Đột biến gen matrix metalloprotease 9 ở bệnh nhân bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> ĐỘT BIẾN GEN MATRIX METALLOPROTEASE 9<br /> Ở BỆNH NHÂN BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH<br /> Lê Thị Huyền Trang *, Thái Thị Thùy Linh **, Lê Thị Tuyết Lan ***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xác định đột biến ở promoter C-1562T của gen MMP9 (matrix metalloprotease 9) ở bệnh nhân<br /> bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính khám tại phòng khám hô hấp- BV Đại Học Y Dược TPHCM.<br /> Phương pháp: Xác định kiểu gen MMP-9 (C-1562T) của 100 bệnh nhân BPTNMT theo phương pháp giải<br /> trình tự gen (RFLP). Nghiên cứu phân tích mô tả thực hiện tại phòng khám ĐHYD TPHCM ở những bệnh<br /> nhân BPTNMT đã được chẩn đoán bằng hô hấp ký. Bệnh nhân được lấy máu và phân tích giản trình tự gen tại<br /> phòng thí nghiệm của ĐH Shiga Nhật Bản.<br /> Kết quả: Tỉ lệ bệnh nhân BPTNMT có T allen (C/T hay T/T) là 23%, bệnh nhân kiểu gen C/C là 77%.<br /> Phân độ nặng của BPTNMT theo GOLD giai đoạn I, II, III, IV tương ứng là 8 trường hợp (8%), 37 (37%), 48<br /> (48%), 7 (7%). Tỉ lệ đột biến gen MMP 9 của dân số nghiên cứu cũng tương tự một số nghiên cứu của Nhật và<br /> Trung Quốc. Trong số 23 bệnh nhân BPTNMT có T allen, giai đoạn I là 13% , giai đoạn II là 30,4% ,giai đoạn<br /> III là 47,8%, giai đoạn IV là 8,7% . Tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm có và không có T allen<br /> về mức độ nặng của BPTNMT.<br /> Kết luận: Phát hiện có đột biến gen MMP9 ở bệnh nhân BPTNMT ở Việt Nam và tỉ lệ cũng tương tự như<br /> các nghiên cứu của Nhật và Trung quốc.<br /> Từ khóa: Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (BPTNMT), chức năng hô<br /> hấp (CNHH).<br /> <br /> ABSTRACT<br /> MATRIX METALLOPROTEINASE-9 PROMOTER POLYMORPHISM IN CHRONIC OBSTRUCTIVE<br /> PULMONARY DISEASE<br /> Le Thi Huyen Trang, Thai Thi Thuy Linh, Le Thi Tuyet Lan<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 1 – 2012: 54 - 57<br /> Background: There are many genes for chronic obstructive disease (COPD). Matrix metalloproteinase 9<br /> (MMP-9) has proteolytic activity against connective tissue proteins and has an important role in the development<br /> of COPD. In this study, we investigated the correlation between MMP-9 with COPD in Vietnamese population.<br /> Objectives: Frequency of MMP-9 in Vietnamese COPD patients.<br /> Method: MMP-9 (C-1562T) genotype of 100 vietnamese COPD patients were determined by the restriction<br /> fragment length polymorphism method. This is a cross – sectional, descriptive study, realized in HCM. We<br /> collected COPD patients from stage I to stage IV diagnosed by spirometry. Blood sample of these patients were<br /> freezen and the gene analysis was done in laboratory of Shiga university.<br /> Results: Among patients with COPD with T allele (C/T or T/T) are 23%, patients with COPD with C/C<br /> are 77% . To evaluate the severity of COPD, pulmonary function tests showed that in stage I, II, III and IV, the<br /> * Bộ môn Nội - Đại Học Y Dược TPHCM<br /> ** Bệnh Viện Triều An<br /> *** Bộ môn Sinh Lý - Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Lê Thị Huyền Trang<br /> ĐT: 0913 60 22 70,<br /> Email: tranghieu2001@yahoo.com<br /> <br /> 54<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> number of cases (percentage) respectively are 8(8%), 37 (37%), 48 (48%), 7 (7%). The genotype frequencies in<br /> Vietnamese COPD patients are similar to Chinese and Japanese population. Among 23 patients with T allele,<br /> patients in stage I is 13% (3 pts), stage II is 30.4% (7pts), stage III is 47.8% (11pts), stage IV is 8.7% (2pts).<br /> There was no significant difference between T allele patients with the severity of COPD.<br /> Conclusion: The genetic polymorphism in promoter of MMP-9 is associated with COPD in Vietnamese<br /> polulation.<br /> Keywords: Matrix metalloproteinase 9(MMP-9), chronic respiratory obstructive disease (COPD), lung<br /> function.<br /> làm tăng hoạt tính promoter của gen MMP9.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đột biến ở<br /> Trong những năm gần đây, bệnh phổi tắc<br /> polymorphysm này gây ra bệnh xơ vữa động<br /> nghẽn mạn tính (BPTNMT) ngày càng được<br /> mạch. Hiện nay người ta bắt đầu nghiên cứu vai<br /> quan tâm vì tần suất mắc bệnh và tử vong ngày<br /> trò của đột biến này trên BPTNMT và cho thấy<br /> càng tăng cao . Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có<br /> có liên quan. Minematsu và cộng sự nghiên cứu<br /> khoảng 600 triệu người bị BPTNMT trên toàn<br /> trên dân số Nhật thấy những bệnh nhân có đột<br /> cầu và 2,75 triệu người tử vong trong năm<br /> biến T allen thì bị khí phế thủng nặng hơn ở<br /> 2004(1). Tử vong do BPTNMT được xếp hàng thứ<br /> bệnh nhân không có T allen(5). Zhou và cộng sự<br /> 6 vào năm 1990 sẽ vượt lên hàng thứ 3 năm<br /> nghiên cứu trên dân số Trung Quốc thấy đột<br /> 2020. Nghiêm trọng hơn, trong khi tần suất các<br /> biến C-1562T thường gặp ở bệnh nhân<br /> bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay như bệnh<br /> BPTNMT(8).<br /> mạch vành, tai biến mạch máu nảo và các<br /> Nước ta là nơi có tỉ lệ BPTNMT cao nên<br /> nguyên nhân khác có khuynh hướng giảm<br /> chúng tôi muốn tiến hành tìm hiểu mối quan hệ<br /> xuống thì tần suất BPTNMT lại gia tăng đến<br /> giữa đột biến này liên quan thế nào với<br /> 163% .Theo tính toán của Hội Hô Hấp Châu ÁBPTNMT. Đó là lý do thực hiện đề tài này.<br /> Thái Bình Dương, tỉ lệ BPTNMT ở Việt Nam là<br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> 6,7%, cao nhất trong 12 nước ở vùng này(3).<br /> BPTNMT giai đoạn tiến triển sẽ làm người bệnh<br /> Xác định đột biến ở promoter C-1562T của<br /> tàn phế nặng nề, chất lượng cuộc sống bị sụt<br /> gen MMP9 (matrix metalloprotease 9) ở bệnh<br /> giảm nghiêm trọng(2).<br /> nhân bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính khám tại<br /> phòng khám hô hấp- BV Đại Học Y Dược<br /> Hút thuốc lá là nguyên nhân quan trọng dẫn<br /> TPHCM.<br /> đến BPTNMT, tuy nhiên theo thống kê chỉ có<br /> khoảng 15-20% là hút thuốc lá gây ra BPTNMT<br /> với sự giảm FEV1 nhanh chóng. Có nhiều<br /> nghiên cứu cho thấy có yếu tố gia đình cũng<br /> gây ra bệnh BPTNMT. Điều này cho thấy có vai<br /> trò của kiểu gen trong sự nhạy cảm cùa từng<br /> người đối với BPTNMT. Một trong những gen<br /> có vai trò đối với BPTNMT là MMP9 (matrix<br /> metalloprotease 9) còn gọi là gelatinase B. Đây là<br /> gen ảnh hưởng đến sự cân bằng proteaseantiprotease (1-3), có vai trò trong việc hình<br /> thành khí phế thủng do làm mất các chất ngoại<br /> bào như gelatine, collagen, elastin(4). Đây là gen<br /> nằm trên NST 20 và trong những đột biến ở<br /> vùng gen điều hòa thì C-1562T polymorphysm<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> <br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Phân tích mô tả.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Bn BPTNMT khám tại phòng khám hô hấp<br /> BV ĐHYD đồng ý tham gia nghiên cứu.<br /> <br /> Tiến hành<br /> - Chọn 100 bn BPTNMT chẩn đoán theo tiêu<br /> chuẩn GOLD, phân tích cuối cùng là 99 bệnh<br /> nhân.<br /> - Ký cam kết đồng ý tham gia nghiên cứu.<br /> <br /> 55<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> - Tiến hành khám bệnh hoàn tất hồ sơ theo<br /> mẫu, đo HHK.<br /> <br /> Phân bậc khó thở theo MRC thì đa số bệnh<br /> nhân khó thở độ II (43,2%).<br /> <br /> - Lấy máu tĩnh mạch 1,5ml trữ đông ở nhiệt<br /> độ -200º C. Khi lấy đủ mẫu thì gửi mẫu máu qua<br /> phòng thí nghiệm của đại học Shiga- Nhật phân<br /> tích.<br /> <br /> Chức năng hô hấp<br /> <br /> - Máu được trich lấy AND theo phương<br /> pháp QIAGEN.<br /> - Đo nồng độ AND.<br /> - Khuyếch đại AND bằng phương pháp<br /> PCR.<br /> <br /> Tất cả bệnh nhân COPD đến khám có 97/99<br /> bệnh nhân được chẩn đoán xác định bằng hô<br /> hấp ký và các thông số trung bình như sau.<br /> <br /> Tỉ lệ giai đoạn BPTNMT<br /> Trong đó giai đoạn II chiếm tỉ lệ cao nhất là<br /> 46,4%. Phát hiện được cả bệnh nhân BPTNMT<br /> giai đoạn rất sớm.<br /> <br /> - Dùng men SphI để cắt polymorphism.<br /> - Chạy trên agarose 3% với ethidium<br /> bromide và quan sát dưới tia cực tím để xác<br /> định kiểu gen.<br /> Ghi nhận kiểu gen của 99 bn BPTNMT và xử<br /> lý thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0.<br /> <br /> KẾT QUẢ-BÀN LUẬN<br /> Đặc điểm dân số nghiên cứu<br /> Kiểu gen MMP9 ở BPTNMT<br /> <br /> 20<br /> <br /> Sau khi phân tích kiểu gen MMP 9 với đột<br /> biến C-1562T ta ghi nhận tỉ lệ kiểu gen TT (2%)<br /> CT (21,2%) và CC (76,8%). Tỉ lệ này của dân số<br /> Việt nam cũng tương tự như một số nghiên cứu<br /> của tác giả Nhật và tác giả Trung Quốc.<br /> <br /> 10<br /> <br /> Std. Dev = 10.05<br /> Mean = 67.3<br /> <br /> Kiểu gen<br /> Trang<br /> CC<br /> 76 (76%)<br /> CT<br /> 21(21%)<br /> TT<br /> 2 (2%)<br /> <br /> Ito (Nhật)<br /> 63 (75%)<br /> 19 (23%)<br /> 2 (2%)<br /> <br /> Zhou (Trung quốc)<br /> 86%<br /> 14%<br /> 2%<br /> <br /> N = 98.00<br /> <br /> 0<br /> 45.0<br /> <br /> 50.0<br /> <br /> 55.0 60.0<br /> <br /> 65.0<br /> <br /> 70.0<br /> <br /> 75.0 80.0<br /> <br /> 85.0<br /> <br /> 90.0<br /> <br /> AGE<br /> <br /> Giới nam / nữ : 95/4 bệnh nhân<br /> Tuổi trung bình: 67,2 ± 10,05<br /> Tỉ lệ hút thuốc lá khá cao là 90,9% (90/99<br /> bệnh nhân). Số gói năm trung bình là 33,9<br /> Chỉ số khối cơ thể trung bình là 22,19 ± 3,4.<br /> <br /> Triệu chứng cơ năng<br /> Triệu chứng cơ năng thường gặp của bệnh<br /> nhân COPD đến khám là: khó thở (96%), ho<br /> khạc đàm (90%) và khò khè (80%).<br /> <br /> 56<br /> <br /> Đây là hình ảnh ghi nhận sau khi dùng<br /> enzyme SphI để cắt polymorphism ở vị trí 1562<br /> để xác định là C hay T allen để xác định kiểu<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012<br /> gen. Kiểu gen CC là 1,2,3,4. Kiểu gen CT là 5,6,7,<br /> 8. Kiểu gen TT là 9,10.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> sớm cũng như chưa phát triển mạnh về cơ chế<br /> sinh bệnh hay khoa học cơ bản.Các bệnh lý<br /> quan trọng hiện đang phát triển nghiên cứu rất<br /> nhiều về cơ chế sinh bệnh, phòng ngừa bệnh ở<br /> mức độ sinh học phân tử.<br /> Đây là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng sinh<br /> học phân tử trên bệnh nhân BPTNMT Mặc dù 1<br /> phần được tiến hành ở Nhật nhưng cũng cho<br /> chúng ta có cái nhìn chung về mối liên hệ của<br /> kiểu gen MMP9 trên bệnh nhân BPTNMT và<br /> việc có thể áp dụng sinh học phân tử trong<br /> nghiên cứu bệnh BPTNMT.<br /> <br /> Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> giữa hai nhóm bệnh nhân có T allen hay không<br /> có T allen.<br /> Nam/nữ<br /> Tuổi trung bình<br /> Hút thuốc lá<br /> BMI<br /> FVC (%)<br /> FEV1(%)<br /> FEV1/FVC(%)<br /> PEF(%)<br /> FEF 25-75(%)<br /> TLC (%)<br /> <br /> Bn T (-)<br /> 74/2<br /> 67,12±10,5<br /> 33,9±17,2<br /> 22,4±3,3<br /> 80,6±16,25<br /> 51,61±18,1<br /> 44,7±11,5<br /> 52,12±20<br /> 19,6±10,1<br /> 127±39,5<br /> <br /> Bn T(+)<br /> 21/2<br /> 67,7±8<br /> 33,8±17,7<br /> 21,3±3,6<br /> 78,8±12,7<br /> 53,9±20,3<br /> 46,5±11,9<br /> 55,5±19,2<br /> 21,8±14,3<br /> 118,7±21,9<br /> <br /> p<br /> <br /> 0,92<br /> 0,88<br /> 0,61<br /> 0,72<br /> 0,6<br /> 0,55<br /> <br /> Trong cả hai nhóm bệnh nhân có T allen và<br /> không có T allen thì tỉ lệ BTNMT chủ yếu là giai<br /> đoạn III. Không có sự khác biệt rõ rệt về độ<br /> nặng của BPTNMT ở hai nhóm.<br /> GĐI<br /> GĐII<br /> GĐIII<br /> GĐIV<br /> <br /> T(-)<br /> 6,6%<br /> 40,8%<br /> 44,7%<br /> 7,9%<br /> <br /> T(+)<br /> 13%<br /> 30,4%<br /> 47,8%<br /> 8,7%<br /> <br /> KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ<br /> Phát hiện có đột biến gen MMP9 ở bệnh<br /> nhân BPTNMT ở Việt Nam và tỉ lệ cũng tương<br /> tự như các nghiên cứu của Nhật và Trung quốc.<br /> Hiện nay, sinh học phân tử áp dụng rộng rãi<br /> trên thế giới trong nghiên cứu cơ chế bệnh sinh,<br /> điều trị phòng ngừa bệnh. Chúng ta thì chỉ phát<br /> triển mạnh về lâm sang và điều trị bệnh ở giai<br /> đoạn nặng, ít khi can thiệp được ở giai đoạn<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa II<br /> <br /> Hiện tại chúng ta cũng có kỹ thuật PCR và<br /> kiểu gen nên với nghiên cứu này chúng tôi hy<br /> vọng có thể sớm triển khai được ứng dụng sinh<br /> học phân tử trong nghiên cứu 1 số bệnh quan<br /> trọng như: ung thư, bệnh mạch vành,<br /> BPTNMT…<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> Atkinson JJ, Senior RM (2003). Matris metalloprotease-9 in lung<br /> remodeling. Am J Respir Cell Mol Biol; 28, pp. 12-24.<br /> Betsuyaku T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M et al (1999).<br /> Neutrophil granule proteins in bron choalveolar lavage fluid<br /> from subjects with subclinical emphysema. Am J Respir Crit Care<br /> Med; 159, pp. 1985-1991.<br /> Lim S, Roche N, Olivier BG et al (2000). Balance of matrix<br /> metalloprotease-9 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 from<br /> alveolar macrophage in cigarette smokers: regulation by<br /> interleukin -10. Am J Respir Crit Care Med; 162, pp. 1355-1360.<br /> Mao JT, Tashkin DP, Belloni PN, Baratelli F, Roth MD (2003). All<br /> trans retinoic acid modulates the balance of matrix<br /> metalloprotease-9 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 in<br /> patients with emphysema. Chest; 124, pp. 1724-1732.<br /> Minnematsu N, Nakamura H, Tateno H et al (2001). Genetic<br /> polymorphism in matrix metalloproteinase -9 and pulmonary<br /> emphysema. Biochem Biophys Res Commun; 289, pp. 116-119.<br /> Ohnishi K, Takagi M, Kurokawa Y, Satomi S, Konttinen YT<br /> (1998). Matrix metalloprotease medicated extracenllular matrix<br /> protein degradation in human pulmonary emphysema. Lab<br /> Invest; 78, pp. 1077-1087.<br /> Russell RE, Culpitt SV, Dematos C, Donnelly L et al (2002).<br /> Release and activity of matrix metalloprotease-9 and tissue<br /> inhibitor of metalloprotease-1 by alveolar macrophage from<br /> patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir<br /> Cell Mol Biol; 26, pp. 602-609.<br /> Zhang B, Ye S, Herrmann SM, Eriksson P et al (1999). Functional<br /> polymorphism in regulatory region of gelatinase B gene in<br /> relation to severity of coronary atherosclerosis. Circulation; 99,<br /> pp. 1788-1794.<br /> <br /> 57<br /> <br />