intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST
Báo xấu
38
lượt xem 7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng Aspergillus ban đầu, chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất để tiến hành nghiên cứu; khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men; tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính chitosanase của chủng được chọn trên môi trường tối ưu hóa. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP Sinh viên thực hiện : PHẠM MINH SANG MSSV: 0851110196 Lớp: 08DSH6 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ................................................................................. ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ ................................... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ..................................................................................... ix MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về chitin và chitosan .....................................................................6 1.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................6 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa ..................................................................7 1.1.2.1. Phân bố ................................................................................................7 1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa ...............................................................................7 1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin ......................10 1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan .........13 1.2. Đại cương về hệ enzyme Chitosanase..........................................................16 1.2.1. Định nghĩa ...............................................................................................16 1.2.2. Nguồn gốc và phân loại ..........................................................................16 1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase ...................................19 1.2.3.1. Trọng lượng phân tử..........................................................................19 1.2.3.2. Tính đặc hiệu cơ chất ........................................................................19 1.2.3.3. Đặc tính thủy phân ............................................................................20 1.2.3.4. Đặc tính động học .............................................................................21 i
  3. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.3.5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase ........22 1.2.3.6. Chất hoạt hóa và chất ức chế ............................................................24 1.2.4. Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase ...........24 1.2.4.1. Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase .................................................24 1.2.4.2. Tinh chế chitosanase .........................................................................25 1.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase ...................................26 1.2.5. Ứng dụng của chitosanase ......................................................................26 1.2.6. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam .........27 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới ................................27 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam..................................28 1.3. Khái quát về lên men bán rắn ......................................................................29 1.3.1. Định nghĩa lên men.................................................................................29 1.3.2. Lên men bán rắn .....................................................................................29 1.3.3. So sánh lên men bán rắn với lên men chìm ...........................................30 1.4. Khái quát về Aspergillus spp. .......................................................................32 1.4.1. Giới thiệu về Aspergillus spp. .................................................................32 1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp. ...................................33 1.4.3. Một số ứng dụng của Aspergillus spp. ...................................................34 1.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước .............35 1.5.1. Nguồn cám gạo trong nước ....................................................................35 1.5.2. Nguồn vỏ trấu trong nước ......................................................................36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................38 2.1.1. Chủng giống ............................................................................................38 ii
  4. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.1.2. Cơ chất cảm ứng .....................................................................................38 2.1.3. Cơ chất nuôi cấy ......................................................................................38 2.1.4. Hóa chất và thiết bị .................................................................................38 2.1.4.1. Hóa chất ............................................................................................38 2.1.4.2. Thiết bị ...............................................................................................39 2.1.5. Môi trường ...............................................................................................39 2.1.5.1. Môi trường giữ giống ........................................................................39 2.1.5.2. Môi trường nhân giống .....................................................................39 2.1.5.3. Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme ..............................................40 2.1.5.4. Môi trường lên men bán rắn .............................................................41 2.2. Phương pháp .................................................................................................41 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu ............................................41 2.2.2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử ..................................42 2.2.2.1. Cấy nhân sinh khối ............................................................................42 2.2.2.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu ……………………………………………………………………...42 2.2.3. Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có hoạt tính chitosanase cao.........................................................................43 2.2.3.1. Nguyên tắc .........................................................................................43 2.2.3.2. Tiến hành ...........................................................................................43 2.2.4. Phương pháp khuếch tán thạch đĩa .......................................................44 2.2.5. Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật ...............................................44 2.2.5.1. Quan sát đại thể ................................................................................44 2.2.5.2. Quan sát vi thể ...................................................................................44 iii
  5. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn...................................44 2.2.7. Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác định hoạt tính chitosanase .............................................................................45 2.2.7.1. Nguyên tắc .........................................................................................45 2.2.7.2. Tiến hành ...........................................................................................45 2.2.8. Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein.........................47 2.2.8.1. Nguyên tắc .........................................................................................47 2.2.8.2. Tiến hành ...........................................................................................47 2.2.9. Phương pháp trích ly enzyme chitosanase .............................................48 2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê .................................49 2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................49 2.2.10.2. Xử lý thống kê ....................................................................................49 2.2.11. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................49 2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase cao……………………………………………………………………………..49 2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng ..............49 2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí ..........................50 2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ...................50 2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống .........................50 2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ...................51 2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase ......................................................51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát ..52 3.1.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase .....................................52 iv
  6. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 3.1.2. Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase..................................53 3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2 ...................................................54 3.2.1. Hình thái đại thể .....................................................................................54 3.2.2. Hình thái vi thể ........................................................................................55 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ...............................................................................................................55 3.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 58 3.5. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ...............................................................................................................61 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 64 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase ...............................................................................................................67 3.8. Kết quả lên men bán rắn thu nhận enzyme ................................................70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận .............................................................................................................71 4.2. Kiến nghị ...........................................................................................................71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................72 PHỤ LỤC..................................................................................................................1 v
  7. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxy Methyl Cellulose GlcN Glucosamine GlcNAc N – acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton O1 Aspergillus oryzae – 1 O2 Aspergillus oryzae – 2 N1 Aspergillus niger – 1 N3 Aspergillus niger – 3 N7 Aspergillus niger – 7 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PGA Potato Glucose Agar LSF Liquid state fermentation SSF Solid state fermentation vi
  8. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các 1 1.1 10 oligomer của chitosan Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên 2 1.2 17 kết glycoside Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác 3 1.3 18 nhau 4 1.4 Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật 20 Hằng số Michaelis và Vmax của chitosanase ở một số loài 5 1.5 20 tiêu biểu 6 1.6 Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase 22 7 1.7 Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase 23 8 1.8 So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn 30 9 1.9 Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu 35 10 2.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine 36 11 2.2 bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm 37 12 2.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine 38 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả 13 2.4 39 năng sinh tổng hợp Chitosanase) Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương 14 3.1 42 pháp cấy điểm của các chủng O1, O2, N1, N3, N7 Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các 15 3.2 43 chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh 16 3.3 46 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng 17 3.4 47 protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp 18 3.5 49 chitosanase 19 3.6 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein. 50 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng 20 3.7 51 hợp chitosanase 21 3.8 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein. 53 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp 22 3.9 54 chitosanase. 23 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein. 56 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng 24 3.11 57 hợp chitosanase. 25 3.12 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 58 Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với 26 3.13 60 chủng O2. vii
  9. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 7 2 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 8 3 1.3 Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan 9 Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt 4 1.4 9 chitosan Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young và cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm 5 1.5 30 và pha khí liên tục trong hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) và sinh vật đơn bào (bên phải). Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc (bên trái) 6 3.1 54 và mặt dưới khuẩn lạc. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi 7 3.2 chưa nhuộm - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 55 40. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi 8 3.3 nhuộm Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở 55 vật kính 40. 9 PL1 Khuẩn lạc và đường kính vành khuyên phân giải 1 10 PL2 Bình nhân giống chủng O2 trên môi trường lúa 2 11 PL3 Đường chuẩn D - glucosamine 3 12 PL4 Đường chuẩn Albumine 3 viii
  10. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Biểu đồ Nội dung Trang Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của 1 3.1 53 các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng 2 3.2 56 sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng 3 3.3 58 protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng 4 3.4 59 hợp chitosanase 5 3.5 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein 60 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh 6 3.6 61 tổng hợp chitosanase 7 3.7 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 63 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng 8 3.8 65 hợp chitosanase 9 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 66 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh 10 3.10 68 tổng hợp chitosanase 11 3.11 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 69 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TT Sơ đồ Nội dung Trang Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer 1 1.1 12 (Tokutake và cộng sự, 1986). ix
  11. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên; trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiêm tỷ lệ khá cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiêu lĩnh vực như trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược,... Do dó, việc nghiên cứu sản xuât chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu. Các sản phẩm từ các loài giáp xác trên toàn thế giới ước tính tới 1,9 triệu tấn mỗi năm, phần lớn các sản phẩm từ tôm được sản xuất từ các nước châu Á trong đó có Việt Nam. Mỗi năm ngành công nghiệp này thải ra 1,4 triệu tấn chất thải với chủ yếu là vỏ và đầu tôm. Phương thức xử lý phần thừa thông dụng hiện nay chủ yếu là đốt bỏ, thải ra biển hoặc tập kết đến nơi xử lý rác. Cách làm này làm ô nhiễm vượt mức cho phép tại các khu vực có kinh doanh khai thác chế biến các loại giáp xác. Ở nước ta, sản lượng phế phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy hải sản là rất lớn. Theo ước tính mỗi năm riêng các nhà máy chế biến thủy, hải sản thải ra môi trường hơn 70 nghìn tấn phế liệu là vỏ tôm, cua các loại. Nếu các phế phẩm này được chế biến thành các sản phẩm có giá trị, ngoài việc mang lại nguồn lợi cao, nó còn góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm và các chi phí phát sinh trong quá trình xử lý chất thải. Chitin, chitosan có thể được thủy phân để tạo thành những chất có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp hóa học (acid HCl đậm đặc) hoặc bằng phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase,…). Việc thủy phân chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như chi phí cao, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, gây hao mòn máy móc thiết bị cao và quan trọng là sản phẩm thu được có hoạt tính không cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất các dẫn suất thủy phân từ chitin và chitosan bằng phương pháp sinh học là một 1
  12. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ, ít gây ô nhiễm môi trường và nhất là sản phẩm thu được có chất lượng tốt. Bên cạnh đó, nấm mốc là nguồn cung cấp hệ enzyme ngoại bào vô cùng phong phú, khả năng sinh trưởng mạnh trên các nguồn cơ chất khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase trên nấm mốc là việc làm cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho nguyên liệu, hóa chất và quan trọng là sẽ dễ dàng đưa vào ứng dụng sản xuất với điều kiện trong nước. Vì những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.” trong khóa luận tốt nghiệp này. 2. Tình hình nghiên cứu Trong nước: + Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griceus, Phạm Hồng Ngọc Thùy – Khoa chế biến trường đại học Nha Trang (03/2008). + Thu nhận và mô tả đặc tính của enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1, Nguyễn Thị Phương Nhung – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (2012). + Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ mẫu đất ở Phước Long – Nha Trang; Nguyễn Trọng Thăng và Ngô Xuân Mạnh; Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2011). + Lâm Ngọc Tuyết, Đỗ Anh Tuấn, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2003), Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa chitosanase trong E. Coli, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội đồng Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống, Huế. + Cao Thị Ngọc Phượng, Ngô Phước Hậu, Đỗ Anh Tuấn, Trần Linh Thước, Jügen Pleiss (2003), Xây dựng cơ sở dữ liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh 2
  13. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. học: trường hợp chitinase và chitosanase, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội các ngành Sinh học Việt Nam, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội. Nước ngoài: + J. S. PRICE and R. STOCK; Production, Purification, and Characterization of an Extracellulase Chitosanase from Streptomyces; Journal of Bacteriology (12/ 1975). + Tamo Fukamizo, Yuji Honda, Sachio Goto, Isabelle Boucher and Ryszard Brzezinski; Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174; Biochem. J. (1995). Great Britain. + Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang và Wen-Sui Xia; Strain imvironment and optimization of the media composition of chitosanase-producing fungus Aspergillus sp. CJ 22-326; African Journal of Biotechnology Vol. 7 (14), 18 July, 2008. + Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, và Yaw-Kuen Li; Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a chitosanase from Aspergillus fumigatus; The Journal of Biological Chemistry Vol. 281, NO. 6, February 10, 2006. U.S.A. 3. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp. - Làm phong phú thêm nguồn thu nhận chitosanase từ vi sinh vật. - Tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng Aspergillus ban đầu, chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất để tiến hành nghiên cứu. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men. - Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính chitosanase của chủng được chọn trên môi trường tối ưu hóa. 3
  14. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 5. Phương pháp nghiên cứu Trong nuôi cấy vi sinh vật, khả năng thuần cũng như khả năng sinh ra các hoạt chất cao của giống là yếu tố quyết định đến hiệu suất của quá trình. Vì vậy, trước khi thực hiện, cần tiến hành khảo sát từ 5 chủng mốc giống được cung cấp để chọn ra được chủng cho kết quả khảo sát tối ưu nhất trên môi trường thực hiện khảo sát. Sau khi đã chọn được chủng tiến hành nghiên cứu, thực hiện việc nghiên cứu đối với chủng được chọn trên các yếu tố môi trường ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme như: tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, độ thoáng khí, tỷ lệ tiếp giống, thời gian nuôi cấy… Trong các thí nghiệm này, thông số thay đổi là mức của các yếu tố và chỉ tiêu theo dõi chính là hoạt tính enzyme và hàm lượng protein thu được ở từng mức của yếu tố khảo sát. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Đã chọn ra được một chủng từ 5 chủng giống được cung cấp. - Đã tối ưu hóa được một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase. - Đã tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính của enzyme trên môi trường đã tối ưu hóa. 7. Kết cấu của đồ án - CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU – nội dung chương đề cập đến các nội dung có liên quan đến đề tài nghiên cứu. - CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ thiết bị và đặc biệt là các phương pháp thực nghiệm dùng trong đồ án. - CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện chứng cho những kết quả thu được. 4
  15. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ – nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài đạt được và đệ trình những phần cần thực hiện thêm của đề tài. 5
  16. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.1. Đại cương về chitin và chitosan 1.1.1. Lịch sử phát hiện Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và ông đã đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra nó. Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là “chitin” hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện ra sự có mặt của Nitơ, cuối cùng cả Braconnot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu trúc của cellulose [3]. Năm 1929, Karrer đun sôi chitin với dung dịch KOH 5% trong 24 giờ và đun tiếp ở 160oC với kiềm bảo hòa trong 50 phút, ông thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử, sản phẩm đó chính là chitosan [3]. Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ X. Nhật, Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc và Pháp là những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan. Năm 1973, Nhật Bản là nước đầu tiên sản xuất chitosan thương phẩm với sản lượng 20 tấn/năm, hiện nay đã lên tới hơn 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know (1991), thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan. Theo như ước tính của các nhà phân tích, trong những năm tới sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm, trong đó, Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chính [1]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978 – 1980, trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng. Điều này đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên vẫn chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [1]. 6
  17. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa 1.1.2.1. Phân bố Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được tổng hợp với năng suất trung bình là 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên, chitin hiện diện ở động vật và thực vật. Ở động vật, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ ngoài của tôm, cua và các loài giáp xác; là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số loài động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể và giun tròn. Ở thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [11]. 1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa Chitin là chất rắn vô định hình, bền, không tan trong nước, acid, kiềm, cồn và các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin cũng có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bởi enzyme vi sinh vật [7]. Ngoài ra, chitin ít hiện diện ở trạng thái tự do, thường ở dạng phức hợp với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [3]. Chitin là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân N – acetyl glucosamine (GlcNAc), có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (– OH) ở C2 được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3). Như vậy, chitin là poly N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với nhau bởi các liên kết 1,4 – β – glycoside. Trong đó, các mắc xích của chitin cũng được đánh số như glucose [3]. Công thức phân tử: [C8H13NO5]n Mchitin = (203,186)n Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin 7
  18. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc trưng, gọi là dạng α và β. Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Dạng thứ ba ít phổ biến hơn là γ – chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, theo một số nhà phân tích thì dạng thứ ba chỉ là một dạng khác trong cấu trúc của α – chitin. α – chitin là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua, các loài nhuyễn thể là thức ăn của cá voi và trong biểu bì của các loại côn trùng… hiếm hơn là dạng β – chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [7]. Chitin là một nguyên liệu bền, giúp các loài giáp xác chống lại các tác nhân gây hại và áp suất của môi trường. Để thủy phân hoàn toàn chitin, vi sinh vật có khả năng thủy phân chitin hầu hết đều có một hệ gồm 2 loại enzyme thủy phân là chitinase và chitobiase (β – N – acetylglucosaminidase hoặc β – N – acetylhexosaminidase) [13]. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (–NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan có cấu trúc mạch thẳng được hình thành từ các đơn phân D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glycoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly 1,4 – β – 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucose hay poly 1,4 – β – D – glucosamin. Công thức phân tử: [C6H11NO4]n Mchitosan = (161,151)n Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan. Chitosan được tạo thành từ quá trình hóa học hay enzyme đều không bị khử hoàn toàn nhóm acetyl. Tỷ lệ acetyl còn lại trong chitosan khác nhau tùy theo 8
  19. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. phương pháp khử acetyl và tính nhạy cảm của enzyme. Sự phân bố N – acetyl glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN) trên mạch chitosan cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng. Chitosan có hai dạng dị liên kết là GlcNAc- GlcN, GlcN – GlcNAc và hai đồng liên kết là GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN. Do vậy, sự thủy phân các liên kết này trong chitosan bằng enzyme cũng khác nhau [13]. Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện như Hình 1.3, trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8]. Hình 1.3. Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan. Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), là tỷ lệ thay thế nhóm – NHCOCH3 bằng nhóm –NH2 trong phân tử chitin (Hình 1.4.). Nếu DD < 50% thì là chitin, DD ≥ 50% thì là chitosan [7]. Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan Độ deacetyl hóa có thể được xác định dựa vào:  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR). 9
  20. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp.  Phổ hồng ngoại IR.  Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric  Phản ứng tạo màu với ninhydrin.  Xác định theo Nitơ [32]. Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà không bị tủa khi có mặt một số ion kim loại nặng như: Pb 2+, Hg+… chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một heteropolymer của “polycation”, có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (-NH2) [12]. Trong khi hầu hết các polysaccharide trong tự nhiên như cellulose, dextran, pectin, agar, agarose… đều trung tính hay có tính acid thì chitosan (chitin) lại có tính base cao [32]. Nhiệt độ nóng chảy của chitosan là 309 – 311oC. Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hơn hai ngàn kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Trong tự nhiên, chitosan được tìm thấy trong vách tế bào một số loài nấm như Zygomycetes, trong tảo lục Chlorella sp., cũng như trong lớp vỏ của côn trùng, tôm, cua [33]. 1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ các loài giáp xác như: tôm, cua, mực, sam… được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ và ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl 6 – 12%) để loại bỏ các khoáng canxi và tạp chất. Hỗn hợp này được nấu với dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại các protein tạp; sau đó ngâm lần lượt trong các hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% và H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để tẩy màu, thu nhận sản phẩm là chitin. Để thu nhận được chitosan thì phải qua quá trình khử nhóm acetyl của chitin bằng cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%) [9]. Việc thủy phân chitin thành oligomer có thể được thực hiện bằng phương pháp dùng acid [29], enzyme [3]. Sự thủy phân mạch polysaccharide của chitosan bằng acid sẽ cắt đứt các liên kết glycoside giữa các phân tử đường D – glucosamin 10
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2062 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2