Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men đề thu nhận enzym amylase

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm thu thập nguồn bánh men từ các vùng khác nhau, sau đó phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, lấy chủng đó lên men thu enzym bằng phương pháp lên men chìm, lên men bán rắn, lên men công nghiệp và ứng dụng chúng để thu nhận enzyme amylase. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men đề thu nhận enzym amylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NẤM MỐC TỪ BÁNH MEN ĐỂ THU NHẬN ENZYME AMYLASE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: ĐỒNG THỊ MINH THANH Lớp: 11HSH02 MSSV: 1191111040 TP. Hồ Chí Minh, 2013
Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp “Nghiên cứu tìm hiểu về enzym amylase, amylase nấm mốc và vi khuẩn” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Hoài Hương. Người thực hiện đề tài xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. TP.HCM, ngày tháng 9 năm 2013 Người thực hiện đề tài Đồng Thị Minh Thanh
LỜI CẢM ƠN Để thực hiện đề tài này, người thực hiện đề tài xin dành lời cảm ơn chân thành nhất gởi đến TS. Nguyễn Thị Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa KhoaCông Nghệ Sinh Học – Môi Trường Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh cùng các quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy người thực hiện đề tài trong suốt khóa học. - Lãnh đạo Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư đã tạo điều kiện giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thành tốt trong suốt chương trình học và quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng, người thực hiện đề tài xin cảm ơn đến gia đình, các anh chị em trong bộ phận xét nghiệm Trung tâm Khuyến Nông Khuyến Ngư đã động viên và giúp đỡ người thực hiện đề tài trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Người thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Hội đồng chấm luận án đã phản biện, đánh giá, góp ý, giúp đỡ người thực hiện đề tài hoàn thiện luận văn tốt nghiệp này. Chân thành cảm ơn! ii
Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. MỤC LỤC .......................................................................................................................i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH....................................................................................v PHẦN MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................4 1.1. Giới thiệu về enzym amylase nấm mốc ................................................................4 1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase .......................................................................4 1.1.2. Phân loại ........................................................................................................5 1.2. enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn .....................................................5 1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: ....................................................................9 1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng .......................................................................................9 1.3.2. Độ ẩm ...........................................................................................................12 1.3.3. Nhiệt độ ........................................................................................................12 1.3.4. pH .................................................................................................................13 1.4. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase......................................................13 1.4.1. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp bề mặt ................13 1.4.2. Nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy chìm. ...15 1.5. Ứng dụng của enzyme amylase ..........................................................................16 1.5.1. Amylase trong công nghiệp rượu – bia ........................................................16 1.5.2. Trong sản xuất bánh mì ...............................................................................17 1.5.3. Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco ..................................................17 1.5.4. Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác ......................................18 1.5.5. Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy .......................................................18 1.5.6. Trong chăn nuôi ...........................................................................................19 1.5.7. Trong y học ..................................................................................................19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................20 i
2.1. Vật liệu ................................................................................................................20 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................20 2.1.2. Vật liệu và hóa chất......................................................................................20 2.2. Phương pháp .......................................................................................................22 2.2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................22 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22 2.3. Qui trình lên men bề mặt tạo Enzym Amylase ..................................................28 2.3.1. Qui trình công nghệ lên men bề mặt ............................................................28 2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme amylase theo Wohlgemuth ...............................29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...............................................................31 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu.................31 3.2. Kết quả quan sát hình thái nấm mốc ...................................................................32 3.3. Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase ..........................................................................34 3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm ....................................................................................................................................36 3.4.1. Điều kiện nuôi cấy........................................................................................36 3.4.2. Xác định hoạt tính của enzyme Amylase ......................................................37 3.4.3. Kết quả xác định hoạt tính của enzyme Amylase .........................................37 3.5. Kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase.....................................................38 3.6. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase sau kết tủa ....................................42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................47 4.1. Kết luận ...............................................................................................................47 4.2. Kiến nghị.............................................................................................................47 ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên Ghi chú MT Môi trường PGA Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) CĐ Chợ Động – Phan Rang– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu CL Chợ Lớn – Đường Thống Nhất – TP. Phan Rang Nơi lấy mẫu NS Chợ Ninh Sơn– Ninh Thuận Nơi lấy mẫu KB Chợ Kim Biên – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu LB Chợ Long Bình – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NH Chợ Ninh Hải – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu TN Chợ Thuận Nam – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu NP Chợ Ninh Phước – Ninh Thuận Nơi lấy mẫu M1 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M2 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Động M3 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M4 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Lớn M5 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M6 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Sơn M7 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Kim Biên M8 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Long Bình M9 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Hải M10 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Thuận Nam M11 Chủng nấm mốc của mẫu bánh men chợ Ninh Phước Dd Dung dịch iii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu……………………………………………..20 Bảng 2.2: Thuốc thử Lugolc…………………………………………………………21 Bảng 2.3: Dung dịch đệm axetat pH 4,7……………………………………………..21 Bảng 2.4: Dung dịch tinh bột 1% ……………………………………………………21 Bảng 2.5: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar) …………………………………21 Bảng 2.6: Môi trường thạch – tinh bột……………………………………….………22 Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu……………………31 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh men cơm rượu……………………………………………………………………………..…….32 Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu…………………………………………………………………...…………34 Bảng 3.4: Bảng kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme……………...………38 Bảng 3.5: Xác định hoạt tính enzyme amylase thu được trong thời gian 2, 3, 4 ngày lên men thể rắn…………………………………………………………………..……43 Bảng 3.6: Thí nghiệm thủy phân tinh bột…………………………………….……....44 iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Môi trường PGA sau khi hấp……………………………………………...23 Hình 2.2: Đổ đĩa peptri……………………………………………………………….24 Hình 2.3: Môi trường nuôi cấy sau 48h………………………………………………24 Hình 2.4:Môi trường sau làm thuần…………………………………………………..24 Hinh 2.5. Cấy giữ giống………………………………………………………………25 Hình 2.6: Quy trình thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc…………………………27 Hình 2.7 : Quy trình công nghệ lên men bề mặt……………………………………...28 Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng nấm mốc M2, M4, M7, M10…………………...32 Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11…………..35 Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7……………………...36 Hình 3.4: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme…………………………………….38 Hình 3.5: Môi trường nuôi cấy sau khi hấp…………………………………..………39 Hình 3.6: Cấy giống vào môi trường nuôi cấy………………………………………39 Hình 3.8: Thu dịch nuôi cấy………………………………………………………….40 Hình 3.9: Lọc dịch chiết……………………………………………………………...41 Hình 3.10: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh………………....41 Hình 3.11: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 2 ngày nuôi cấy……………..42 Hình 3.12: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 3 ngày nuôi cấy……………..42 Hình 3.13: Thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme sau 4 ngày nuôi cấy……………..43 Hình 3.14: Kết thúc thủy phân tinh bột gạo hồ hóa………………………………….45 v
PHẦN MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài. Ngày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo, bánh mì... Sản xuất enzyme Amylase từ bánh mem (cơm rượu) là một trong những đề tài mang tính cấp thiết, bởi vì bánh men có chứa rất nhiều chủng có khả năng tạo ra enzyme amylase như nấm men, nấm mốc ...đây là nguồn nguyên liệu dễ tìm và rẻ tiền, là nguyên liệu truyền thống sản xuất rượu trắng đảm bảo sự an toàn cho người tiêu dùng và enzyme amylase thu được từ nấm mốc có trong bánh men có những ưu điểm ưu việt, vì vậy trong nội dung đồ án tốt nghiệp người thực hiện đề tài đã chọn đề “Nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzym amylase” 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào. Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt. Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn…Trong đó nấm mốc có khả năng tạo ra enzym amylase nhiều hơn cả. Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi, tức là tất cả các mốc mọc trên thực phẩm, trên chiếu, trên quần áo, trên sách vở … Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm. Nấm mốc là vi sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp vì quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy nấm mốc rẻ tiền và dễ kiếm, tốc độ sinh sản của nấm mốc phát triển vật rất nhanh, Enzyme thu nhận từ nấm mốc có hoạt tính rất cao, đồng thời trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn về enzyme nội bào mà còn 1
thu được một lượng đáng kể enzyme ngoại bào do nấm mốc tiết ra môi trường. Vì thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới, mang lại hiệu suất kinh tế cao. 3. Mục tiêu nghiên cứu, đối tượng: Phân lập vi nấm enzyme amylase từ bánh men rượu và thử nghiệm các quy trình lên men thu enzyme amylase, cụ thể: + Thu thập nguồn bánh men từ các vùng khác nhau, sau đó phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột, lấy chủng đó lên men thu enzym bằng phương pháp lên men chìm, lên men bán rắn, lên men công nghiệp và ứng dụng chúng để thu nhận enzyme amylase. + Xác định hoạt tính của enzyme amylase thu được và thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột của enzyme amylase nhằm góp phần tạo ra nguồn enzyme có giá trị từ vi sinh vật. + Phạm vi và giới hạn của đề tài Trong giới hạn của đề tài, người thực hiện đề tài chỉ tập chung tìm hiểu về nguồn nấm mốc có trong bánh men để thu nhận enzyme trong quy mô phòng thí nghiệm. Do trang thiết bị máy móc tại phòng thí nghiệm không đầy đủ, chưa hiện đại nên đồ án còn nhiều hạn chế, chỉ dừng lại ở bước thu sản phẩm bán tinh khiết. 4. Kết quả đạt được: Đã Phân lập được 11 chủng nấm mốc từ bánh men cơm rượu ở 8 địa điểm khác nhau, trong đó có 9 chủng nấm mốc đều có khả năng phân giải tinh bột bao gồm các chủng: M1, M3, M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11 và 2 chủng không có khả năng phân giải tinh bột là chủng M2, M6. Như vậy, 9 chủng nấm mốc có khả năng tạo enzyme amylase, 2 chủng nấm mốc không có khả năng tạo enzyme amylase. - Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp nuôi cấy chìm. 2
- Từ 1 lít môi trường nuôi chủng M4 thu được 1,23 g chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết. - Đã tiến hành nuôi cấy chủng M4 để thu nhận được enzyme amylase bán tinh khiết theo phương pháp lên men công nghiệp. - Xác định enzym amylase có hoạt tính cao nhất thu được trong thời gian nuôi cấy ở 3 ngày. Xác định khả năng phân giải tinh bột gạo của enzyme amylase từ đó tính được nồng độ enzyme amylase cần để thủy phân hết 1g tinh bột gạo. 5. Cấu trúc đồ án: Đồ án gồm các chương sau đây: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tìm hiểu về enzym amylase nấm mốc, enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn, các phương pháp thu nhận enzyme amylase và ứng dụng của enzyme amylase... CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các vật dụng và hóa chất để tiến hành thí nghiệm. Xác định đối tượng nghiên cứu, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Mô tả phương pháp và qui trình lên men , xác định hoạt tính enzym amylase ... CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Các kết quả sau khi thực nghiệm như: kết quả quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu, kết quả quan sát hình thái nấm mốc, kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc và chọn lọc chủng sản xuất enzyme amylase, kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy chìm, kết quả lên men bề mặt thu enzyme amylase, kết quả xác định hoạt tính enzym amylase sau kết tủa... CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Các kết luận và kiến nghị của đồ án. 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về enzyme amylase nấm mốc 1.1.1. Khái niệm về enzyme amylase Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga,Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân giải tinh bột đó là từ đại mạch nảy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dung dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase. Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men. Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Đối với enzyme amylase có trong nấm mốc, khi nuôi nấm mốc tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc 4
tuyến tính vào sự tăng sinh khối. Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng. 1.1.2. Phân loại Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, Glucoamylase… Tốc độ phản ứng của Enzyme Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau. 1.2. Enzyme amylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn Trong thiên nhiên, enzyme amylase có ở hầu hết mọi vi sinh vật, thực vật và động vật. Song chỉ có một số loài vi sinh vật và một số hạt thực vật mới là đối tượng dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme amylase. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều enzyme amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều enzyme khác nhau. Vi sinh vật tạo enzyme amylase được dùng nhiền hơn cả là nấm mốc, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. - Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc Aspergillus, Rhizopus và một số loài của giống Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ α- amylase và glucoamylase. Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopis, Endomyces cũng tạo enzyme amylase. - Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, Bacillus circulans… 5
- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo enzyme amylase rất mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số tạo enzyme như xạ khuẩn ưa nhiệt. Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm. Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men. Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất: tinh bột, glycogen và polyose đồng loại một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội phân. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ 1 số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh sang giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose, và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- 6
amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Bacilus subtilis của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme. Canxi còn có tác dụng bảo đảm cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein.α- amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. α-amylase bị kìm hãm bởi kim loại nặng. α-amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ tinh bột. Ở giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc tạo ra một số lần. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5-4,8, của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8-6,0. Độ bền đối với tác dụng của axit cũng khác nhau.α-amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với axit tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacilus subtilis. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúa tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của nhiệt.Nhiệt độ tối thích của nó là 500C.Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58-600C. Amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C . Amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C, trong khi đó amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C. Những khác biệt về nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của α- amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng 7
dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất. β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β-amylase. Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α- 1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ của iodine. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Glucoamylase là enzym ngoại phân, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose.Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “axit” . Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So với α-amylase, glucoamylase bền đối với axit hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+. Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Đa số các chế phẩm glucoamylase của nấm mốc, vi khuẩn, nấm men và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng axit trừ glucoamylase của 8
Saccharomyces italicus và một số mô động vật có pH hoạt động tối thích ở vùng trung tính. Glucoamylase axit có pH hoạt động tối thích là 4,0-5,0; glucoamylase trung tính pH tối thích là 6,0-7,5. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất các chế phẩm enzyme amylase để sử dụng trong sản xuất và đời sống. Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của enzyme amylase ngày càng được phát triển mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn đối với việc ứng dụng enzyme amylase rộng rãi trong các ngành công nghiệp. 1.3. Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: 1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng Nấm mốc là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng carbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng carbon dị dưỡng. mốc là những loài nấm có kiểu carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng. a. Nguồn carbon: Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau. Các loại thức ăn carbon có thể dùng làm nguồn năng lượng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối với nấm mốc có thể kể đến các loại hydradecarbon (monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của hydradecarbon, các loại rượu, các loại axit hữu cơ, các loại axit amin, protein, lipid....Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Đối với các nguồn carbon phức tạp (tinh bột, cenlulose,...) trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng. b. Nguồn Nitơ: Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn nitơ.Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn các nguồn 9
nitơ vô cơ. Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat. Đôi khi có những loại nấm mốc không phát triển được trên các môi trường chứa nguồn nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ ( SO42- , HPO42- , Cl- ...) và làm hạ độ pH của môi trường xuống. Ngược lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý. Sau khi nấm đồng hóa gốc NO3- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation (Na+ , K+...) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trường. Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cường rõ rệt khi bổ sung vào môi trường một ít axit hữu cơ ( acid lactic, acid malic...). Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptid, acid amin, ...). c. Các nguyên tố khoáng: Nấm mốc cần các nguyên tố đa lượng như: S, P, K, Ca, Mg và Fe. Các nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với những số lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng như: Mn, Zn, Cu, Co, Ni, ... Lượng chứa từng nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay đổi tùy thuộc vào từng loài nấm mốc mà còn phụ thuộc cả vào điều kiện nuôi cấy chúng. Sau đây là vai trò các chất khoáng trong tế bào nấm mốc: - Phospho: thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm mốc. Phospho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào nấm mốc như: nucleoprotein, nucleotid, phosphoprotein, phosphatid... ). - Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần của một số acid amin: cystin, cystein, metionin. Lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như acid lipoic, biotin, coenzyme A ... - Kali: có lượng khá lớn trong các tế bào nấm mốc, chúng tham gia vào quá trình trao đổi glucid và có ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi chất khác của các tế bào này. 10
- Magnesium: tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào. Có nghiên cứu cho biết việc thiếu Mg2+ dẫn đến việc ức chế quá trình hình thành bào tử ở một số loài nấm mốc. - Canxi: không tham gia các thành phần các chất hữu cơ trong tế bào nhưng chúng rất cần thiết vì đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào (giữa các nucleotid, giữa protein và acid nucleic). Canxi còn có ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không gian ổn định của ribosome, nhân ... - Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin sắt của các hệ thống enzyme chuyển vận electron. Sắt còn tham gia vào cấu trúc của các enzyme catalase, peroxidase. d. Các chất sinh trưởng: Cũng giống như đối với các loại vi sinh vật khác, nấm mốc có những quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng khác. Việc một loài nấm mốc không đòi hỏi một loại chất sinh trưởng nào đấy có thể do hoặc là chúng tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng này hoặc là trong quá trình trao đổi chất chúng không cần tới loại coenzyme có chứa chất sinh trường này. Người ta chia nấm mốc thành hai nhóm căn cứ vào mối quan hệ của chúng đối với các chất sinh trưởng : - Nhóm tự dưỡng chất sinh trưởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh trưởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng. - Nhóm dị dưỡng chất sinh trưởng: cần phải được cung cấp một vài hoặc nhiều chất sinh trưởng ở dạng có sẵn.. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống. Phần lớn các vitamin nhóm B được các loài nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng. Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) được tìm thấy trong các lớp màng sinh học, sự tồn tại và số lượng của các loại vitamin này trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với sự hoạt động của các lớp màng này. 11
1.3.2. Độ ẩm Ngoài các chất dinh dưỡng nấm mốc cũng như tất cả sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến lượng nước này là độ ẩm, bao gồm : hàm lượng nước của sản phẩm, độ ẩm tương đối của không khí. Giữa hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm của không khí ở môi trường ngoài có mối liên quan (trao đổi qua lại).Chính mối liên quan dinh dưỡng này không những ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến khả năng sử dụng nước của tế bào nấm mốc cho các quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng. a. Hàm lượng nước của sản phẩm: Nước trong các sản phẩm như: lương thực, thực phẩm, thuốc men, dược liệu… gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết. Nấm mốc cũng như các vi sinh vật khác chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm, và cũng chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí. b. Độ ẩm tương đối của không khí: Mỗi loại nấm mốc thích ứng với một khoảng giá trị độ ẩm tương đối.Việc giảm độ ẩm tương đối sẽ làm ngừng hoặc kéo dài thời gian nảy chồi của bào tử nấm mốc.Nấm mốc sống trong môi trường có độ ẩm tương đối thấp, chúng có khả năng thích nghi dần để có thể tiếp tục sinh trưởng, phát triển bình thường hoặc ở trạng thái sống nghỉ. Ở độ ẩm tương đối thấp cùng với hàm lượng nước thấp trong sản phẩm, tế bào nấm mốc đầu tiên mất nước tự do, sau mất nước liên kết. Tùy theo lượng nước mất đi, nấm mốc chuyển sang trạng thái sống nghỉ hoặc bị chết. Phần lớn nấm mốc không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện độ ẩm tương đối của không khí môi trường dưới 60%. 1.3.3. Nhiệt độ Mỗi loài nấm mốc cũng có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sinh trưởng.Phần lớn nấm mốc sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ 15-300C và cũng thường có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 20-250C tùy từng loài.Một số rất nhỏ các loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở các kho lạnh ở nhiệt độ -60C, thậm 12