Dự án tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dược liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (ThunB.) haraldson) tại Việt Nam

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:23

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phát triển và xây dựng các phương pháp định lượng một số thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam. Đánh giá hàm lượng các thành phần hóa học chính trong các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng tại các vùng khác nhau ở Việt Nam và một số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ trên thị trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự án tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân tích và đánh giá một số thành phần hóa học chính trong dược liệu và sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (ThunB.) haraldson) tại Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HÀ LY NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHÍNH TRONG DƢỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM CHỨA HÀ THỦ Ô ĐỎ (FALLOPIA MULTIFLORA (THUNB.) HARALDSON) TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: Hóa Phân tích MÃ SỐ: 62440118 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Khoa Hoá Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Tạ Thị Thảo 2. PGS. TS. Phương Thiện Thương Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận Án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm Luận án tiến sĩ họp tại. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vào hồi…… giờ…… ngày……. Tháng…… năm 20... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của Luận án Hà thủ ô đỏ là một trong những vị thuốc quí của Việt Nam. Theo Y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có nhiều tác dụng quý như bổ huyết, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng. Y học hiện đại còn chứng minh Hà thủ ô đỏ có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu, có tác dụng tốt đối với các trường hợp suy nhược thần kinh và bệnh về thần kinh, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột, có tác dụng chống viêm. Do đó, Hà thủ ô đỏ được sử dụng rộng rãi để làm thuốc phục vụ đời sống con người từ xưa đến nay. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường, vị thuốc quý này đang bị giả mạo bằng một số loại rễ củ như: Hà thủ ô trắng, Củ nâu, Củ cọc... hoặc tình trạng người sử dụng mua phải dược liệu “rác” đã bị chiết hết các hoạt chất, gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người bệnh và quyền lợi người tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên cứu đánh giá chất lượng và tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ là vấn đề hết sức cần thiết. Ở Việt Nam, chuyên luận Hà thủ ô đỏ trong Dược Điển Việt Nam V (2018) quy định hàm lượng chất chiết được trong etanol 30% và hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo emodin và physicon). Qua khảo sát một số mẫu cho kết quả hầu hết các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam đều không đạt theo yêu cầu của DĐVN V, nguyên nhân có thể do chất lượng thực của mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam kém, hoặc do chỉ tiêu quy định và phương pháp đánh giá trong DĐVN V chưa phù hợp. Vì vậy, cần thiết thực hiện nghiên cứu về phân tích thành phần hóa học trên đối tượng Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, từ đó xây dựng được tiêu chí định lượng phù hợp đối với dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng tại Việt Nam, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ ở Việt Nam chặt chẽ hơn. 2. Mục tiêu chính của Luận án - Nghiên cứu phát triển và xây dựng các phương pháp định lượng một số thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam. - Đánh giá hàm lượng các thành phần hóa học chính trong các mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ trồng tại các vùng khác nhau ở Việt Nam và một số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ trên thị trường. 3. Nội dung nghiên cứu: - Phát triển phương pháp HPLC-UV phân tích định lượng 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, emodin và physcion trong dược liệu Hà thủ ô đỏ thành phương pháp chuẩn tham chiếu (sử dụng phổ MS/MS đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp). - Xây dựng mới phương pháp phân tích định lượng thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng một số kỹ thuật sắc ký: TLC- scanner Densitometry, HPLC-FLD (có so sánh với phương pháp chuẩn tham chiếu). - Phân tích đánh giá hàm lượng hoạt chất trong các mẫu dược liệu và một số sản phẩm chứa Hà thủ ô đỏ trên thị trường. 1
- Sơ bộ phân loại nguồn gốc mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học kết hợp các phương pháp thống kê. 4. Những đóng góp mới của Luận án - Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng phương pháp TLC- scanner Densitometry phân tích định lượng THSG, emodin (EM) và physcion (PS) trong Hà thủ ô đỏ. - Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng phương pháp và HPLC- FLD phân tích định lượng 5 chất 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid (THSG), resveratrol (RES), piceid (PC), emodin (EM) và physcion (PS) trong Hà thủ ô đỏ. - Nghiên cứu đã bước đầu phân loại được nguồn gốc dược liệu Hà thủ ô đỏ dựa trên thành phần hoá học. 5. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 4 chương, 59 bảng, 22 hình, 7 sơ đồ cùng các phụ lục, 85 tài liệu tham khảo. Luận án gồm 134 trang, gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (28 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Kết quả nghiên cứu và bàn luận (83 trang); Kết luận và Kiến nghị (3 trang). NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ 1.1.1. Cây Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm chướng (Caryophyllales). Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm, thân thảo, mềm và nhẵn, leo quấn vào cây khác. Bộ phận dùng chính là rễ củ của cây màu nâu, hình trụ tròn, hoặc có thể dùng thân lá (Dạ giao đằng). 1.1.2. Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopia multiflora) là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ. 1.1.3 Thành phần hóa học trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Hà thủ ô đỏ chứa khoảng 1,7% anthraquinon (emodin, chrysophanol, rhein, physcion,…); 1,1% protid, 45,2% tinh bột, 3,1% lipid, 4,5% chất vô cơ, 26,4% các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin), 2,3,5,4’- tetrahydroxytiben-2-O-β-D-glucosid (THSG). Hàm lượng các hoạt chất thay đổi rõ rệt sau khi chế biến. Lúc chưa chế, HTO chứa 7,68% tanin, 0,25% dẫn chất anthraquinon tự do, 0,8058% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Sau khi chế, còn 3,82% tanin, 0,1127% dẫn chất anthraquinon tự do và 0,2496% dẫn chất anthraquinon toàn phần. Stilben và anthraquinon là hai nhóm chất đặc trưng cho Hà thủ ô đỏ, được các nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước quan tâm, đặc biệt là được Dược điển một số nước dùng làm chất đối chiếu trong kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ. 2
1.1.4 Công dụng của dược liệu Hà thủ ô đỏ Trong Y học cổ truyền, Hà thủ ô đỏ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính bình; có tác dụng bổ huyết giữ tinh, điều hoà khí huyết, bổ gan thận, mạnh gân xương, nhuận tràng. Trong y học hiện đại, Hà thủ ô đỏ có tác dụng giảm lượng đường trong máu, chống viêm, lợi tiểu, điều kinh, hạ sốt, kích thích tiêu hóa, làm tăng hoạt động của tim, làm tăng sự co bóp của ruột. 1.2. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thành phần hóa học trong Hà thủ ô đỏ 1.2.1. Các phƣơng pháp phân tích trong Dƣợc điển Một số Dược điển trên thế giới có qui định chuyên luận dược liệu Hà thủ ô đỏ như DĐTQ, DĐHK, DĐ Mỹ. Trong khi DĐTQ (2015) và DĐ Mỹ đều qui định sử dụng phương pháp HPLC-UV để định lượng THSG, anthraquinon dạng dẫn xuất trong các mẫu Hà thủ ô đỏ, thì DĐHK chỉ qui định hàm lượng THSG. Mức hàm lượng qui định đối với các chỉ tiêu này trong từng Dược điển cũng khác nhau. Ở Việt Nam, DĐVN V (2018), chuyên luận Hà thủ ô đỏ đã được bổ sung chỉ tiêu định lượng anthraquinon dạng kết hợp (tính theo EM, PS) bằng phương pháp HPLC-UV. 1.2.2. Các nghiên cứu khác xác định thành phần hóa học trong Hà thủ ô đỏ 1.2.2.1 HPLC-UV HPLC-UV là phương pháp phổ biến, được áp dụng nhiều nhất trong phân tích đánh giá chất lượng dược liệu nói chung, dược liệu Hà thủ ô đỏ nói riêng. Rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật này trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng và đánh giá chất lượng dược liệu Hà thủ ô đỏ. 1.2.2.2 HPLC-FLD HPLC-FLD có phạm vi ứng dụng hẹp hơn HPLC-UV bởi một số it chất có khả năng phát huỳnh quang. Với Hà thủ ô đỏ, cả 2 nhóm chất chính là anthraquinon và stilben đều có khả năng phát huỳnh quang. Tuy nhiên, trên thế giới cũng như tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng HPLC-FLD trong phân tích các hợp chất stilben trong đối tượng dược liệu Hà thủ ô đỏ. 1.2.2.3 LC-MS/MS LC-MS/MS là phương pháp phân tích có độ chính xác cao. Bên cạnh ý nghĩa trong phân tích định lượng, LC-MS/MS còn cung cấp các thông tin về dữ liệu phổ khối của các tín hiệu chất phân tích, từ đó đánh giá về độ tinh khiết pic và dự đoán được cấu trúc hóa học của một tín hiệu chất phân tích. Với đối tượng Hà thủ ô đỏ, có nhiều nghiên cứu áp dụng LC-MS/MS hoặc LC-MS về phân tích thành phần hóa học, đánh giá chất lượng dược liệu và phân tích xác định chất chỉ điểm trong đánh giá về nguồn gốc mẫu. 1.2.2.4 TLC-scanner Densitometry TLC là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều trong kiểm nghiệm dược liệu, được dùng trong các chỉ tiêu định tính và có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển các nước. Trên thế giới cũng như tại 3
Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng các hợp chất này trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng TLC-scanner. Một số nghiên cứu trên thế giới đã áp dụng kỹ thuật TLC-scanner trong định lượng anthraquinon nhưng trong các đối tượng khác. CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Dược liệu Hà thủ ô đỏ Dược liệu Hà thủ ô đỏ Radix Fallopia multiflora dùng cho các thí nghiệm khảo sát là mẫu dược liệu đối chiếu của Viện Dược liệu. Một số mẫu Hà thủ ô đỏ được thu hái ở các vùng khác nhau ở Việt Nam. Mẫu được lấy là bộ phận rễ củ của cây Hà thủ ô đỏ, rửa sạch, thái lát mỏng, phơi, sấy ở 60oC đến khô và bảo quản trong túi nilon kín. 2.1.2 Mẫu sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ Đối tượng sản phẩm đầu tiên được lựa chọn đánh giá chất lượng là Hà thủ ô đỏ chế. Ngoài ra, một số sản phẩm khác từ Hà thủ ô đỏ như sản phẩm viên nang Hà thủ ô của Công ty Cổ phần Dược phẩm TRAPHACO, kí hiệu là T-HTO-TPC và mẫu trà Hà thủ ô đỏ của Tuấn Anh, kí hiệu Trà-HTO-TA 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phát triển và xây dựng phương pháp phân tích định lượng Bước 1: Tối ưu hóa hệ thống phân tích sắc ký: tiến hành khảo sát các thông số: bước sóng, dung môi, chương trình rửa giải, nhiệt độ cột, thể tích mẫu tiêm,… Bước 2: Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích: - Tính chọn lọc, đặc hiệu và độ tinh khiết pic: trong nghiên cứu này sử dụng phổ MS để xác định độ tinh khiết pic - Xác định KTT, dựng đường chuẩn và đánh giá đường chuẩn: - Tính thích hợp của hệ thống - Độ lặp lại trong ngày và khác ngày - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp: - Độ đúng (hiệu suất thu hồi) - Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ). 2.2.2 Phương pháp xây dựng qui trình xử lý mẫu 2.2.2.1 Dung môi chiết xuất - MeOH, EtOH và hỗn hợp của chúng với nước (tỷ lệ từ 0%-100%). 2.2.2.2 Phương pháp chiết xuất - Chiết siêu âm và chiết hồi lưu 2.2.2.3 Nhiệt độ chiết 2.2.2.4 Tỷ lệ thể tích dung môi chiết/dược liệu: - Khoảng khảo sát từ 20/1 (ml/gam) đến 150/1 (ml/gam) 2.2.2.5 Thời gian chiết và số lần chiết - Khảo sát chiết 1 lần hoặc 2 lần với thời gian chiết khác nhau. 4
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu xác định hàm lƣợng một số thành phần hóa học chính có trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng HPLC-UV 3.1.1 Phát triển phương pháp HPLC-UV định lượng một số thành phần hóa học chính có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam 3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện tách trên hệ sắc ký HPLC  Khảo sát bước sóng phân tích định lượng Quét phổ UV-VIS của các dung dịch chuẩn THSG, EM và PS. Từ đó xác định được các giá trị λmax và Abs tương ứng với từng λmax của mỗi chất. Tính toán được hệ số ԑ (hay logԑ). Kết hợp một số tài liệu, lựa chọn bước sóng 320 nm để định lượng THSG và 254 nn để định lượng EM, PS.  Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải Khảo sát một số loại pha động gồm: MeOH/nước, ACN/nước, ACN/axit formic 0,5% với các chương trình rửa giải khác nhau. Từ kết quả thu được, lựa chọn hệ dung môi rửa giải là ACN và axit formic 0,5%, với 2 chương trình dung môi rửa giải khác nhau để phân tích riêng đối với THSG, EM và PS: + Đối với EM và PS, sử dụng chương trình rửa giải gồm ACN/axit formic 0,5% (80/20, v/v), tốc độ rửa giải là 1 ml/phút. + Đối với THSG, sử dụng chương trình rửa giải như Bảng 3.1, tốc độ rửa giải 1 ml/phút. Bảng 3.1. Chương trình dung môi rửa giải Thời gian (phút) ACN Axit formic 0,5% 0-22 16 84 22-45 16-34 84-66 45-60 34-38 66-62 60 Stop Stop  Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động, loại axit dùng trong pha động Tiến hành khảo sát 3 loại axit khác nhau: axit axetic, axit photphoric và axit formic. Kết quả thu được cho thấy axit formic với pH=3 cho kết quả thu được đối với 3 tín hiệu pic phân tích THSG, EM và PS đạt tốt nhất. Kiếm tra dung dịch axit formic có pH=3, tương ứng với nồng độ axit formic là 0,5%.  Khảo sát nhiệt độ lò cột Nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả tách sắc ký trên cột. Từ đó, lựa chọn được nhiệt độ lò cột cho quá trình phân tích sắc ký là nhiệt độ phòng (khoảng 250C-350C).  Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cột Thể tích mẫu tiêm vào cột ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả phân tích. Nếu lượng mẫu tiêm vào cột lớn hơn 20 μl thì pic của THSG, EM và PS không đối xứng tốt dẫn đến sai số. Vì vậy lựa chọn thể tích mẫu tiêm vào cột là 10 μl. Từ các kết quả khảo sát trên, lựa chọn được điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích các thành phần THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ. 5
 Điều kiện HPLC-UV tối ưu phân tích THSG: + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Detector UV: 320 nm + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% + Chương trình rửa giải: 0-22 phút (16%ACN); 22-45 phút (16-34%ACN); 45-60 (34-38%ACN).  Điều kiện HPLC-UV tối ưu phân tích EM và PS: + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Detector UV: 254 nm + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (250C-350C) + Thể tích mẫu tiêm vào cột: 10 µl + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5%, tỷ lệ 80 – 20 (v/v). a B Hình 3.1. SKĐ HPLC-UV phân tích THSG, EM và PS tối ưu (a-phân tích THSG: 1-THSG; 2,3-các mẫu Hà thủ ô đỏ; b-phân tích EM và PS: 1-PS; 2-EM; 3-Hà thủ ô đỏ) 3.1.1.2 Xây dựng các phương trình đường chuẩn Các giá trị Pvalue thu được đều lớn hơn 0,05, chứng phương pháp xây dựng được không mắc sai số hệ thống (cả sai số hệ thống biến đổi và sai số hệ thống không đổi). Từ đó, xác định CDL và CDQ của đường chuẩn. Bảng 3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn THSG, EM và PS bằng phương pháp HPLC-UV THSG EM PS Khoảng tuyến 0,015-0,24 mg/ml 15,6-700 µg/ml 43,8-700 µg/ml tính Phương trình y = 10^8.x - y= 43226.x - y= 33383.x - hồi quy 20832 29619 24210 SD = Sy 20389 31359 25531 b 10^8 43226 33383 CDL (ppm) 0,61 2,17 2,29 CDQ (ppm) 2,01 7,18 7,57 6
3.1.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Bảng 3.3. Ảnh hưởng của dung môi chiết đối với THSG, EM và PS Dung môi chiết Hàm lƣợng THSG (%) EM (mg/g) PS (mg/g) EtOH 100% 1,271 ± 0,03 1,13 ± 0,04 0,44 ± 0,03 EtOH 80% 2,441 ± 0,02 0,85 ± 0,03 0,33 ± 0,02 EtOH 60% 2,520 ± 0,02 0,63 ± 0,03 0,33 ± 0,04 EtOH 50% 3,193 ± 0,02 0,60 ± 0,03 0,31 ± 0,04 EtOH 40% 2,352 ± 0,02 0,56 ± 0,01 0,21± 0,02 EtOH 20% 2,611 ± 0,03 0,35 ± 0,01
3.1.2.3 Đề xuất qui trình xử lý mẫu Hà thủ ô đỏ Sơ đồ 3.1 Phương pháp xử lý mẫu Hà thủ ô Sơ đồ 3.2 Phương pháp xử lý mẫu Hà thủ ô đỏ cho phân tích định lượng THSG đỏ cho phân tích định lượng EM và PS 3.1.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích THSG, EM và PS bằng HPLC-UV 3.1.3.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) Hình 3.2. SKĐ HPLC-UV đánh giá tính Hình 3.3. SKĐ HPLC-UV đánh giá tính đặc hiệu đối với THSG đặc hiệu đối với EM và PS (1-mẫu dung môi EtOH 50%; 2-THSG; 3-Hà thủ (1-mẫu dung môi MeOH, 2-hỗn hợp EM và PS, ô đỏ chế; 4-dược liệu Hà thủ ô đỏ) 3-dược liệu Hà thủ ô đỏ, 4-Hà thủ ô đỏ chế) Kết quả thu được chứng tỏ phương pháp phân tích và hệ thống lựa chọn có tính đặc hiệu cao. 3.1.3.2 Tính thích hợp của hệ thống: Các giá trị %RSDr đối với THSG, EM và PS nhỏ hơn 2%, chứng tỏ hệ thống đáp ứng yêu cầu phân tích định lượng THSG trong điều kiện thí nghiệm như đã nêu. 3.1.3.3 Độ lặp lại trong ngày và khác ngày: các giá trị %RSDr và %RSDR của THSG, EM và PS đều nhỏ hơn 3%, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ chụm đạt yêu cầu đối với THSG, EM và PS. 8
3.1.3.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (MDL, MQL) Bảng 3.4. MDL và MQL đối với THSG, EM và PS bằng HPLC-UV Chất phân tích MDL MQL THSG 3,06 µg/g 10,10 µg/g EM 9,75 µg/g 32,17 µg/g PS 13,65 µg/g 45,04 µg/g 3.1.3.5 Độ đúng (hiệu suất thu hồi): Hiệu suất thu hồi trung bình đối với THSG, EM và PS nằm trong khoảng cho 95% -105%. Chứng tỏ phương pháp phân tích xây dựng được có độ chính xác cao, có thể dùng để phân tích định lượng THSG, EM, PS trong Hà thủ ô đỏ. 3.1.3.6. Ước lượng ĐKĐBĐ: ĐKĐBĐ ước lượng được đối với THSG, EM và PS lần lượt là 0,01%, 0,015 mg/g và 0,016 mg/g. 3.1.4. Qui trình phân tích định lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC-UV Sơ đồ 3.3 Qui trình phân tích định lượng Sơ đồ 3.4 Qui trình phân tích định lượng THSG trong HTOĐ bằng HPLC-UV EM, PS trong HTOĐ bằng HPLC-UV 3.1.5 Kết luận về phương pháp HPLC-UV phát triển được:  Với chỉ tiêu phân tích hàm lượng THSG: - Dung môi chiết là EtOH 50%: DĐVN V và DĐTQ dùng EtOH 100%, kết quả k/s thì hiệu suất chiết đối với EtOH 50% cao gấp 2,8 lần so với EtOH 100% => dùng EtOH 50% làm dung môi chiết tối ưu hơn 9
- DĐHK dùng EtOH 50% làm DM chiết và chiết siêu âm trong 30 phút. Qua khảo sát, cho thấy chiết hồi lưu cho hiệu suất chiết cao hơn hẳn chiết siêu âm => lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu là tối ưu hơn.  Với chỉ tiêu phân tích hàm lượng anthraquinon (EM, PS): - Kết quả khảo sát phù hợp với các nghiên cứu đã công bố. - Về điều kiện phân tích sắc ký: phương pháp xây dựng được đánh giá chặt chẽ về độ tinh khiết pic bằng phổ MS, vì vậy kết quả thu được chính xác, các tín hiệu pic không bị trùng với chất khác. 3.1.6 Phân tích và đánh giá hàm lượng THSG, EM và PS trong một số mẫu dược liệu và sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ bằng HPLC-UV 3.1.6.1 Mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ Theo vùng trồng Theo năm tuổi Hình 3.4. Biểu đồ cột so sánh hàm lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ xác định bằng phương pháp HPLC-UV  Một số kết luận được rút ra như sau: - THSG là thành phần có trong tất cả các mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, với mức hàm lượng đạt trong khoảng từ 1-4%. Trong đó, các mẫu trồng tại vùng núi cao thường có hàm lượng THSG cao hơn các mẫu trồng tại vùng có độ cao thấp. - EM và PS chỉ xuất hiện trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ Việt Nam, với mức hàm lượng cỡ 0,01-0,05% với EM và 0,005-0,01% với PS. - Hàm lượng THSG, EM và PS trong các mẫu 2 năm lớn hơn rõ rệt so với mẫu 1 năm, và đến 3 năm hàm lượng hoạt chất THSG, EM và PS vẫn tăng nhưng tăng chậm so với 2 năm. 3.1.6.2 Mẫu Hà thủ ô đã chế và sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ - Đối với các mẫu Hà thủ ô đỏ chế, hàm lượng THSG đạt khoảng từ 0,6-1,1%, thấp hơn nhiều so với trong mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ. Tất cả các mẫu Hà thủ ô đỏ chế khảo sát đều không thấy có EM và PS. - 2 mẫu sản phẩm đều không có các thành phần EM và PS, trong mẫu Trà-HTO-TA không có THSG, THSG trong mẫu T-HTO-TPC đạt 20,41 mg/viên. 10
3.2. Xây dựng mới phƣơng pháp định lƣợng đồng thời một số thành phần chính trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng TLC-scanner Densitometry 3.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích TLC tối ưu 3.2.1.1 Lựa chọn hệ dung môi rửa giải HDM1 HDM2 HDM3 HDM4 HDM5 Hình 3.5. SKĐ TLC so sánh các HDM rửa giải khác nhau Với HDM5 (toluen – ethyl acetat – aceton – axit formic (5:2:2:1, v/v/v/v)), hỗn hợp 5 chất chuẩn cho tín hiệu tách tốt, pic cân đối, tách rời nhau. 3.2.1.2 Lựa chọn bước sóng quét định lượng Bước sóng quét định lượng được lựa chọn dựa trên phổ UV của các chất định phân và một số tài liệu tham khảo: THSG quét định lượng tại sóng 320 nm; EM và PS: quét định lượng tại sóng 442 nm. 3.2.1.3 Khảo sát thể tích chấm mẫu trên bản mỏng TLC Trong khoảng thể tích chấm mẫu từ 2 µl đến 10 µl, các tín hiệu pic chất định phân không bị doãng như khi dùng các thể tích chấm mẫu lớn hơn. Từ đó, lựa chọn thể tích chấm mẫu là 10 µl cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.1.4 Xây dựng đường chuẩn Các giá trị Pvalue của giá trị a thu được đều lớn hơn 0,05, chứng tỏ phương pháp xây dựng được không mắc sai số hệ thống. 11
Bảng 3.5. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn EM, PS và THSG bằng phương pháp TLC-scanner Densitometry THSG EM PS Khoảng tuyến tính 80-800 ng/vết 40-320 ng/vết 40-320 ng/vết Phương trình đường Y=9,51.X – 135,1 Y= 32,69.X + Y= 31,22.X + chuẩn 821,4 179,5 SD = Sy 17,4 146,9 130,8 b 9,51 32,69 31,22 CDL (ng/vết) 5,4 13,48 12,59 CDQ (ng/vết) 18,1 44,4 41,55 3.2.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 3.2.2.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) a-THSG b-mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ c-mẫu Hà thủ ô đỏ chế d-mẫu blank (EtOH 50%) Hình 3.6. SKĐ TLC-scanner Densitometry phân tích THSG trong Hà thủ ô đỏ a-EM và PS b-mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ c-mẫu Hà thủ ô đỏ chế d-mẫu blank (MeOH) Hình 3.7. SKĐ TLC-scanner Densitometry phân tích EM, PS trong Hà thủ ô đỏ 12
3.2.2.2 Tính thích hợp hệ thống: các giá trị RSDr < 2%, chứng tỏ phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống. 3.2.2.3 Độ lặp lại trong ngày và khác ngày: các giá trị %RSDr và %RSDR của THSG, EM và PS đều nhỏ hơn 4%, chứng tỏ phương pháp phân tích có độ chụm tốt. 3.2.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp (MDL, MQL) Bảng 3.6. MDL và MQL đối với THSG, EM và PS bằng phương pháp TLC- scanner Densitometry Tên chất MDL MQL THSG 3,5 µg/g 115,5 µg/g EM 11,5 µg/g 37,95 µg/g PS 14,3 µg/g 47,19 µg/g 3.2.2.5 Độ đúng (hiệu suất thu hồi): Hiệu suất thu hồi đối với EM và THSG đều đạt trong khoảng chấp nhận của 90-108%. Riêng đối với PS thì độ thu hồi ở một số thí nghiệm đạt khoảng 88-106%. 3.2.2.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ): ĐKĐBĐ đối với THSG, EM và PS lần lượt là 0,011%; 0,14 mg/g và 0,17 mg/g. 3.2.3. Qui trình phân tích định lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp TLC-scanner Densitometry Sơ đồ 3.5 Qui trình phân tích định lượng THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp TLC-scanner Densitometry 13
3.2.4 So sánh phương pháp TLC-scanner Densitometry xây dựng được với phương pháp HPLC-UV đối chiếu 3.2.4.1 So sánh phương pháp theo từng cặp * Đối với hàm lượng THSG: Pvalue= 0,070 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau và sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê. * Đối với hàm lượng EM: Pvalue= 0,167 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau, sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê. * Đối với hàm lượng PS: Pvalue= 0,677 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau, sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê. 3.2.4.2 So sánh phương pháp theo đường hồi qui tổng quan THSG EM PS Hình 3.8. Các đường hồi qui tương quan so sánh hàm lượng THSG, EM và PS bằng TLC-scanner Densitometry và HPLC-UV Kết quả xử lý thống kê chứng tỏ không có sự khác nhau có nghĩa giữa hai tập số liệu. 3.2.5. Kết luận về phương pháp xây dựng được - Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về xây dựng mới phương pháp TLC-scanner Densitometry định lượng đồng thời 3 chất THSG, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ (vẫn sử dụng 2 phương pháp xử lý mẫu khác nhau). 3.3 Xây dựng mới phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần trong dƣợc liệu Hà thủ ô đỏ Việt Nam bằng HPLC-FLD Điều kiện xử lý mẫu đối với dược liệu Hà thủ ô đỏ được áp dụng theo phương pháp xử lý mẫu đã xây dựng được. Điều kiện phân tích sắc ký HPLC được áp dụng theo phương pháp HPLC-UV đã xây dựng được đối với phân tích các hợp chất THSG, EM và PS. Detector huỳnh quang (FLD) được cài đặt bước sóng quan sát và định lượng phù hợp với từng chất theo một số tài liệu tham khảo. 3.3.1 Điều kiện phân tích sắc ký HPLC-FLD 3.3.1.1 Phân tích EM và PS + Hệ thống: HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% 14
+ Chương trình dung môi rửa giải lựa chọn được là: ACN- axit formic 0,5% (tỷ lệ 70-30, v/v). + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (nên giữ trong khoảng từ 250C-350C) + Detector FLD: λEx= 435 nm và λEm= 515 nm 3.3.1.2 Phân tích THSG, RES và PC + Hệ thống: HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản + Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) + Hệ dung môi pha động: ACN (ACN) – axit formic 0,5% + Chương trình dung môi rửa giải lựa chọn được là: 0-22 phút (16%ACN); 22-45 phút (16-34%ACN); 45-60 (34-38%ACN). + Tốc độ dòng: 1 ml/phút + Nhiệt độ: nhiệt độ thường (nên giữ trong khoảng từ 250C-350C) + Detector FLD: tại λEx= 315 nm và λEm= 395 nm 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn Các giá trị Pvalue của giá trị a thu được đều lớn hơn 0,05, chứng tỏ sự sai khác giữa giá trị a (trong Y = a + b.X) và giá trị 0 là không có ý nghĩa thống kê, hay nói cách khác, các phương pháp xây dựng được không mắc sai số hệ thống. Từ đó, xác định được CDL và CDQ của đường chuẩn Bảng 3.7. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn THSG, RES, PC, EM và PS bằng phương pháp HPLC-FLD THSG RES PC EM PS Khoảng 1,5-60 1-40 1-40 3,9-62,5 1,36-43,75 tuyến tính µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml Phương Y= Y= Y= y= trình y= 10^6.x 6.10^6.x + 2.10^7.x – 7.10^6.x + 3.10^6.x - đường -3.10^6 2.10^6 4.10^6 64250 4.10^6 chuẩn SD = Sy 258298 580085 242643 82215 176888 b 6.106 2.107 7.106 106 3.106 CDL 0,129 0,087 0,104 0,246 0,176 (ppm) CDQ 0,426 0,287 0,343 0,814 0,584 (ppm) 15
3.3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích 3.3.3.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) Hình 3.9. SKĐ HPLC-FLD đánh giá Hình 3.10. SKĐ HPLC-FLD đánh giá tính đặc hiệu đối với EM và PS tính đặc hiệu đối với THSG, RES và PC (1-mẫu blank MeOH, 2-hỗn hợp chuẩn EM và PS, (1-mẫu blank EtOH 50%; 2-hỗn hợp PC, THSG 3-dược liệu Hà thủ ô đỏ; 4-mẫu Hà thủ ô chế) và RES; 3- Hà thủ ô đỏ; 4-mẫu Hà thủ ô chế ) 3.3.3.2 Tính thích hợp của hệ thống: Các giá trị %RSDr đều nhỏ hơn 3%, chứng tỏ phương pháp phân tích có sự phù hợp hệ thống tốt. 3.3.3.3 Độ lặp lại trong ngày và khác ngày: các giá trị độ lệch chuẩn lặp lại (%RSDr) của 5 hợp chất định phân tích đều nhỏ hơn 2%. Độ lệch chuẩn tái lặp (%RSDR) của THSG nhỏ hơn 2%, của các chất còn lại (ứng với mức hàm lượng thấp) đều nhỏ hơn 5%. Chứng tỏ phương pháp phân tích có độ chụm tốt. 3.3.3.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (MDL, MQL) Bảng 3.8. MDL, MQL đối với THSG, RES, PC, EM và PS bằng HPLC-FLD Chất MDL MQL THSG 61,1 ng/g 202,1 ng/g RES 45,2 ng/g 149,2 ng/g PC 50,5 ng/g 166,6 ng/g EM 100,8 ng/g 332,64 ng/g PS 125,4 ng/g 413,82 ng/g 3.3.3.5 Độ đúng (hiệu suất thu hồi): hiệu suất thu hồi trung bình đối với cả năm chất PC, THSG, RES, EM và PS nằm trong khoảng 90-110%. Vậy có thể kết luận phương pháp phân tích xây dựng được có độ chính xác cao, có thể dùng để phân tích định lượng các hợp chất THSG, RES, PC, EM và PS trong mẫu dược liệu Hà thủ ô đỏ. 3.3.3.6. Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ): ĐKĐBĐ của phương pháp phân tích đối với PD là 1,52 µg/g, đối với THSG là 0,023 g/100g và đối với RES là 0,5 µg/g, đối với EM là 4,19 µg/g, đối với PS là 2,83 µg/g. 16
3.3.4 Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC, EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng phương pháp HPLC-FLD Sơ đồ 3.6. Qui trình phân tích định lượng Sơ đồ 3.7. Qui trình phân tích định lượng THSG, RES, PC trong dược liệu Hà thủ ô EM và PS trong dược liệu Hà thủ ô đỏ đỏ bằng phương pháp HPLC-FLD bằng phương pháp HPLC-FLD 3.3.5 Kết luận về phương pháp xây dựng được - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về xây dựng mới phương pháp HPLC-FLD phân tích định lượng đồng thời THSG, RES, PC và phân tích đồng thời EM, PS dạng tự do trong dược liệu Hà thủ ô đỏ. - Phương pháp HPLC-FLD xây dựng được có ưu điểm vượt trội so với phương pháp HPLC-UV về độ nhạy: MQL giảm 50 lần đối với THSG, giảm 90 lần đối với EM và giảm 110 lần đối với PS. 3.3.6 Phân tích định lượng THSG, EM, PS, RES và PC trong các mẫu dược liệu và sản phẩm từ Hà thủ ô đỏ bằng HPLC-FLD 3.3.6.1 So sánh hai phương pháp HPLC-UV và HPLC-FLD phân tích THSG, EM và PS  So sánh phƣơng pháp theo từng cặp * Đối với hàm lượng THSG: Pvalue= 0,321 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau và sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê. 17
* Đối với hàm lượng EM: Pvalue= 0,431 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau, sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê. * Đối với hàm lượng PS: Pvalue= 0,677 >0,05 chứng tỏ kết quả hai phương pháp đạt được là như nhau, sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê.  So sánh phƣơng pháp theo đƣờng hồi qui tổng quan THSG EM PS Hình 3.15. Các đường hồi qui tương quan so sánh kết quả phân tích hàm lượng THSG, EM và PS bằng HPLC-UV và HPLC-FLD Kiểm tra thống kê, chứng tỏ không có sự khác nhau có nghĩa giữa hai tập số liệu. 3.3.6.2 Phân loại nguồn gốc mẫu bằng phương pháp thống kê Dendrogram Scree Plot of C1, ..., C5 Single Linkage, Euclidean Distance 3.0 76.37 2.5 2.0 Eigenvalue 84.24 1.5 Similarity 1.0 92.12 0.5 0.0 1 2 3 4 5 Component Number 100.00 1 2 13 3 5 19 4 6 14 16 8 15 21 30 20 24 27 7 23 9 17 10 25 28 43 11 12 18 29 26 44 45 22 48 37 40 38 39 41 47 46 42 31 35 34 36 33 32 Observations A B Hình 3.11. Đồ thị CA các Hình 3.12. Đồ thị PCA các mẫu Hà thủ ô đỏ (a-Scree plot; mẫu Hà thủ ô đỏ b-Score plot) - Nhóm mẫu 1: đều là mẫu Hà thủ ô trồng tại vùng đồng bằng phía Bắc: có thành phần hóa học tương đối giống nhau, đều có các thành phần THSG, PC, EM và PS. Điểm tạo nên sự khác biệt giữa nhóm mẫu này với các nhóm mẫu khác là đều có các thành phần anthraquinon (gồm EM, PS). - Nhóm mẫu 2: mẫu thu tự nhiên tại Hà Giang: đều có các thành phần THSG, EM , PS và PC, nhưng hàm lượng THSG cao hơn nhóm mẫu 1 - Nhóm mẫu 3 và nhóm mẫu 4: mẫu thu hái tự nhiên có nguồn gốc Sơn La và Lai Châu (2 tỉnh miền núi Tây Bắc giáp nhau): chỉ có các mẫu thuộc 2 nhóm mẫu này mới thành phần RES. Thông tin này gợi ý cho các nghiên cứu về truy xuất nguồn gốc cho dược liệu Hà thủ ô đỏ tại Sơn La và Lai châu. 18