Đột biến gen FLT3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy không có bất thường nhiễm sắc thể

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> ĐỘT BIẾN GEN FLT3 TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY  <br /> KHÔNG CÓ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ <br /> Phan Thị Xinh*,**, Hoàng Anh Vũ* <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Đặt vấn đề: Xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh <br /> bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT). <br /> Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 18 bệnh nhân BCCDT không kèm bất thường nhiễm sắc <br /> thể được khảo sát đột biến gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ <br /> 05/2012 đến 05/2013. <br /> Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khuếch đại vùng gen chứa các exon 14 đến exon 20 bằng một <br /> cặp mồi duy nhất, cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến của gen FLT3. Khảo sát trên 18 bệnh nhân, chúng <br /> tôi phát hiện 9 trường hợp (50%) có đột biến, bao gồm 6 trường hợp chèn đoạn của exon 14 và 3 trường hợp đột <br /> biến điểm của exon 16 và 20. <br /> Kết luận: Quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành công tại Bệnh viện Truyền máu <br /> Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân BCCDT. <br /> Từ khóa: Gen FLT3, đột biến, bạch cầu cấp dòng tủy, nhiễm sắc thể đồ. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> FLT3 GENE MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH A NORMAL KARYOTYPE <br /> Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu  <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 232 ‐ 236 <br /> Background: The aim of this study is to establish a DNA sequencing procedure for detection of FLT3 gene <br /> mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML). <br /> Methods: Bone marrow samples of  18 AML patients with a normal karyotype were used for detection of <br /> FLT3 mutations from exons 14 to exon 20 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from May 2012 to <br /> May 2013. <br /> Result: We successfully amplified FLT3 exons 14 to 20 using a single primer pair, which facilitate detection <br /> of almost all the known mutations in this gene. We found 9 mutations from 18 patients (50%), including 6 with <br /> internal tandem duplications within exon 14 and 3 with point mutations within exons 16 and 20. <br /> Conclusion: DNA sequencing for detection of FLT3 mutations was established at our hospital. This may <br /> help to improve the prognostic classification for AML patients. <br /> Key words: FLT3 gene, mutation, acute myeloid leukemia, karyotype. <br /> trong  tủy  xương.  Về  lâm  sàng  cũng  như  sinh <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> học,  BCCDT  biểu  hiện  nhiều  thể  khác  nhau <br /> Bệnh  bạch  cầu  cấp  dòng  tủy  (BCCDT)  là <br /> gây  khó  khăn  cho  việc  tiên  lượng  và  điều  trị. <br /> bệnh lý ác tính về máu, đặc trưng bởi sự tăng <br /> Nếu chỉ dựa vào các bất thường ở mức nhiễm <br /> sinh quá mức và không biệt hóa của các tế bào <br /> sắc  thể,  BCCDT  thường  được  phân  thành <br /> tạo máu, gây tích tụ tế bào  non  trong  máu  và <br /> nhóm tiên lượng tốt, tiên lượng trung bình hay <br /> * Đại  học Y Dược TP.HCM <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh  <br /> <br /> 232<br /> <br /> ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. <br /> ĐT: 0932728115  <br /> Email:<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> tiên  lượng  xấu(1,3).  Theo  cách  phân  chia  này, <br /> những  bệnh  nhân  không  có  bất  thường  về <br /> nhiễm sắc thể được cho là có tiên lượng trung <br /> bình.  Tuy  nhiên,  các  nghiên  cứu  gần  đây  lại <br /> cho  thấy  rằng  ngay  trong  nhóm  bệnh  nhân <br /> không có bất thường NST thì tiên lượng cũng <br /> khác  nhau,  tùy  theo  bệnh  nhân  có  kèm  theo <br /> các đột biến gen hay không. <br /> Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa <br /> cho thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III. Đây <br /> là một trong những gen thường bị đột biến nhất <br /> trong  các  bệnh  lý  ác  tính  về  máu(7).  Đột  biến <br /> thường gặp nhất của gen FLT3 là sự nhân đoạn <br /> nội tại (ITD: internal tandem duplication) thuộc <br /> exon 14 hay exon 15 của vùng cận màng(1). Các <br /> đột  biến  điểm  tại  codon  676  của  exon  16  hay <br /> quanh  vùng  codon  835  của  exon  20  cũng  đã <br /> được báo cáo trong BCCDT(5). Các đột biến gen <br /> này là những đột biến tăng chức năng, góp phần <br /> quan  trọng  vào  cơ  chế  bệnh  sinh  của  BCCDT <br /> bằng cách làm cho thụ thể FLT3 được hoạt hóa <br /> liên tục, không còn phụ thuộc vào các phân tử <br /> truyền  tín  hiệu  ngoại  bào  nữa.  Bệnh  nhân <br /> BCCDT với nhiễm sắc thể bình thường nhưng <br /> có  mang  đột  biến  gen  FLT3  thì  được  xếp  vào <br /> nhóm  tiên  lượng  xấu.  Mặt  khác,  việc  ức  chế <br /> hoạt tính của các protein FLT3 đột biến hứa hẹn <br /> là một mô thức điều trị nhắm trúng đích phân tử <br /> hiệu  quả  trong  tương  lai(10).  Chính  vì  thế,  khảo <br /> sát  tình  trạng  đột  biến  gen  FLT3  trở  nên  quan <br /> trọng  trong  cả  tiên  lượng  và  điều  trị  cho  bệnh <br /> nhân(8). <br /> Chúng  tôi  tiến  hành  nghiên  cứu  này  nhằm <br /> xây dựng quy trình xác định đột biến gen FLT3 <br /> và  mô  tả  những  kết  quả  ban  đầu  trên  nhóm <br /> BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu – Huyết Học <br /> Thành phố Hồ Chí Minh. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng <br /> Khảo sát đột biến gen FLT3 được tiến hành <br /> trên  18  mẫu  tủy  xương  của  bệnh  nhân  bị <br /> BCCDT. Tất cả các bệnh nhân này không có bất <br /> <br /> Huyết Học<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> thường  của  bộ  nhiễm  sắc  thể  khi  phân  tích <br /> nhiễm sắc thể đồ.  <br /> <br /> Phương pháp <br /> RT–PCR <br /> Mẫu tủy trong chống đông EDTA được xử <br /> lý loại hồng cầu và RNA được tách chiết bằng <br /> RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn <br /> của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng <br /> máy  quang  phổ  kế  spectrophotometer.  DNA <br /> bổ  sung  (complement  DNA  hay  cDNA)  được <br /> tổng  hợp  từ  1  μg  RNA  với  bộ  hóa  chất <br /> SuperScript™  II  Reverse  Transcriptase <br /> (Invitrogen,  Mỹ).  Chất  lượng  cDNA  được <br /> kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của <br /> gen  beta‐actin  dài  1180  bp.  Để  khuếch  đại <br /> đoạn gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20, chúng <br /> tôi  thiết  kế  mồi  xuôi  FLT3‐F1  (5’‐ <br /> GACAACATCTCATTCTATGCAAC  ‐3’)  nằm <br /> trên  exon  13  và  mồi  ngược  FLT3‐R1  (5’‐ <br /> TTAGCATCAACCGGAATGCC  ‐3’)  nằm  trên <br /> exon  22  bằng  phần  mềm  Oligo  4.1,  dựa  trên <br /> trình  tự  chuẩn  của  gen  FLT3  mang  accession <br /> number <br /> NM_004119 <br /> trong <br /> GenBank. <br /> Polymerase  dùng  cho  PCR  là  Takara  Taq  HS <br /> (Takara,  Nhật  Bản).  Chương  trình  luân  nhiệt <br /> thực  hiện  trên  máy  GeneAmp  PCR  System <br /> 2720  (Applied  Biosystems,  Mỹ)  trong  45  chu <br /> kỳ với nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Sản phẩm PCR <br /> dài  1073  bp  được  phát  hiện  bằng  điện  di  trên <br /> thạch  agarose  1,2%  có  nhuộm  ethidium <br /> bromide,  tinh  sạch  bằng  QIAquick  Gel <br /> extraction kit (Qiagen, Mỹ). <br /> Giải trình tự chuỗi DNA <br /> Thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  các <br /> sản phẩm PCR đã được tinh sạch, theo hai chiều <br /> xuôi  và  ngược  với  BigDye  Terminator  v3.1 <br /> (Applied  Biosystems,  Mỹ).  Sản  phẩm  sau  đó <br /> được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di <br /> formamide, biến tính ở 960C trong 2 phút trước <br /> khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc <br /> bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7 <br /> polymer  và  capillary  50  cm  (Applied <br /> Biosystems,  Mỹ).  Kết  quả  được  phân  tích  bằng <br /> phần mềm SeqScape. <br /> <br /> 233<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> KẾT QUẢ <br /> Để có thể khảo sát được các đột biến của gen <br /> FLT3, trước tiên chúng tôi chọn khuếch đại vùng <br /> mã  hóa  protein  có  chứa  các  exon  từ  14  đến  20. <br /> Hình 1 cho thấy sản phẩm PCR tương  ứng  với <br /> kích thước mong đợi là 1073 bp. Sản phẩm PCR <br /> khi  được  giải  trình  tự  đã  cho  kết  quả  phù  hợp <br /> với  gen  FLT3  mang  mã  số  NM_004119  trong <br /> GenBank. Việc khuếch đại thành công vùng gen <br /> này  cho  phép  nhận  diện  hầu  hết  các  kiểu  đột <br /> biến điểm, mất đoạn hay chèn đoạn  có  thể  xảy <br /> ra trên gen FLT3. <br /> <br />  <br /> Hình 1: Khuếch đại vùng gen FLT3 chứa exon 14 – 20. <br /> Kết quả giải trình tự DNA trên 18 bệnh được <br /> trình  bày  trong  Bảng  1.  Có  9  bệnh  nhân  mang <br /> đột  biến  gen  FLT3,  gồm  6  đột  biến  nhân  đoạn <br /> nội tại của exon 14 và 3 đột biến điểm trên exon <br /> 16 và 20 (Hình 2). <br /> <br />  <br /> Hình 2: Hình ảnh các kiểu đột biến  <br /> Bảng 1: Tình trạng đột biến gen FLT3 trong các mẫu nghiên cứu  <br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> <br /> 234<br /> <br /> Mã số nghiên cứu<br /> AML-02<br /> AML-08<br /> AML-22<br /> AML-23<br /> AML-44<br /> AML-46<br /> AML-47<br /> AML-49<br /> AML-51<br /> AML-52<br /> AML-57<br /> <br /> Giới tính<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Nữ<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> <br /> Tuổi<br /> 46<br /> 10<br /> 7<br /> 37<br /> 2<br /> 34<br /> 17<br /> 35<br /> 23<br /> 14<br /> 65<br /> <br /> Exon bị đột biến<br /> 14<br /> <br /> 20<br /> 14<br /> 14<br /> 16<br /> <br /> Kiểu đột biến<br /> Không đột biến<br /> p.E611_F612ins13<br /> Không đột biến<br /> Không đột biến<br /> p.D835H<br /> p.W603_E604ins8<br /> Không đột biến<br /> p.Y597_E598ins28<br /> Không đột biến<br /> p.N676K<br /> Không đột biến<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> STT<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> 16<br /> 17<br /> 18<br /> <br /> Mã số nghiên cứu<br /> AML-61<br /> AML-78<br /> AML-79<br /> AML-93<br /> AML-94<br /> AML-95<br /> AML-104<br /> <br /> Giới tính<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> Nam<br /> <br /> Tuổi<br /> 41<br /> 53<br /> 68<br /> 4<br /> 11<br /> 54<br /> 52<br /> <br /> BÀN LUẬN <br /> Các đột biến gen FLT3 vừa có ý nghĩa tiên <br /> lượng,  vừa  là  đích  nhắm  phân  tử  hứa  hẹn <br /> trong  nghiên  cứu  điều  trị  BCCDT(3,9).  Nghiên <br /> cứu này đã thành công trong việc xác lập quy <br /> trình hoàn chỉnh để có thể xác định tình trạng <br /> có  hay  không  có  đột  biến  gen  FLT3  cho  bệnh <br /> nhân  BCCDT  tại  Bệnh  viện  Truyền  Máu  – <br /> Huyết  Học  Thành  phố  Hồ  Chí  Minh.  Kết  quả <br /> ban  đầu  theo  dõi  bệnh  nhân  cho  thấy  tình <br /> trạng  có  đột  biến  gen  FLT3  phù  hợp  với  tiên <br /> lượng  xấu.  Bệnh  nhân  có  mã  số  AML‐08,  với <br /> kiểu  đột  biến  p.E611_F612ins13  của  exon  14, <br /> không  đạt  được  lui  bệnh  sau  đợt  điều  trị  tấn <br /> công và đã tử vong. Trong tương lai, việc phát <br /> hiện đột biến FLT3 bằng kỹ thuật giải trình tự <br /> sẽ  giúp  chọn  giải  pháp  ghép  tủy  cho  những <br /> trường  hợp  tiên  lượng  xấu  đã  đạt  được  lui <br /> bệnh sau giai đoạn điều trị tấn công. Việc xác <br /> định  được  tình  trạng  đột  biến  của  gen  FLT3 <br /> cũng cho phép chúng ta có thể chọn bệnh nhân <br /> phù hợp tham gia các nghiên cứu thử nghiệm <br /> lâm sàng quốc tế với các thuốc mới nhắm đến <br /> FLT3 trong BCCDT. <br /> Kỹ thuật giải trình tự DNA trong nghiên cứu <br /> này  cho  phép  khảo  sát  không  chỉ  riêng  rẽ  các <br /> exon  14,  15  và  20  mà  toàn  bộ  vùng  mã  hóa <br /> protein  từ  exon  14  đến  20,  tránh  bỏ  sót  một  số <br /> đột  biến  mới.  Bước  đầu  khảo  sát  trên  18  bệnh <br /> nhân,  chúng  tôi  phát  hiện  đột  biến  gen  FLT3 <br /> trong  50%  số  trường  hợp,  so  với  44%  trong <br /> nghiên  cứu  của  Schlenk  và  cộng  sự  thực  hiện <br /> trên  438  bệnh  nhân(6).  Hơn  nữa,  chúng  tôi  phát <br /> hiện  một  trường  hợp  bệnh  nhân  có  mang  đột <br /> biến  điểm  của  exon  16  (p.N676K),  là  đột  biến <br /> gần  đây  được  báo  cáo  trong  nghiên  cứu  của <br /> Opatz  và  cộng  sự  khi  sử  dụng  hệ  thống  giải <br /> <br /> Huyết Học<br /> <br /> Exon bị đột biến<br /> 14<br /> 14<br /> 20<br /> <br /> 14<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Kiểu đột biến<br /> Không đột biến<br /> p.V592_D593ins11<br /> p.Y597_E598ins8<br /> p.D835E<br /> Không đột biến<br /> Không đột biến<br /> p.F612_G613ins25<br /> <br /> trình tự thế hệ mới để tìm đột biến trên toàn bộ <br /> các  exon  trong  bộ  gen(4).  Kết  quả  cho  thấy  quy <br /> trình  kỹ  thuật  của  chúng  tôi  trong  nghiên  cứu <br /> này  đáng  tin  cậy,  có  thể  ứng  dụng  để  khảo  sát <br /> thêm  với  số  mẫu  lớn  hơn  nhằm  xác  định  được <br /> tần suất và phổ đột biến của gen FLT3 trên bệnh <br /> nhân  Việt  nam.  Ngoài  ra,  cũng  cần  lưu  ý  rằng, <br /> ngoài đột biến gen FLT3 thì bệnh nhân BCCDT <br /> với  bộ  nhiễm  sắc  thể  bình  thường  còn  có  thể <br /> mang  các  đột  biến  gen  khác  cũng  ảnh  hưởng <br /> đến  tiên  lượng  bệnh,  như  gen  NPM1  và <br /> CEPBA(2,6). Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp <br /> tục  triển  khai  nghiên  cứu  đột  biến  các  gen  này <br /> để có đầy đủ cơ sở phân nhóm tiên lượng chính <br /> xác hơn cho bệnh nhân BCCDT. <br /> <br /> KẾT LUẬN  <br /> Chúng  tôi  đã  thành  công  trong  việc  xây <br /> dựng quy trình giải trình tự chuỗi DNA để xác <br /> định  đột  biến  gen  FLT3,  giúp  tiên  lượng  bệnh <br /> nhân BCCDT. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào <br /> lâm sàng có thể cải thiện hiệu quả điều trị trong <br /> thời gian tới. <br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO <br /> 1.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Breitenbuecher F, Schnittger S, Grundler R, Markova B, Carius <br /> B, Brecht A, Duyster J, Haferlach T, Huber C, Fischer T (2009). <br /> Identification  of  a  novel  type  of  ITD  mutations  located  in <br /> nonjuxtamembrane  domains  of  the  FLT3  tyrosine  kinase <br /> receptor. Blood 23;113(17):4074‐7. <br /> Fasan A, Haferlach C, Alpermann T (2013). The role of different <br /> genetic  subtypes  of  CEBPA  mutated  AML.  Leukemia  doi: <br /> 10.1038/leu.2013.273. <br /> Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD (2004). Cytogenetics in <br /> acute leukemia. Blood Rev;18(2):115‐36. <br /> Opatz  S,  Polzer  H,  Herold  T,  Konstandin  NP  (2013).  Exome <br /> sequencing identifies recurring FLT3 N676K mutations in core‐<br /> binding factor leukemia. Blood;122(10):1761‐9. <br /> Renneville  A,  Roumier  C,  Biggio  V,  Nibourel  O,  Boissel  N, <br /> Fenaux P, Preudhomme C (2008). Cooperating gene mutations <br /> in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia; <br /> 22(5): 915‐31. <br /> <br /> 235<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, Fröhling S (2008). Mutations <br /> and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid <br /> leukemia. N Engl J Med; 358(18):1909‐18. <br /> Stirewalt  DL,  Radich  JP  (2003).  The  role  of  FLT3  in <br /> haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer;3(9):650‐65. <br /> Su  L,  Gao  SJ,  Li  W,  Tan  YH,  Cui  JW,  Hu  RP  (2013).  NPM1, <br /> FLT3‐ITD, CEBPA, and c‐kit mutations in 312 Chinese patients <br /> with de novo acute myeloid leukemia. Hematology 2013 Oct 25 <br /> [Epub ahead of print]. <br /> Swords  R,  Freeman  C,  Giles  F  (2012).  Targeting  the  FMS‐like <br /> tyrosine  kinase  3  in  acute  myeloid  leukemia. <br /> Leukemia;26(10):2176‐85. <br />  <br /> <br /> 236<br /> <br /> 10. Testa U, Pelosi E (2013). The Impact of FLT3 Mutations on the <br /> Development  of  Acute  Myeloid  Leukemias.  Leuk  Res <br /> Treatment 2013:275760. <br /> <br />  <br /> Ngày nhận bài báo:  <br /> <br />  <br /> <br />  <br /> <br /> 01/11/2013 <br /> <br /> Ngày phản biện nhận xét bài báo:  <br /> <br /> 30/11/2013 <br /> <br /> Ngày bài báo được đăng:  <br /> <br /> 05/01/2014 <br /> <br />  <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br />