Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

Chia sẻ: Lê Thị Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phần 2 giáo trình trình bày các nội dung: Lai tế bào soma, kỹ thuật chuyển gen và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật, kỹ thuật RFLP trong nghiên cứu di truyền và chọn giống thực vật, kỹ thuật PCR và ứng dụng của nó trong chọn giống thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Cơ sở di truyền chọn giống thực vật: Phần 2

98 Chương 5 LAI TỂ BÀO SOMA 5.1. M ỏ ĐẦU N hư ta đă biết, khác với các tế bào động vật, tế bào thực vật ctí thành tế bào là lớp bao ngoài cùng. Thành tế bào gồm xenlulo (khoảng 20-30 % ), hemixenluỉo và pectin. Nếu như thành tế bào bị tách bỏ, thì lúc đđ tế bào thực vật sẽ lộ ra lớp m àng sinh chất ngoài cùng, m à trạng thái ta gọi là tế bào tràn hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc với nhau thỉ chúng cổ thể hợp nhất lại làm một, m à ta gọi là 8ự dung hợp protoplast. Nếu như các protoplast cđ nguòn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi khác nhau được dung hợp lại thi nó cđ thể dẫn đến hiện tượng lai té bào soma (somatic hybrydization), Vi tế bào thực vật cố thành tế bào, nên trước đây trong một thời gian dài người ta cho ràng kỷ th u ật dung hợp protoplâst chỉ giới hạn ở các tế bào động vật; mặc dầu ngay từ rấ t sớm Kuster (1909) đă nêu ra ý tưởng sử dụng phương pháp lai tế bào soma để vượt qua những khó khản nảy sinh trong quá trình lai xa ở thực vật. Mãi cho đến nảm 1960, sau những nghiên cứu thành cổng của Cocking với việc dùng m ột hỗn hợp các e m y m cellulose, pectinase và maceroz 3nne để tách bỏ thành tế bào thực vật, thi kỹ th u ật dung hợp protoplast mdi được áp dụng ở thực vật. Tuy nhiên, nổ chi thực sự phát triển m ạnh m ế và cố xu hiỉớng được úng dụng trong chọn giổng chỉ sau các kết quả n ^ i ê n cứu về việc tái sinh hoàn chỉnh cây thuổc lá từ protopỉast của Ikkebe (1971) và việc tái sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa hai loài N. tabacum với N. langsdorffi của Carlson (1972), Sự ra đời của kỹ th u ật protoplast cho phép ngườỉ ta tẹo ra những tái tổ hợp di truyền giữa các đơn vị phân loại xa ( loài hay chi) m à bằng phương pháp ỉai hữu tính khò hoặc không đ ạ t được. Trong quá trỉnh dung hợp, bên cạnh sự kết hợp giữa các genom trong nhân, còn cố th ể xảy ra sự hợp n h ất tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạ n g do các gen trong tế bào chất kiểm soát, như tính bất thụ đực, cố thể được chuyển m ột cách không khó khăn từ cây này sang cây khác nhờ kỹ th u ật này. Muốn tiến hành lai tế bào soma càn phải tách được các protoplast m ột cách nguyên vẹn, cho chúng dung hợp với nhau, làm cho các sản phẩm dung hợp phân chia và tái sinh chúng th àn h cây. 5.2. TÁCH PROTOPLAST Về nguyên tác, có hai phương pháp tách bỏ thành tế bào thực vật : phương pháp cơ học và phương pháp dùng enzyin. T\xy nhiên, trong thực tế người ta chỉ dùng phương
c o s ỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỤC VẬT 99 pháp enzym, vì nđ cd^hiệu suẩt rấ t cao mà lại không gây thương tổn cho tế bào. Khi thành tế bào được tách ra, protoplast phải được phóng thích ra môi trường cd áp suất thắm tháu cao để trán h nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ protoplast ( ví dụ, cd th ể dùng dung dịch manitol 0,5 M). Tuy nhiên, thời gian lưu lại ở đó không nên quá dài khiến cho trao đổi chất của tế bào và cấu trúc màng lưới sinh chất bị tổn hại. Dể tách protoplast, ví dụ từ cây thuốc lá được trồng trong nhà kính, được tưới thường xuyên ở 25"C, thỉ lá thứ ba từ trên xuống là ngiiồn thực liệu thích hợp nhất. Lá được khử trùng bằng ethanol 70% trong vài giây, sau đó được nhúng vào dung dịch hypoclorit canxi 5% rồi rửa bằng nước cất. Lá được thái nhỏ cho vào đỉa P etri chứa hỗn hợp enzym như sau : 0,1 % cellulase, 0,02% macerozyme và 0,05% driselase, để qua đêm (khoảng 16 h). Sau đó lọc qua rây cđ lỗ 50 - 80 /ym, rồi rửa 2 làn bàng dung dịch mới không chứa enzyxn bầng cách ly tâm. Ngoài lá, người ta cd th ể dùng phần trụ dưới lá mầm hay rễ làm nguyên liệu tách protoplast. Do không chứa diệp lục nên nguồn protoplast này dễ phân biệt với các protoplast được tách ra từ mô th ịt lá. Một nguồn nguyên liệu khác cũng được dùng để tách protoplast là các tế bào nuôi cấy dạng huyền phù. Đôi với các cây hoà thảo, điều cần biết là, chỉ cd các protoplast được tách ra từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù mới có khả nảng phân chia và tái sinh cao (Fujimura,1985 ). 53. DUNG HỘP PROTOPLAST Lần đầu tiên Carlson (1972) đã tái sinh ra những cây thuốc lá từ protoplast bàng cách cho dung hợp protoplast trong môi trường cfòng thẩm tích của dung dịch n itrat natri. Còn Melchers (1974 ) thì dung hợp protoplast củng của thuốc lá ở môi trường 50 mM Ca + 0,4 M manitol với pH = 10,5. Môi trường của Melchers tỏ ra rá t thích hợp cho việc dung hợp tế bào chất. Sau này, Kao (1974) đả phát hiện ra chát polyethylen glycol (PEG) cd tác dụng làm tân g hiệu quà dung hợp của protoplast; vl nd là chất qd ái lực với nước, làm tăng tính thẩm thấu và tăng bề m ặt tiếp xúc giữa các protoplast. Chỉ sau vài phút được ngăĩh vào dung dịch 20 - 40 % (w/v) của PBG (mol. Wt. 1500 - 1600) hàu như tấ t cà các protoplast đều được kết dính lại. Tuy nhiên, việc dung hợp chỉ thực sự xảy ra khi pha ỉoâng PEG trong môi trường có nồng độ cao và pH cao (pH=« 10,5). T\iy nhiên, do PEG có độc tính đối với tế bào thực- vật nên người ta thường dùng ở nồng độ thấp hơn và thêm vào đó m ột ít DMSO (dimethyl sulíoxid). Sau này, phương pháp dung hợp nhờ xung điện (electrofusion) do Zimmerman đề xướng (1982) được nhièu người áp dụng. Nguyên tác của phương pháp là ; môi trường chứa protoplast được đặt giữa hai điện cực; sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ra m ột xung điện với điện th ế cao ( 500 - 10000 v/cm) trong khoảnh khác 5-6/1000 giây. Với các cây họ cà, hiệu quả dung hợp của phương pháp này đ ạt tới > 50%. Càn nhớ là, hiệu suất dung hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: m ật độ protoplast, nhiệt độ khi thí nghiệm, nồng độ PEG, cường độ điện trường... và nguồn nguyên liệu cho protoplast (tế bào mô th ịt lá thường thích hợp hơn là mô sẹo hoặc rễ cây). Sự cd m ặt của một lượng lớn không bào và các h ạt tinh bột làm giảm khả nảng sống sơt của protoplast trong quá trin h dung hợp. Dưối đâv (bảng 5.1) là môi trường Bourgin (1979) dùng cho nuôi cấy protoplast được tách ra từ th ịt lá cây thuốc lá.
100 LAI TẾ BÀO SOMA Bàng 5.1. MÔI truròrng nuối cấy protoplast thuốc lá (Bourgỉn, 1979 ) Hoá chất Nồng độ (mg /ỉ) Hoá chất Nồng độ (mg/l) NH4 NOj 825 Inositon KK) KNOj 950 Calciuiii pantothenat 1 Ca0 2 2 H2 0 220 BẾtXin 0 ,0 1 MgSố4-7H20 185 Axit nicoUi^ 1 KH2 PO4 85 PyrỉdcKin 1 FeSQ,.7H20 27^5 Thiamin 1 Na2 m yrA 37^5 Axit naphthalen acetỉc 3 Tsắo^ 1 6 -Ben2 ylamlnopui1 n 1 H2 B Ặ 1 Sucrose 20000 MnS04.4H2Ơ 0 ,1 Mannitol 80000 CuS0 4 ^ H 2 0 0,03 pH 5^ AIOị 0,03 NICI2 .6 H2 O 0,03 KI 0 ,0 1 5.4. NUÔI CẤY PROTOPLAST VÀ TÁI SINH CÂY Môi trường nuôi cấy protoplast khác xa so với các môi trường nuôi cấy mô để cho tế báo cổ th ể phfln chia và hinh thành md sẹo. Điều khác trưãc tiên là, mổi trưdng này cần phảỉ cd áp suăt thẩm thâu cao lúc ban đầu bầng cách aử dụng m annitol hoặc sorbitol ; thứ hai là, môi trường phẩd ctí nông độ chất sinh trưởng tương đổi cao. Đối với protoplast thuổc lá nồng độ các chất đổ là : 3 mg/1 NAA (15 Ịiim.) và 1 mg/ỉ benzylaminopurín (5 /im ) - Xem bảng 5.1. M ật độ protoplast / ml phải điều chỉnh sao cho cd th ể đếm được bầng bu&ng đốm hồng cầu. Vối thuốc lá, nồng độ đó là 60000 protoplast /ml (nốu tế bào cđ kích thước bé thỉ m ật độ ctí th ể tAng lên). Môi trường dịch th ể của protoplast cần đật trong điều kiộn tổi cho đến khi chứng b&t đ&u phftn chia l&n thú nhát. Sau đổ kho&ng tìỉ 2 -6 ngày thỉ thành tế bào được tái sinh (tùy theo loài cây). Cấu trúc 2 tế bào cố th ế quan s á t được dưới kính hiển vi soi ngược, nếu chúng được nuôi cấy trên môi trường lỏng. THỉy nhiên, nếu nuôi cấy trôn môi trường đặc thl ta có th ể theo dõi được sự phát triển của từng protoplast và sự hinh thành từ ng cụm tế bào bé cđ nguồn góc từ từ ng protoplast. Đ ể chọn lọc các đột biến sinh hoá hoậc các con lai soma ngưdi ta cổ th ể nuỗi cẨy tách riêng từng protoplast trên từng đĩa P etri nhỏ trong mối trường cổ n&ng độ auxin thấp và m ật độ tế bào thấp (1 tế bào / Iml). Với protoplast của cây cải dầu, bàng phương pháp nuôi cấy liên tục cđ thay môi trường mới 2-3 lần thì có thể thu được các nhổm tế bào cổ kỉ}ả n&ng tái sinh, sau khi chuyển chúng sang mối trường đặc tạo ch&ỉ thân. Cổ hai con đường phát sinh hình thái trong quá trin h hình thành cây hoàn chỉnh đối với các tế bào cd nguồn gốc từ protopiast. Đối với các protoplast cđ nguồn gốc tỉl mỏ th ịt ỉá của cây thuốc lá, thỉ từ trong các tập đoàn tế bào nhỏ xuất hiện những u 16i ( vài tu ần sau khi tách protoplast). Các u này phát triển thành rễ trong mổi trường khổng có chát sinh trưởng hoặc có ít auxin. Còn trong trường hỢp khi protoplast có nguồn gốc từ các
c o s ò DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 101 tố bào phôi được nuôi cẩy dạng huyền phù ( thưòng đổi với họ hoà thảo ) thi các cụm tố bào v&n giữ nguyẽn được khả n&ng phát sinh phối để hinh thành nên các phổi. Nếu đảm bảo được qui trìn h chặt chẽ như trên, thi phồi hoặc mô phân sinh sỗ hỉnh thành sau khoảng 3 -5 tu ần lễ. Tuy nhiên, trong những trường hợp khi mà điều kiện thí ni^iộm khống tổi ưu và có những biến đối về mặt di truyền thỉ sẽ xuát hiện sự thay đổi VẾ sổ lượng nhiễm sác th ể. Ví dụ, với các protoplast từ cây khoai tây 2n, tầ n số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, còn lại chủ yếu là các cây 4n. 5.5. CHỌN LỌC SẤN PHẨM DUNG Hộp Giả sử ta cho dung hợp giữa các protoplast từ 2 cây khác nhau và thu được kiểu tế bào dị nhân (heterokaiyocjrte), trong đó có sự trộn lẫn cả nhân và tế bào chất (bao gốm cả ty, lạp th ể trong tế bào chẫt ). Song, sự dung hỢp này cũng có th ể chỉ xảy ra giữa 2 nhãn hoậc giữa các tế bào chất hoặc chi một phần giữa các nhân. Điều này phụ thuộc vào quan hệ giữa các loài. Ví dụ, tàn số dung hợp giữa N.tabacum / N.tabacum ỉà 10 ■*, giữa Brassica campetris / B. oleracea là 0,5. Dể làm tăng khả năng tái sinh các cáy lai, người ta đã sử dụng một số phương pháp làm tảng tỷ lệ các tế bào dị nhân hoậc các phương pháp chọn lọc tế bào lai. Dưới đây, ta xem xét một sổ kỹ thuật tách các sản phẩm dung hợp. 1) Gleba (1978) đề xuất kỹ thuật tách và ũh&n dòng đổi với các sản phẩm dung hạp dưới kính hiển vi, dựa vào sự sai khác về mặt hinh thái; chẳng hạn sự cổ m ặt của các chloroplast từ protoplast của mô thịt lá và sự khũng cổ m ặt của chúng trong các protoplast cd nguồn gốc từ mô sẹo hay trụ dưới lá mầm. Việc tách các tố bào dị nhán được tiến hành bằng micropipet. 2) G albraỉth (1978) và Redenbaugh (1981) đS ra phương pháp nhận diện các sản phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang hoặc với chất rhodam in isothiocyanat đối với các protoplast trước lúc cho dung hợp. 3) Các sản phẩm dung hợp cũng có thể được tách ra bàng phương pháp kốt hợp tìí trường với gen chỉ thị kháng ehẵt khấHg ẫÌRh. Nguyên tấc nhu ẫãu; protoplast của dạng A được gán những phân tử nhỏ cố ái lực tỉí tính mạnh; protoplast của dạng B có gán gen kháng chất kháng sinh (ví dụ như kanamycin) Sau thí nghiệm dung hợp, protoplast được cho đi qua cột phàn ly ctí từ tính mạnh; protoplast dạng A và protoplast lai được gỉữ lại ở cột, còn proíoplast dạng B thỉ tách khỏi cột. Hỗn hợp protoplast lai và dạng A được nuổi căy trong mổi trường có kanamycin để tách ra các tế bào lai. 4) Các hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trinh dinh dưỡng được dùng r ấ t rộng rãi và cđ hiệu quả để nhận biết các sản phắm dung hợp, như sử dụng các đột biến bạch tạn g hay thiếu h ụ t diệp lục, các đột biến sinh hoá do thiếu enzym n itra t reductase - NR (Melchers, 1974; Glỉmelius, 1978 ) hoặc các gen đánh dấu (ctí được bằng phương pháp chuyển gen) có liên quan đến tỉnh kháng các chát kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất diệt cỏ (Evola, 1983). - Chẳng hạn, cđ những trưòng hợp, khi được nuôi cấy trong môi trường thiếu hoocmon ngoại sinh thi các tế bào lai có khả nãng cho mỏ sẹo và tái sinh cây, còn các tế bào của từ ng dạng bó mẹ lại không có khả năng ấy (Power (1977) và Shenck (1982)) . - Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp protoplast giữa các dạng đột
102 LAI TỂ BÀO SOMA biến thuộc hai ioài Petunia hybrida và p. parodii, trong đổ protoplast từ dạng đột biến albỉno của p. hybrida cho md sẹo màu trá n g trê n mối trưòng m à d đd protopỉast của p. parodii khống cho mữ sẹo, còn tế bào lai thì cho mỗ sẹo màu xanh. • Masson (1989) và Thomas (1990) đa sử dụng phương pháp biến nạp cho cả hai dạng bố m ẹ : một dạng được g&Đ gen kháng kanam ydn còn dạng kia được gán gen kháng hygromydn; việc chọn lọc các tế bào lai được tifo hành trong mữi trường chứa cả hai loại kháng sinh đđ. Nếu m ột trong hai dạng bổ mẹ là kiểu đột biến sinh dưỡng, ví dụ, kiốu thiếu enz}an NR nén khống th ể sổng được tr 6n mỗi trường N O ^do khống có khả năng khử N O ^ -*■ N0J" -* NH 3, còn dạng kia được chuyển gen kiểm soát một tính trạn g trội - như kiểu kháng chất diệt cỏ hoặc kháng sinh - thi ta cổ th ế chọn lọc trực tiếp các tế bào lai trên mỗi trường tổi thiểu và cổ bổ sung chãt kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (các tế bào bổ hoặc mẹ khổng thổ sỔBg binh thườhg được). Dạng con lai đa năng như vậy đa được sử dụng d cây thuổc ỉá hoặc cải d&u. 5.6. CON LAI DO sự DUNG Hộp NHẢN Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhấib nhân (nuclear hybrid) đa được tạo ra thành cống giữa các ỉoài cây trồng vỗi loài hoang dại d chi cải dầu; ví dụ, giữa loài B. nigra chứa 1 bộ gen (B) vói ỉoài B. napua chúa 2 bộ gen (ÁC). Bàng phương pháp dung hợp protoplast giữa hai loỉd ây, người ta đã tạo ra được dạng con lai chứa 3 bộ gen (ABC). Hoặc khi dung hợp protoplast giữa E nica sativa vói B. napus người ta đã chuyển được gen kháng cỏn trù n g và chịu khô
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GlốNG THựC VẬT 103 quan tử, phàn 90% còn lại là do các gen nhãn m ã hoá và được chuyển qua m àng của các cơ quan tử . Các cơ quan tử được phân bố m ột cách n g ỉu nhiỗn vào các tế bào con qua các th ế hệ tế bào. Trong sinh sản hữu tính, các cơ quan tử nổi chung chỉ được chuyển qua giao tử cái. Trong khi đổ, nhờ sự dung hợp protoplast mà ta cđ được hiện tượng đổng góp như nhau của các cơ quan tử có trong tế bào chất từ hai dạng bố mẹ. Sản phẩm của dung hựp có th ể chứa các nh&n, ty th ể và lạp th ể tù cả hai dạng bố mẹ. Nhưng, nó cũng có th ể chi chúa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chát thi lại của cả hai. Dạng con lai như vậy ctí tên gọi là con lai tế bào chất hay cybrid. ỗ.7.1. Dung hợp protoplast và trao dổi tế bào chát Trong trường hợp mục đích thí nghiệm là phối hợp nhân của một dạng bố mẹ này với to àn bộ tế bào chất của dạng bố mẹ kia và nếu như, khả năng kết hợp nhân của hai dạng ấy là cao, thì người ta có th ể chiếu xạ dạng bđ mẹ cho tế bào chát (cytoplasmic donor) bằng tia X hay tia gamma. Bằng cách xử lý như vậy, tia phổng xạ sẽ khồng g&y ra hiệu quả đột biến đến các hệ gen ở cơ quan tử, vỉ nđ cổ nhiều bản sao trong tế bào. Còn đổi với dạng bố mẹ nhận nh&n (nuclear recipient) thỉ ngưòi ta loại bỏ cơ quan tử trong tế bào chất bằng cách sử dụng các chất ức chế trao đổi chât, như iodoacetat hay iodoacetamid. 5.7.2. Dung hợp protoplast và tạo các tái tổ hệ gen lạp thể Trong các sản phẩm dung hợp, lạp th ể được phân ly ngẫu nhiẻn vào các th ế hệ tế bào kế tiếp. Cũng cd hiện tượng, trong m ột cụm tế bào chi tồn tại các lạp th ể của một trong hai dạng bổ mẹ cả trong các con iai nhân hay con lai tế bào chất. Các nghiên cứu ở con lai soma giữa hai ioài thuổc lá và giữa thuốc lá với cây họ cà cho thấy cd hiện tượng tái tổ hợp giữa các genom của ỉạp thể (Thanh & Medgyesy,19ỗ9). Thí nghiệm nối trê n đã sử dụng các c&y đột biến về lạp thể kháng chăt kháng sinh và bạch tạng. Theo phân tích của Fẹjes (1990) trẻn cây thuốc iá thỉ, tái tổ hợp này xuát hiện là do sự trao đổi chéo. Lạp th ể của Lạp thổ của N. tabacum N. plumonoinitoba ch' str'' (+ ) ch'*' stĩ* ị Cụm tế bào phát triển trong môi trường cđ streptomycin. i Chọn lọc các cụm xanh. ị l ầ i sinh các cây m ang lạp thể tái tổ hợp.
104 LAI TỂ BÀO SOMA 5.7.3. Dung hợp protoplast và các tái tổ hợp hộ gen ty thể Tính bất thụ đực tế bào chất cổ ở nhiều loài thực vật là một tỉnh trạn g di truyền do sự kiểm soát của hệ gen ty th ể (Lonsdale, 1987). Những phân tích v6 tính đa hinh chiều dài các phân đoạn cát giới hạn (RFLP) đổi vối ty th ể của các con lai soma hay các cybrid ở Petunia hay Brassica (Rothenberg, 1985; Vedel, 1986) đều cho thấy có hiện tượng tái tổ hợp giữa các genom trong ty thể. ỏ cfly thuốc lá, khi đem dung hợp protoplast giữa một ỉoài hữu thụ với một loài băt th ụ đực thì sự tái tổ hợp xảy ra giữa các ty th ể đâ dẫn đến chỗ làm cho hỉnh thái hoa của cAy ỉai khác so với cả hai dạng bổ mẹ ban đầu (Kofer, 1990). Hiện tương tái tổ hỢp xảy ra ở hệ gen ty th ể đâ được tìm thấy ở nhiều loài thực vật. Diều đó mở ra khả năng cố th ể tạo ra sự trao đổi gen ty th ể giữa các ỉoài. 5.7.4. ÍÁp dụng sự dung hợp tế bào soma dể cải tiến các giống cây trồng qua hệ thống các cơ quan tử Từ sơ đ& trên hinh ỗ .l ta thấy, về m ặt lý thuyết cố th ể cố 9 sản phẩm sau quá trinh dung hợp protoplast giữa hai dạng bổ mẹ khác nhau vS hộ gen lạp thể (dạng trõ n )v à ty th ể (dạng sao), khi ta xem xét đến các khả năng: việc loại trừ đi hệ gen ty lạp th ể của m ột trong hai dạng bố mẹ hoặc các kiểu tái tổ hợp khác nhau xảy ra giữa hai dạng bố. N hìn chung, tái tổ hợp xảy ra ở các trường hợp 7 và 8 là phổ biến hơn cả. Các hệ gen lạp th ể khác nhau khi tbn tại chung trong một tế bào thường ít xảy ra tái tổ hợp, nhđt ỉà trong các trường hạp ít hoặc khổng có sự cạnh tran h giữa chúng. Ngược iạỉ, giữa các hệ gen ty thể thường hay xảy ra tái tổ hợp. Hệ gen tái tổ hỢp này được duy trl trong cây cybrid được tái sinh hoặc ở hậu thế. Vi thế, cấu trúc hay gập ở các cybrid là sự cố m ặt trong tế b&o của các tái tổ hợp ty th ể và genom lạp th ể của một trong hai dạng bố mẹ ( trường hợp số 7 và 8 của sơ d& trẽn). Chuyển tẽ bào chất bất thụ đực vào căy trầng Bàng phương pháp dung hợp protoplast ta cđ th ể chuyển ngay được tế bào chăt bất thụ đực vào các giống cáy trSng hữu thụ Uiảc nhau, điều mầ bàng phương phặp lai trở lại thống thường ta phải tiến hành qua 5 - 6 lần la i.ỏ cfly lúa, ngưòi ta đã tái sinh được các cây cybrid chúa nhân của giổng hữu thụ và các ty th ể tái tổ hợp từ hai dạng bố mẹ nhứng vẫn cổ tính băt thụ đực tế bào chất của dạng bất thụ đực (Kyozuka, 1989). Cũng như thố, Gupta (1996) đã chuyển được tố bào chất b ấ t thụ từ dòng CMS m ang ký hiệu V20A sang các dòng duy trì và phục hồi hữu thụ RCPL1-2C, V20B và IR36, đều thuộc nhdm ỉúa Indica. Bằng phương pháp tương tự r.hư vậy, người ta cũng đã thành cổng trong việc chuyển tế bào chất b át thụ đực vào các giổng cây hữu thụ ở báp CÂÌ, cà rốt và củ cải đường (Prim ard, 1988; 'Iknno- Suenaga, 1988; Krens, 1990). ở thuổc lá, Kumashiro (1988) đã tạo ra được m ột kiểu b át thụ đực tế bào chất mới nhờ việc dung hợp giữa protoplast của loài N. tabacum với protoplast đă được chiếu xạ của loài N. africana. Đối với các c&y cam quít, tính bất thụ đực d những giống có quả khỗng hạt có ý ng^ĩa kinh tế lón. Vardi (1989) đã tạo ra được các cybrid bất thụ đực cho quả khống h ạt ở nhdm cây này. Cái tiên hệ thống bđt thụ đực tế bào chất ờ Brassica Các cây trống thuộc chi Braasica có nhiều loài là cây rau hoặc cây cho dầu, như báp cải hoặc cải dầu. Cải dầu ỉà loại cây cho dầu quan trọng thứ ba, sau đậu tương và cọ
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GlốNG THựC VẬT 105 dàu. Đế sản x u ít cây ỉai Fj thường ngưòi ta sử dụng tính khổng hợp của chúng. Nhưng đidu này khòng cho phép áp dụng ở qui mô lớn. Vỉ thế, c&n cổ một hộ thống kiểm soát cổ hiệu quả hơn sự th ụ phân thống qua tín h bát thụ. Tính bất thụ đực tế bào chất của cây củ cải cd th ể được chuyển qua c&y báp cải nhờ phương pháp lai hữu tính khác loài; con lai th u được m ặc dầu cố tính bất thụ đực nhưng cỡ quan sinh sản cái lại cố tính hữu thụ kém. Bằng phương pháp dung hợp protoplast ngưòỉ ta đa tạo ra sự ttao đổi lục lạp và sự tái tổ hợp ở ty th ể giữa củ cải và báp cải. TVong quá trinh chọn lọc các cybrid, người ta đă tách được các cây b ất thụ h ạ t phấn nhưng cơ quan sinh sản cái p h át triển binh thường và cổ khả n in g k ít hợp cao. ( + ) ị 6 Hình 5.1. Các sân phẩm dung hợp protoplast ^ữ a hai dạng bổ mẹ cồ sự khác nhau ve hệ gen ìạp thề (hình írHn) và ty thề ( hình sao).
106 la i tế Bà o s o m a N hững kết quả nghiên cứu trên báp cải và củ cải cho thấy, chl cđ một phàn nhỏ của genom ỉạ càn được đưa vào cây trồng, khi phàn đtí kiểm soát tính trạng kiểu như bất thụ đực t ế bào chát. Điều này cũng chứng tỏ rằng, hiện tượng tái tổ hợp ty thể cho phép loại bỏ đi những tính trạng khững tốt về mặt chọn giống. 5.8. MỘT s ó THÀNH T ự u CỦA KÝ THUẬT LAI TẾ BÀO SOMA Trong hơn hai thập kỷ qua người ta đă đạt được nhiều tiến bộ trong kỹ thuật dung hợp pĩX)toplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái sinh cây ở nhiều loài cây trùng. D ung hợp protoplast là con đường có hiệu quả để khác phục được nhiều khó khăn gặp phỉd trong quá trình lai hữu tính khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra được những cơ th ể có tái tổ hợp gen ở những loài cây đa bội hoậc có cơ quan sinh sản hữu tính phát triển kém. Sau đây là một số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối với việc cải tiến giống cày trồng. - ở chi cải Brassica, nhờ dung họp protopỉast mà người ta đã tái tổng hợp được loài Brassica napus từ hai loài B. oleracea và B. campestris. - ở thuốc lá, loài N.tabacum dễ nhiễm vi khuấn gây bệnh đốm lửa và nấm đen; trong khi đó, ỉoài N. rustica chống được các bệith trên. Con lai hữu tính giữa hai loài này bát thụ. Nhưng con lai soma giữa chúng lại hữu thụ và cổ khả nâng kháng các bệnh kể trôn. - ỏ các c&y họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast mà người ta đã tạo ra được con lai soma giữa khoai t&y với các loài khác của chi Solanum, vốn khổng lai được với nhau bằng phương pháp hữu tính, mà lại cố tính kháng bệnh cao. - ỏ cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protopỉast người ta đã tạo ra được con lai soma giữa cỏ ba lá {Trifolium repens) với cây Međi (Medicago sativa) và được sử dụng trong việc sản xuất chđt tanin tit lá. Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tuang trồng với các loài hoang dại - ví như giữa Glycine max với G. tommtella • cũng đã được tạo ra. - ở cây lOa, tròng một chựợRg trinh hợp tốG nghiên eđy giSa IIQII với TVưbng DH Tổng hợp N o ttỉn ỉ^am (Anh), nhờ sử dụng kỹ thuật dung hợp protopỉast Dgười ta đã tạo được m ột sđ giống lúa cổ tính bát thụ đực tế bào chất nhưng lại cđ khả năng chổng chịu s&u bệnh và nhiệt độ thấp. - Riêng đối với cây lúa mi, mậc dầu người ta đâ bỏ ra rất nhiều công sức để nghiên cúu nổ, nhưng cho đến nay những kết quả thu được trong lỉnh vực này còn rấ t hạn chế.
107 Chương 6 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ TRONG CHỌN GIỐNG THựC VẬT 6.1. Mỏ ĐẦU 6.1.1. Khái niệm chung Xét cà ở góc độ kỹ th u ật di truyền thực vật và sinh học thực vật ndi chung, kỹ th u ật chuyển gen là m ột công cụ có tiềm năng trong viêc giải quyết một số vấn đề hiện đại của sinh lý học, sinh hoá học, sinh học phát triển và di truyền học. Rố ràng kỹ th u ật chuyển gen thực vật sỗ tác động mạnh đến sự phát triển của kỹ th u ật tách dòng gen, giúp cho việc làm sáng tỏ hơn mối liên hệ giữa kiểu gen với kỉểũ hinb; và do vậy sẽ tạo ra những thành tựu to lớn mới trong việc xác định các gen có lợi trong các nghiên cứu lý thuyết và ứng dụng. Những bước phát triển của kỹ thuật chuyển gen thực vật đả bát nguồn từ những thành công của các hệ thổng chuyển gen ở động vật cđ vú và nấm men. 'I\iy nhiên, khác với ở động vật, kỹ thuẠt chuyển gen thực vật trở nên rất phức tạp do sổ lượng lớn của các loài và tính đa dạng của chúng. Mặt khác, bản thân qúa trỉnh này gập nhiều trở ngại lớn, như thành tế bào thực vật là một hàng rào ngàn chặn rát hiệu quả đối với sự xâm nhập của các phân từ ADN. Còn đối vói các tế bào sinh dục hay hợp tử thỉ ADN khổng cổ khả năng lọt vào được. Phữi non thi rất bé và được bao bọc bởi các lớp m àng cứng. Các tế bào của mữ ph&n sinh cũng không cho phép các gen hoạt động cổ th ể đi tới được. Hơn nữa, kỷ th u ậ t thụ tinh in vitro được sử dụng cho các thao tác đổi với noãn, hợp tử và tiền phôi ỏ thực vật vẫn chưa phải là dễ dàng như ỏ động vật. Biến nạp là quá trinh chuyển ổn định một đoạn ADN vào hệ gen nhãn thực vật. Ý nghía thực tiễn của nó ỉà tạo ra những tính trạn g mỏi hoặc cải tiốn nhữ ng tín h trạ n g đã cổ nào đó. Về m ột sổ phương diện nào đổ mà ndi, kỹ th u ật này cổ ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu tính. Nếu ỏ phương pháp lai hữu tính, để chuyển được m ột gen bay một số gen tứ giổng này qua giổng khác người ta phải tiến hành m ột qui trìn h lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đd, kỹ th u ậ t chuyển gen khổng những cho phép ta vượt qua được những trở ngại do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gen và nhận gen, mà còn cho phép cây trôn g tiếp nhận m ột cách nhanh chóng những gen mới do con ngưòi thiốt kế. Ta có th ể làm được điêu đđ bằng cách sử dụng các hệ thổng vectơ sinh học, nhưng khống phải là đều ctí th ể thực hiện được vối bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gen chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có "tính toàn thẽ" (totipotent) - m à khổng phải
108 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ỦNG DỤNG CỦA NÓ.. tế bào soma nào cũng cđ được khả n&ng đđ. Kế từ 1984, là lức người ta b át đầu gẫy tạo được cAy chuyển gen, đến nay kỹ thuật này đa có những bước tiến rẩ t lớn. Những thành cống của nổ khững chi giới hạn ở những cây m ang tính chất mỗ hình như thuổc lá và các cây họ cà, m à còn đạt được những kết quả ÚDg dụng d một số c&y trống quan trọng (xem bảng 6.1). vì thế, chúng ta có cơ sở để hy vọng rầng, trong tương ỉai kỹ th u ật gen sẽ trd thành một cống cụ hỗ trợ khỏng th ể thiếu được của chọn giổng thực vật. 6.1.2. Các c&y được chuyển gen Những cáy được chuyển gen, m à trong đổ các gen được di truyền theo kiểu Mendel, khống chỉ giới hạn d những c&y ” mố hình * như thuổc lá, Petunia, Arabidopsia mà còn bao gồm rấ t nhiều loỀũ c&y khác, như danh sách ở bảng 6 .1. dưới đ&y. Bảng 6.1. Các loài cây trỒDg đă đirọx chuytn gen Cây trồng Tãt Uệu tham kbảo Lúa (Oryza sattva ) Shimamoto et aL(ỉ989X Datta et ai. (1990 ) Ngô (Zea mạys) Donn et al Lùa mì Ợriticum aestivum) VasO and Vasll (»92). Đậu tucmg (Glycừư mac ) Htachee ct al. (1988), Chístou (1992> Bâng (Goísyplum hừsutum) Flroazabada et aL (1987),Periak et al. (1990> * Khoai tây (Solamm tuberoam) DeGrecí et aL (1989), Lavraon et al. (1990> Cà chua (LyccỊỉersiccn esculerưum) Timier et aL (1987), Smlth ct aL (»88, 19W> Cải d&i (Brassica napus) Gucrchc ct al. (1987), Radke ct àl (1988> Đậu Hà Lan {Pừum ỉotịvum) Puonti-Kaerias èt aL ((1990> Bắp cảl (Broĩstca oleraexđ) Toríyama et aL (1991> Đu đủ (Carlca papi^a) Fits^ et aL (19%> Tão tỉy {Aíabir panulà) Jatncs et íà. (]989> Lambert (1991> Cỏ đufll bâu Ợestuca anmdinacea) >Afang et aL (Ỉ992) Cỏ nốn ựìactylừ glomerata) Horn et aL (1988> Linh Bng {Medicago sattva) Shahin et aL (B86XH10 et al. (1991> Rau d íp {Lactuca sattva) Chupcau et aL (1989) Nho {ỵuis rupestrừ : V. vừiựera) Mullins et aL(1990> Mận (Prumis domatica) Maite et aL (&91> Dương (Pepulus dba X grandidenma) I^tỉxxid et aL (1987> Óc chố ựugìans regia) McGranahan et al. (1988). câm ciiuớng (Dianlhuỉ cayophyưus) Lu ct aL(1991> Dă yên (Peĩunia hybrtda) Van dcr Ktoí et aL (1988> Mặt khác, các gen được chuyến cũng khống chỉ ỉà những "gen mổ hinh”, như gen m ột số chât kháng sinh hay các gen chỉ thị màu, m à cả các gen kiểm soát những tính trạn g nông học như kháng virut, kháng sâu, kháng chát diệt cỏ, độ chín của quả, bất thụ đực.. ..
co sổ DI TRUYẾN CHỌN GIỐNG THựC VẠT 109 6.2. MỘT SÓ NGUYÊN TẤC SINH HỌC CỦA VIÊC CHUYỂN GEN c
110 KỸ THUẬT CHUYỂN QEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ d ụ n g c á c l o ạ i t ế b à o . k h á c n h a u v à c á c h p h á t h iỘ D c á c cAy b i ế n nạp. Bàng 6.2. Phưvng pháp thu nhận cây biến nạp từ các kỉều tế bào khác nhau Kiều tế bào Phiibng {diáp thu nhận cãỵ uến liạp 1/ T í bào nuồi cấy Sự phát sinh cơ quan hay phát sinh phối qua pha cailus. 2/ Pbũt chưa chín hỉ^ các tế bào Tái sinh cậy in vitro từ các dòng tế bào biĩn nạp. phân sinh cơ quan. 3/ Các tế bào ở pbũi chưa chín và Sự phát triền tỉếp tục của pbâl, chãi hay hca sẽ cho ra niột cây ktaảm. mô phân sinh hoa. Hạt pìứia cố nguân gốc từ các dòng t£ bào biến nạp được sử dụng chũ việc tạo ra các hạt cây đuợc biến nạp nhờ quá uình ưiụ tinh bình thường. 4/ Hạt phấn. Tạo các cây biến nạp trực uếp qua con đường thụ tinh V Ớ I hạt phấn nảy mầm hạy hạt phấn chín đang phát tilèn mà ADN của nố đầ b| xử lý bềến Ịiíp. 5/ Hợp tử. Phát triền trực tlỉp cây được biến nạp. 6 3. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ CÁC VECTỮ sử DỤNG TRONG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Cáp vectơ được sử dụng trong biến lịạp di truyỄn của các tế bào Eukaryote nổi chung hay của tế bào thực vật nổi riông đều cổ một sổ dặc điếm chung (hinh 6.1.A). P hần ỉớn các vectơ đdu cố chứa các thành phán sau; l)_gữn khdỉ động (promotor) thường có nguốn gổc hoặc liốn quan trực tiếp với thực vật, như CaMV-SSS-promotor, 2) m ột đồạn kết thúc (term inator), thưỜDg đang được dùng phổ biến 1& noa-terminator hay CaMV-35S- terminator, các đoạn kết này phải cd một trậ t tự tín hiộu polyadenin hoá như là AATTÂÂ hoặc ÂÂCCAÂ, giúp cho mARN được bền vững hơn; 3) một đoạn chịu trách nhiệm cho B V ù n » 3 'ch ử a Promotor tín hiệu oA aryote ^ poầyademnhoá GcnkhánB Gcn ĐoạnmAhoAgen kháng sinh VK cUtlii kháng kháng slidi chọn lọc vi khuẩn r r Hình 6.1. A) Sơ đõ chut^ cho vecta hiển nạp cùa tẽ bào Eukaryote. B) Chi tiết ve các gen chỉ thị dừng dto chọH lọc.
c o sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIÔNG THựC VẬT 111 quá trỉn h tái bàn, có nguồn gốc từ vi khuẩn, như CoỉEl; 4) một đoạn chứa m ột số trậ t tự nucleotit đặc trưng cho sự nhận biết của enzỵm giới hạn MCS (muỉticloning sites); và 5) các gen chỉ thị, cho phép nhận biết các tố bào được biốn nạp nhờ các quá trình chọn lọc ở t ế bào vi khuắn hoặc sàng lọc d các mô tái sinh. Các gen này cổ tính trội và cổ nguốn gốc từ vi khuẩn, m à hoạt động của chúng chịu sự kiểm soát của các promotor kiểu Eukaryote, thường là từ vinit khảm thực vật (hỉnh 6.1.B). Người ta thường dùng các gen chỉ thị kiểm soát tính kháng chất kháng sinh như kanamycin, m ethotrexat hay các chất diệt cỏ, như glyphosat hoặc bialaphos. Để cho việc chọn iọc cổ kết quả thi các tế bào được xử lý biến nạp phảỉ m ẫn cảm với các chất nổi trên ở nòng độ tương đối thấp. Còn các gen chỉ thị dùng để sàng lọc thường là những gen của vi khuẩn m ã hoá cho các enzỵm dễ phát hiện như chloramphenicol acetyl transferase, ^-glucuronidase, luciĩerase, nospalỉn sy n th ase và octopine synthase.' Thông thường, người ta hay sử dụng tín h kháng kanam ycin để làm kiểu hình chỉ thị cho việc chọn lọc và sự ctí m ặt của ^-glucuronidase để làm chỉ thị cho sự sàng lọc các tế bào thực vật được biến nạp. Các plasmid đã m ang những yếu tố chung như vậy lại có thêm những gen chỉ thị đặc biệt cho phép xác định sự biểu hiện của gen cần đựơc chuyển ỏ tế bào thực vật cổ th ế được dùng để chuyển gen trực tiếp vào hệ gen nhân của thực vật. Một m ặt khác, người ta lại thiết kế những kiểu vectơ đặc biệt, trong đó có sử dụng thêm m ột ph&n plasmid của vi ỵhnẳn AgrobacỀerium y k thực hiộn quá trỉnb biến nạp tự nhiôn thống qua hoạt động của loại vi khuẩn này. Loại vectơ này cổ chúc năng chuyển gen và phổ tái bản rộng, cho phép tiếp hợp giữa E xo li với Agrobacterium và duy trỉ được plasm id ở cả hai loại vật chủ đổ. K.4. CÁC PHUữNG PHÁP CHUYỂN GEN Hiện nay, cổ n hiỉu tài liệu đs cập tdi các phương pháp chuyển gen khác nhau ở thực vật. Tuy nhiên, ctí thể nẽu ra dưới đây M n phương pháp chính đa đựơc áp dụng thành công ở mực vật : 1- Biến nạp gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium (Binns, 1990). 2- Biến nạp trực tiếp qua protoplast (Paszkowski, 1989). 3- Biến nạp bàng súng bắn gen - gene gun hay biolỉqtics (Sanford,1988). 4- Biến nạp bàng vi tiêm - microinjection ( Schnorí et al.,ỉ991 ). 6 .4 .ỉ . C h u y é n g e n n h ờ iAgmbacterium Vào đầu thố kỷ XX ngưòi ta đã biết đỂa hai loài vi khuẩn sống trong đSt là Agrobacterium tumefaciens và A rhừogenea gây ra các bộith kh(fi u hỉnh chđp và lổng td d phần cổ rS của nhiều cây hai lá m&m. v s sau, người ta đ& xác định được ràng, hai ỉoại vi khtiẩn này chứa hai loại plastnid cổ kích thước Idn là Tí-plasmỉd , gây ra kh
112 KỸ THỤẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ. . . và D. Vùng B cổ liỆn quan đến sự tái sinh. Vùng c cd liéa quan đến sự tiếp hợp. Vùng A luốn iudn được truyền sang tẽ bào thực vật nên cd tên là T-ADN (transĩerred ADN) - hlnh 6.2.1 l ỵ đây ctí hai hộ gen : 1) hệ gen gây khối u onc (oncogenic), ntí chứa ít n h ất 3 gen chịu-^ách nhiệm tổng hợp các phytohormon auxin và cytokỉnin (hỉnh 6.2C) và do đổ cd liốn qnan đến việc sản sinh ra và duy trỉ sự phân chia tế bào liên tục; 2 ) hệ A ■ ■ M T -A P N : vàosaAỵ V te « d ỊỊ« c c h u ]r6 i kbỐlD(Oiic) Phtagiii v à o d k ỹ đ ỉs« y k M lo VàngtwmgdAiitctai« chomviTI-planM VừDgslV
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 113 gen m ã hoá cho một số enzym điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các axit am in hay đưòng, gọi là opine. Hai loại enzym đã được nghiỗn cứu kỹ n h ất là octopine synthase và nopaline synthase. Vùng D ctí tên gọi là vùng độc (virulence region), chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng tro n g việc chuyển T-ÂDN vào hộ gen nhAn của tế bào thực vật. Ngoài ra, mỗi Ti- plasmid còn chứa các gen'nầm ngoài vùng T-ADN mã hoá cho các enzym phân giải opine dế làm nguốn dinh dưỡng cacbon và nitơ cho vi khuấn. Dưới đfty ta sẽ xem xét chỉ tiết hơn về cáu tạo và chức năng của vùng T-ÁDN và vùng vir. • T-ADN và các trật tự biên 25bp Vùng T-ÁDN cố kỉch thưỏc từ lOkb đến 20kb, Đ ằ m kẹp giữa hai trẠt tự 25bp lặp iại khỗng hoàn chỉnh gọi là biên trái ( Ieft border ==LB) và biên phải (right border sR B ). 'Ibàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tổ c&n thiết để định hướng cho sự chuyển ÂDN. Viộc m ất đi 6bp đàu tiên hoặc lObp cuổi cùng trong sổ 25 bp đều ngăn cản sự chuyến của T-ÂDN. Quá trình chuyển T-ADN được bát đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB. Sự định hướng này là rấ t quan trộng, nếu khổng việc chuyển sỗ kém hiệu quả. IVong các gen được m ã hoá ở vùng T-ÂDN cố 3 gen rấ t quan trọng trong việc phát triển khổi u : một gen m ã hoá cho enzym AMP- isopentenyl trạnsferase và 2 gen mã hoá cho enzjrm tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2mono oxygenase và acetamỉd hydrolase ). Sự hoạt động của các gen này tạo điều kiện cho sự phát triển củĩi t ế bào thực vật cổ sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Dặc điểm này đựợc sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các tế bào khống được biến nạp. Cần lưu ý là, khống cổ một gen nào trong vùng là cần th iết cho việc chuyển của T-ADN. Việc chuyển đi của vùng này m aog tính thụ động. IXiy nhiẽn, T-ADN trong các khổi u thực vật thưòng có kích thưóc ổn định như trong Ti- plaamid. Vì thế cd thể coi mỗi T-ADN là 1 đơn vị được gấn vào hệ gen thực vật Hình 6.3. NoợẨ động của các gen Ti~plasmid ở ịẽ bào sinh dưỡng cửa vi khuấn Agrobaderium, khi gen vir được càm ứng bởi chãt acetosyringon liẽt ra từ vít thuung cứa cây.
114 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ. m à khống c&n cổ sự biến đổi nào. • Vùng vir Chính hoạt động của vùng vir đđng vai trò quan trọng cho việc chuyển T-ADN sang tố bào thực vật. Nó lớn khoảng 40kb và bao gồm 6 operon (hinh 6.3): virA, B, D và G là hoàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính; còn virC và £ thi liên quan đến việc hỉnh thành khối u. Trừ virG và Â còn các operon khác đều là đa cistron. Nói chung, gen virÁ biểu hiện ở mọi điều kiện; gen virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng th ể hiộn r á t m ạnh ở các dịch chiết từ các mô bị thương ưỉn. H oạt động của các operon này cổ li6n quan chặt chẽ đến sự có m ặt của các hợp chất phenol được tiết ra từ vết thương của cây. Từ vốt thương cây thuốc iá người ta đă tinh chế và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và aỉpha hydroxyacetosyringon. • Quá trình chuyển T-AĐN Doạn T-ADN muốn được chuyển, trưốc tiên nd cần phải được hoạt hoá. Chính hoạt động của các gen vir đdng vai trò này. Hiện tượng này xảy ra khi Agrobacterium bát dầu tiếp xúc với hạp chát chứa phenol được tiết ra tỉí vết thương của cây họăc từ các tế bào nuôi cấy hay protoplast. Đàu tiẽn là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gen Tế bào ở vùng b| thuơi^ tổn 0 o acetoseríngon chemotaxis Hình 6.4. Những sự kiện chính xảy ra khi các gen vir cùa Ti-plasmừi được cảm ứng bởi hạp chất chứa phenoỉ -aceiosyringon dược tiết ra từ vếi íhương cảa cây. 1) Acetosyringon được tiết rd từ vết thương của cây. 2) Acetosyringon hoại hoá protcỉn vỉrA rồm ờ màng tế bồo vl Ichuằn. 3) Proỉeỉn vỉrA được hoạt hoá làm ưiay đồỉ proteỉn vỉrG quá trình phosphoiyl hữá. 4) Gen vỉrG đă bỉ biến đỗỉ gắn vào gen chi huy cửa các gen vỉr khác gây ra sự hoạt hoá hoặc đỉều chỉnh đốỉ VỐI chúng.
G õ Sỏ DI TRUYEN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 115 virÂ (protein virÂ). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacteriurh, đdng vai trò như là m ột chát thụ cảm đối với acetosyringon cd trong mữi trường. Tín hiộu này sỗ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (cđ lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gen virG. Protein virG sau đố lại gán vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen vir khác. Bầng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hoá ỉàm tãng quá trinh phỉèn m& của chinh nó, đồng thời làm giảm quá trỉn h này của các operon B, c, D và E (Zambryski, 1988) - hinh 6.4. Trong tiến trin h chuyển T-ADN, d giai đoạn đầu xuát hiện các vết cát Ti-plasmid tại 2 trậ t tự biên 25bp, ở vị trí giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư của mạch đơn nằm phía dưói (hỉnh 6.5). Từ đố 1 mạch đơn T-ADN được giải phổng ra khỏi Ti-plasmid và thay th ế vào đó là 1 mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’- 3’, bất đầu tií chỗ đứt của trậ t tự biên phải (RB). Diều này giải thích tại sao trậ t tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyến T-ADN. Operon D chủ yếu m â hoá m ột loại endonuclease tạo ra các vết cát nổi trôn tại hai trậ t tự biên. Sự hỉnh thành m ạch đơn T-ADN được tăn g cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với 1 hoặc 2 protein do gen virC mâ hoá. Còn protein gen virE2 thl gấn vào mạch đơn T-ADN sau khi được cắt ra, để làm cho nd ổn định trong quá trình chuyến vào nhân tế bào thực vật. Phức hỢp protein- mạch đơn T-ADN là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-ADN sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium. Còn gen virB m ã hoá cho ít n h ất 11 protein để hỉnh thành nên một cầu nối, cho phức hợp trên được chuyểri từ Agròbactèrìum sahg tế bàố thực vật. Hình 6.5. Các sự kiện xảy ra ở mức pliân tử khi chuyển T-ADN vào ứ bào thực vật.
116 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ ÚNG DỤNG CỦA NÓ. . • Các h ạ i vectơ đựa trẽn Tĩ-pìasmid Ti-plasmid khổ được dùng trực tiếp trong các th í n ^ iộ m chuyến gen, vỉ nd cổ kích thưốc lớn và m a ĩ^ các gen gây khối u; hơn nữa ADN của Ti-plasmid cố quá nhiều chỗ đế các enzym giới hạn cổ th ế cát, trong khi đđ người ta chỉ cần một số ít vị trí như vậy m à thdỉ. l\iy nhiên, Ti-plasmid cổ th ể cung cáp cho ta những y íu tổ cán thiết để thiết kế những vectơ hữu ích cho kỹ th u ật chuyển gen. Thường người ta hay sử dụng các Ti- VIR RES C o l EI B MSC VIR RK2 oriT Hình 6.6. Sơ đ ĩ các kệ lầổi^ vecta tiÌH hợp (A) và nhị thê (B): Vlr vùng gậy độc; HCM : các vùng tuxmg đ&ng, mà trong phạm vi đó sự tái t& hợp (trao đối chéo) cố tbề xảy ra d&i (fên S»Ị hợp nhất giữa lãi piasmid; RB và L& các đoạn trật tự bi£n pbải và u â 2Sbp d á T-AE^ ( LB boặc RB hoặc cả hai có thề cố ở vectơ tnng glan^ MCS: đoạn mang các tr^ tự nudeodt đề enzym giối hạn nhận béỄt; PTM: gcn chi th| sàng lọc biến ở tí bào Uiực vật; RES: gen chi thi Mỉ^g chất kháng sinh đề chọn lcc ỏr tế bào vĩ Uiuần; OrfT:Ãèni vận chuytn; Ecdl: vùng klỊổi đầu ^ tái bản, từ plasmid ColÈÍ; RK2; vùng có phõ tái bản rộng ờ các vật chủ, cố ngudn gốc từ piasmid pRK2.
co sỏ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THựC VẬT 117 plasmid, mà trong đó vùng T-ADN gây khối u đã bị tách bỏ và thay th ế vào đđ là các gen trội chỉ thị cho chọn lọc - thường là các gen vi khuẩn kháng chất kháng sinh, như kanamycin. Trước đây, người ta hay dùng các gen chỉ thị được kiểm soát bởi prom otor và các tín hiệu polyadenin hoá được tách ra từ các gen vùng T-ADN như octopine synthase hay nopaline synthase. Gàn đây, người ta hay sừ dụng các promotor m ạnh hơn được tách ra từ virut khảm báp cải, như CaMV35S và CaMV19S. Tuy nhiên, kích thước lớn của Ti- plasmid rấ t khó khăn cho việc gán trực tiếp một phân đoạn ADN vào vùng Vectơ liên hợp Vectơ trung gian A pGV3850 PG V 1103 Vỉr region GenctóthỊ chọntọcỗ pBR322 TB thục vật BOB-ODCOgemic iCm' nos ^ịịBSSSBĩP ^ Genchỉ thi chọn lọc ôvk ____ Tái tổ hợp các d o ạ n tư ơ n g đồng Vectơ liên hợp kấông gây khối u Tí plasm ld pGV3850::1103 LB D— tSBSỀ— fc - ' » ' A p' nos-npl II gcn B BtếnnạpI ____Tiếp hợp__ Ã ' pGVlỉ03 ^ ^ L Tiếp hợp Tái lổ hợp c á c đoạn tương đỏng 'N. I rb O " "■ POV1103 pCVSáso > Agrobacterỉum H ình 6.7. A ) Vectơ iiẽn ỉtợp pCVSSSỠ và vectơ (rung gian p G V IlO S . B) Chuẩn bị mội vecia liễn hợp đ ê gày biển nạp.