670)<br /> <br /> 60<br /> C-HRY-CN(FJ626665)<br /> 81 C-NXC-CN(FJ626669)<br /> CYDF-CN(GU066821)<br /> B-N-CN(JX235698) Clade 1<br /> Clade 1<br /> YT-BX-CN(KC191694)<br /> 42 97<br /> NT2-VN(KM361882)<br /> 97<br /> 97 NT-VN(KM361883)<br /> 77 C-PJK-CN(KC191694)<br /> BM-VN(JF925119) DHAV­3<br /> DHAV­3<br /> 57 HY-VN(KM361878)<br /> YT-63-CN(KC191693)<br /> 99 AP03337-KR(DQ256132)<br /> 87<br /> 89 AP04009-KR(DQ256133)<br /> 99<br /> AP04114-KR(DQ812093) Clade 2<br /> Clade 2<br /> AP04203-KR(DQ256134)<br /> B63-CN(EU747874)<br /> 66<br /> DN2-VN(KM361877)<br /> 99 NC-VN(JF925121) Clade 3<br /> Clade 3<br /> DN1-VN(JF925120)<br /> 100<br /> LA1-VN(KM361881)<br /> <br /> 95<br /> KHO1-VN(KM361879)<br /> 78 KHO2-VN(KM361880)<br /> 04G-TW(EF067923) DHAV­2<br /> DHAV­2<br /> 100 90D-TW(EF069724)<br /> ZI07-CN-(EF502168)<br /> 99 CPHG-CN-(FJ626668)<br /> 100 C-YXQ-CN-(EU687762)<br /> 100 C80-CN-(DQ864514)<br /> 70<br /> C-SN-CN-(EU621878) DHAV­1<br /> DHAV­1<br /> 58 C-NMG-CN-(EU106091)<br /> <br /> 99<br /> X-CN-(FJ496343)<br /> 70 SH-CN-(EF502171)<br /> <br /> <br /> 0.01<br /> <br /> <br /> Hình 2. Mối quan hệ phả hệ của các chủng cường độc DHAV­3 của Việt Nam và thế giới trên  <br /> cơ sở phân tích toàn bộ gen VP1. Biểu tượng (▲) để chỉ các chủng của Việt Nam sử dụng trong  <br /> nghiên cứu<br /> <br /> Phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ lập).   Các   chủng   DHAV­2   chỉ   gồm   2   chủng <br /> Chuỗi gen VP1 của 10 chủng nghiên cứu  duy nhất được sử dụng trong nghiên cứu. <br /> được so sánh với 25 chủng của thế  giới, bao  Kết quả  phân tích cho thấy, 3 genotype 1,  <br /> gồm   15   chủng   DHAV­3   của   Hàn   Quốc   và  2, 3 tập hợp riêng biệt thành 3 nhóm  chính. <br /> Trung Quốc; 2 chủng DHAV­2 của Đài Loan  Trong đó, nhóm DHAV­3 bao gồm 3 clade: 4  <br /> và 8 chủng DHAV­1 của Trung Quốc (hình 2).  chủng DHAV­3 của Việt Nam (NT, NT2, BM  <br /> Trong số  các chủng trên, DHAV­3  được lựa  và   HY)   thuộc   về   một   clade   cùng   với   các <br /> chọn là đại diện cho các chủng virus viêm gan  chủng   của   Trung   Quốc   (Clade   1);   6   chủng  <br /> vịt thuộc genotype 3 đã được công bố cho đến  DHAV­3   Việt   Nam   còn   lại   (DN1,   DN2, <br /> nay (theo phân bố vị trí địa lý và thời gian phân  KHO1,   KHO2,   LA1   và   NC)   thuộc   về   một <br /> clade   riêng biệt   và  có  mối  quan  hệ   gần  gũi  <br /> <br /> 21<br /> nhất với chủng B63 của Trung Quốc (Clade  Phát   hiện   lần   đầu   tiên   genotype   III  <br /> 3). Bốn chủng của Hàn Quốc thuộc về  một   (DHAV­3) virus gây bệnh viêm gan vịt tại <br /> clade riêng (Clade 2).  Việt   Nam   bằng   phương   pháp   giám   định <br /> phân   tử.   Tạp   chí   Công   nghệ   sinh   học, <br /> KẾT LUẬN T.8(2): 145­152.  (Vietmamese, summary in <br /> Bằng   phương   pháp   sinh   học   phân   tử,  English).<br /> chúng tôi đã phát hiện và xác nhận sự  có mặt   3. Kim   M.   C.,   Kim   M.   J.,   Kwon   Y.   K., <br /> của virus  viêm  gan vịt  genotype 3 tại  6  tỉnh   Lindberg A. M., Joh S. J., Kwon H. M., Lee <br /> thành của Việt Nam, bao gồm thành phố  Hồ  Y.   J.,   Kwon   J.   H.,   2009.  Development   of <br /> Chí Minh, Hưng Yên, Đồng Nai, Ninh Thuận,  duck hepatitis A virus type 3 vaccine and its <br /> Long   An   và   Khánh   Hòa.   Các   chủng   virus  use to protect ducklings against infections. <br /> DHAV­3 gây bệnh tại Việt Nam đã có những  Vaccine, 27(48): 6688­6694.<br /> biến đổi đặc trưng riêng trong hệ  gen, khác <br /> 4. Phạm Hùng, Đỗ  Văn Khiên, Đặng Thanh <br /> với các chủng của thế  giới  đã công bố. Kết <br /> Hiền, Phạm Thị  Bích Liên, Đỗ  Văn Tấn, <br /> quả  nghiên cứu cho thấy việc sản xuất và sử <br /> 2014.  Xác   định  tỷ  lệ   lưu  hành  của   virus <br /> dụng vaccine viêm gan vịt DHAV­3 tại Việt <br /> viêm gan vịt trên đàn vịt nuôi ở Nam Trung <br /> Nam, bên cạnh loại vaccine DHAV­1 truyền <br /> Bộ.   Tạp chí  Khoa   học  Kỹ  thuật  Thú  Y, <br /> thống là điều cần thiết hiện nay.<br /> T.31(3):   5­10.  (Vietmamese,   summary   in <br /> Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi  English).<br /> Quỹ  phát triển khoa học và công nghệ  quốc   5. Tseng   C.   H.,   Tsai   H.   J.,   2007.   Molecular <br /> gia (NAFOSTED), mã số 106.04­2012.60.  characterization of a new serotype of duck <br /> hepatitis virus. Virus Res., 126(1­2): 19­31.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 6. Wang L., Pan M., Fu Y., Zhang D., 2008. <br /> 1. Chen L. L., Xu Q., Zhang R. H., Yang L.,  Classification   of   duck   hepatitis   virus   into <br /> Li J. X., Xie Z. J, Zhu Y. L., Jiang S. J., Si  three   genotypes   based   on   molecular <br /> X.   K.,   2013.  Improved   duplex   RT­PCR  evolutionary   analysis.   Virus   Genes,   37(1): <br /> assay   for   differential   diagnosis   of   mixed  52­59.<br /> infection  of   duck   hepatitis   A   virus   type   1 <br /> and type 3 in ducklings. J. Virol. Methods,  7. Woolcock P. R., 2003. Duck hepatitis. In: <br /> 192(1­2): 12­17.  Saif   Y.   M.,   Barnes   H.   J.,   Glisson   J.   R., <br /> Fadly A. M., McDougald L. R., Swayne D. <br /> 2. Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Bá Hiên,  E. (Eds.). Diseases of Poultry, eleventh ed. <br /> Trần   Xuân   Hạnh,   Lê   Thanh   Hòa,   2010.  Iowa State Press, Ames, IA, 343­354.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> GENOTYPING OF DUCK HEPATITIS VIRUS TYPE 3 ISOLATED <br /> IN VIETNAM DURING 2009­2013<br /> <br /> 22<br />  Do Thi Roan, Doan Thi Thanh Huong, Le Thi Kim Xuyen, <br /> Nguyen Thi Khue, Vu Thi Tien, Le Thanh Hoa<br /> Institute of Biotechnology, VAST<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> The entire sequences for VP1 gene of ten DHAV samples isolated during 2009­2013 from six provinces <br /> in Vietnam were obtained. Based on high identity (91­100%) for nulcleotide and amino acid, DHAV strains  <br /> of Vietnam belonged to genotype 3 (DHAV­3) and have a “hyper variable region” at C­terminal of VP1. <br /> Notably, 6/10 strains of Vietnam showed four consistent differences within this group but distinct from all <br /> other DHAV­3 global strains (The positions are T184M, Q200H, K207N, K214R). Phylogenetic analysis <br /> indicated that DHAV­3 strains divided into three main clades, of which four of ten Vietnamese isolates were  <br /> clustered in the same clade with the Chinese strains (Clade 1). Six of others belonged to clade 3 close to the  <br /> Chinese B63 strain. Four Korean strains formed a separate clade (Clade 2). <br /> Keywords: DHAV­3, duck hepatitis, genotyping, inter/intragenotypic variation, VP1, Vietnam. <br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 23<br />