Giáo trình hóa sinh động vật phần 3

Chia sẻ: Than Con | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

95
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sau đó phản ứng với PRA tạo thành glycinamide Ribonucleotide (GAR) phản ứng tiếp theo bởi formin hoá từ acid N5, N10 - methyl-tetradrofolic thành formyl glycinamide ribonucleotide (formyl-GAR). Sau đó amin hoá nhận từ glutamine để cho formyl-glycinamide ribonucleotide (formyl-GAM), chu trình được đóng lại tạo nên hợp chất vòng imidazol là 5aminimidazol ribonucleotide (AIR). Carboxyl hoá hợp chất này tạo thành acid 5-aminimidazol-4-carboxylic ribonucleotide (cacboxy-AIR). Amide tương ứng là 5-aminimidazol-4carboxamide ribonucleotide (AICAR) được tạo thành qua 2 phản ứng với hợp chất (hình 2.20). Amin hoá IMP thành AMP tiến hành qua 2 bước với sự tạo thành...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình hóa sinh động vật phần 3

Sau đó phản ứng với PRA tạo thành glycinamide Ribonucleotide (GAR) phản ứng tiếp theo bởi formin hoá từ acid N5, N10 - methyl-tetradrofolic thành formyl glycinamide ribonucleotide (formyl-GAR). Sau đó amin hoá nhận từ glutamine để cho formyl-glycinamide ribonucleotide (formyl-GAM), chu trình được đóng lại tạo nên hợp chất vòng imidazol là 5- aminimidazol ribonucleotide (AIR). Carboxyl hoá hợp chất này tạo thành acid 5-amin- imidazol-4-carboxylic ribonucleotide (cacboxy-AIR). Amide tương ứng là 5-aminimidazol-4- carboxamide ribonucleotide (AICAR) được tạo thành qua 2 phản ứng với hợp chất (hình 2.20). Amin hoá IMP thành AMP tiến hành qua 2 bước với sự tạo thành hợp chất trung gian acid Adenine succinic (hình 2.21). Trong phản ứng này nhóm amin của Aspartate được chuyển đến C-6 của IMP để tạo thành AMP. Sự tạo thành GMP từ IMP cũng phản ứng qua 2 giai đoạn, trong đó xantoseine 5’- monophosphate (XMP) được tạo thành trước, sau đó là GMP (Hình 2.21) Hai mononucleotide purine AMP và GMP bị phosphoryl hoá bởi kinase qua giai đoạn diphosphate cho ATP và GTP AMP + ATP ADP + ADP GMP + ATP GDP + ADP ADP + ATP ATP + ADP GDP + ATP GTP + ADP Ngoài các con đường kể trên, các nucleotide còn có thể được tổng hợp từ các base purine kết hợp với ribose-1’- phosphate dưới sự xúc tác của nucleoside phosphoridase tương ứng để tạo thành các nucleotide và acid phosphoric. Các phản ứng này thuộc kiểu transglycosil hoá Hypoxanthine + Ribose-1-phosphate inosine + PVC Guanine + ribose-1-phosphate guanoseine + PVC Các nucleotide được hình thành lại bị phosphoryl hoá với sự xúc tác của phosphokinase (phosphotransferase) tạo thành nucleotide tương ứng. Adenoseine + ATP AMP + ADP Ngoài ra các purine tự do kết hợp vói PRPP dưới tác dụng của nucleotide pyrophosphate kinase (chuyển gốc phosphoriboseil) tạo thành các nucleoside 5’- P Adenine + PRPP AMP + PP (Pyrophosphate) Guanine + PRRP GMP + PP Hypoxanthine + PRPP IMP + PP 6.2.2. Sinh tổng hợp nucleotid pyrimidine Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 63 http://www.ebook.edu.vn
Khác với sinh tổng hợp nucleotide purine, chu trình pyrimidine được tổng hợp trước rồi kết hợp với ribose –5- phosphate. Bằng phương pháp nguyên tử ghi dấu đã xác định được nguồn gốc của các nguyên tố tạo nên pyrimidine (hình 2.22). Sự tổng hợp UMP có hàng loạt các phản ứng Enzyme xảy ra tạo thành mononucleotide pyrimidine đầu tiên (Uridine 5’-monophosphate, UMP) được giới thiệu ở hình 2.23. Trước tiên là acid aspartic kết hợp với carbamoyl phosphate với sự xúc tác của carbamoyl transferase tạo thành carbamoyl aspartate. Sau đó vòng pyrimidine được hình thành do dihydro-orotase tạo nên acid dihydro- C Amoniac orotic, tiếp tục dehydrogenase hoá tạo N Aspartate thành sản phẩm pyrimidine trung gian quan trọng là acid orotic. Dưới tác Co2 dụng của pyrophosphoridase, acid- orodic liên kết với gốc ribose-5- phosphate từ PRRP tạo nên Oridin 5’- monophosphate (OMP) và giải phóng Hình 2.22: Nguồn gốc các nguyên tử trong pyrophosphate. Decarboxyl hoá OMP chu trình pyrimidine tạo thành Uridine 5’-monophosphate (UMP) là nucleotide pyrimidine đầu tiên . Carbamoyl Carbamoyl Dihydro-orotate Orotate phosphate aspartate Hình 2.23. Con đường sinh tổng hợp pyrimidine Glutamin Orotidic5' - monophosphate (OMP) Hình 2.23. Sự tạo thành pyrimidine. UMP dưới tác dụng của kinase biến đổi qua uridine 5’-P (UDP) thành uridine 5’- triphosphate (UTP) Sinh tổng hợp dẫn xuất cytosine. Sự biết đổi uracil thành cytosine ở giai đoạn nucleoside triphosphate do Enzyme CTP syntheta xúc tác Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 64 http://www.ebook.edu.vn
UTP + NH3 +ATP ---> CTP + ADP + PVC 6.2.3. Sinh tổng hợp desoxyribonucleotide Sự biến đổi ribose thành desoxyribose xảy ra ở mức độ nucleotide, không làm đứt liên kết glycoside. Ở E.coli sử dụng cơ chất là ribonucleoside diphosphate, ở Lactobacillus leichamnii sử dụng ribonucleoside phosphate và đòi hỏi Enzyme cobam. Sự hiểu biết về cơ chế biến đổi trong tế bào động vật không nhiều, nhưng hình như không cần cobamide và giống với E.coli. Cơ chế sự biến đổi CDP thành dCDP trong Ecoli có hệ Thioredoxyn. Thioredoxyn là protein có chứa lưu huỳnh với 108 gốc acid-amin, nó được khử bởi NADPH dưới tác dụng của Thioredoxyn reductase. Thiredoxyn khử CDP thành dẫn xuất desoxy, nó tự loại oxy đến Thioredoxyn. dUMP được hình thành bởi deamin hoá dCMP dưới tác dụng của dCMP deaminase. Con đương biến đổi đầy đủ từ UMP thành dUMP có thể như sau: UMP ---> UTP ---> CTP --->CDP ---> dCDP ---> dUMP Ở E.Coli khôngcó dCMP deaminase, dUMP được hình thành từ UMP bởi đường vòng sau: UMP ---> UDP ---> dUDP --->dUTP ---> dUMD (Hình 2.24) 6.2.4. Sinh tổng hợp các dẫn xuất thymine. Các bước cơ bản trong sự tạo thành nucleotide thymine là sự methyl hoá desoxyuridine monophosphate (d UMP) thành sản phẩm thymidine monophosphate (d TMP) (d UMP d TMP) dưới tác dụng của Enzyme Thymidilate synthetase. Quá trình xảy ra qua một số giai đoạn. Nguồn cho nguyên tử carbon ở C-5 là acid N 5, N 10- methylen tetra hydrofolic, phản ứng như sau: N5, N10-methylen tetrahydrofofate+ d UMP---> dihydrofolate + d TMP Dihydrofolate lại tạo thành tetrafolate dưới tác động của hydrofolate reductase. Sự tạo thành nucleoside triphosphate. Glutamine Aspartate Carboamoyl phosphate PRPP + glicine Carbo + Glutamine Kháng + Aspartate Azaserin và acid folic Azaumaxil Fluorodexi eridin Kháng acid folic Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 65 http://www.ebook.edu.vn
Hình 2.24: Con đưòng phức tạp sinh tổng hợp desoxyribonucleoside triphosphate. Cơ chế sử dụng lại biểu thị bằng đưòng chấm. Hoạt động ức chế của một số chống phân giải bằng nét đậm. Trong sinh tổng hợp DNA và RNA cần có các ribonucleoside 5’-triphosphate và desoxyribonucleoside 5’-triphosphate, chúng được hình thành từ các nucleoside monophosphate tương ứng bởi các Kinase thích hợp với sự có mặt của ATP. Ở giai đoạn này, các Kinase quan trọng là biến đổi thymidine thành triphosphate của nó (dTTP). Sự biến đổi này qua bậc thang phosphoryl hoá. Mỗi bước được xúc tác bởi một kinase riêng. Thymidine ---> d TMP ---> d TDP ---> d TTP. 6.2.5. Sinh tổng hợp acid desoxyribonucleic (DNA). Sinh tổng hợp DNA là quá trình sao chép chính xác phân tử DNA đầu tiên. Trên cơ sở mô hình phân tử DNA của Watson và Crick. Sự tái tạo DNA xảy ra bằng cách liên kết hydro giữa 2 chuỗi bổ sung bị đứt và tách rời nhau ra. Mỗi một chuỗi có khả năng kết hợp với các desoxyribonucleotide triphosphate tự do, tạo thành chuỗi polyribonucleotide mới khớp hợp với chuỗi ban đầu. DNA mới giống với DNA ban đầu về thành phần và trật tự các nucleotide . Cơ chế sao chép bán bảo tồn. Quá trình tự sao, một sợi giữ nguyên, một sợi mới được tổng hợp được gọi là cơ chế sao chép bán bảo tồn, điều này đã được Meselson và Stahl chứng minh bằng cách nuôi E.coli trong môi trường có nitơ đánh dấu 15 N (15 NH4Cl), DNA được tồng hợp chỗ chứa 15N. Sau đó nuôi cấy ở môi trường 14 N thì thấy DNA ở thế hệ thứ nhất là dạng lai, gồm một sợi 15 N và một sợi 14 N. Thế hệ thứ 2 có 50% DNA dạng lai và 50% dạng chỉ có 14 N (các băng của DNA tìm thấy bằng li tâm nồng độ CsCl) (Hình 2.25, 2.26) Nhẹ hơn Nhẹ Trung bình Nặng Nặng hơn Hình 2.25: Các băng DNA của thí nghiêm Meselson và Stahl. Cơ chế của quá trình tự sao DNA. Enzyme tổng hợp DNA. Năm 1956, Kornberg đã tách được Enzyme DNA polymerase từ E.coli. Enzyme này có khả năng xúc tác quá trình tổng hợp DNA từ các desoxyribonucleoside triphosphate. Sau đó người ta đã tách được Enzyme này từ vi khuẩn, thực vật và động vật. DNA polimenase xúc tác sự tạo thành liên kết phosphodiester giữa nhóm 3’-OH ở đầu sinh trưởng của chuỗi DNA (mồi) và nhóm 5’-phophate của desoxyribonucleoside Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 66 http://www.ebook.edu.vn
triphosphate mới (hình 2.26) sự sinh trưởng theo chiều 5’-->3’. Trong quá trình này có DNA làm khuôn. DNA khuôn thực hiện nguyên tắc ghép đôi bổ sung: A-T, C-G (hình 2.27). Các giai đoạn sinh tổng hợp DNA Mở xoắn: dưới tác dụng của DNA derulase, xoắn kép DNA được mở có 1 loại protein SSB (Single StDNA Binding) gắn vào sợi đơn DNA để phân tử DNA luôn ở dạng mở. Tổng hợp RNA mồi: Dựa vào khuôn sợi đơn DNA, một đoạn RNA mồi được tổng hợp vói sự xúc tác của RNA-polymerase. Sự kéo dài sợi DNA: Sau khi có RNA mồi, RNA mồi sẽ tạo ra nhóm 3’-OH tự do, để sau đó DNA polymerase bắt đầu hoạt động tái bản. Mỗi một nucleoside triphosphate được ghép vào bằng liên kết phosphodiester ở C-5’, chiều tổng hợp là 5’---> 3’. Như vậy có 1 sợi được tổng hợp liên tục gọi là sợi hướng dẫn, còn sợi kia tổng hợp từng đoạn ngắn cùng với sự mở xoắn, gọi là sợi đi theo. Từng đoạn ngắn đó gọi là đoạn Okazaki (tên nhà bác học Nhật bản phát hiện chúng ở E.coli được công bố năm 1968). Ở E.coli đoạn ngắn này có hằng số lắng 8-10s, chiều dài 1000-2000 nucleotide, đoạn 10s có thể được tạo thành từ vài đoạn 3-5s. Ở tế bào động vật đoạn này ngắn hơn nhiều, nó có khoảng 100-200 gốc nucleotide, hằng số lắng 4-5s. Ở giai đoạn này RNA mới được loại bỏ bởi endonuclease, và đoạn đó được tổng hợp lại bởi DNA polymerase. Các đoạn Okazaki được nối với nhau bằng DNA-ligase (Hình 2.28; 2.29; 2.30). 2+ (dNMP)n+dNTP ⎯Mg →(dNMP) n+1 + PP ⎯⎯ DNA Polimerase DNA mồi Khuôn Mồi 2.27. Sự sinh trưởng của DNA Hình Hình 2.26. Cơ chế hoạt động của DNA Polimeraseng hợp acid ribonucleic (RNA). 6.2.6. Sinh tổ Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 67 http://www.ebook.edu.vn
Sự biểu hiện thông tin di truyền là sự truyền tín hiệu từ DNA sang RNA. Nhìn chung, sợi RNA có thể hoàn toàn giống với sợi DNA chỉ khác là có nhóm hydroxyl ở vị trí 2’ và uracil thay bằng thymine, song RNA có cấu trúc đa dạng hơn DNA và kèm theo sự khác nhau về chức phận. Phân tử RNA không thể hướng dẫn và thông tin nhanh chóng di truyền như DNA, RNA còn có thể hoạt động như là chất xúc tác. Sự phát hiện ra RNA còn có chức phận xúc tác đã làm thay đổi rất nhiều của từ “Enzyme”. Nhiều RNA là phức chất của protein, tạo nên cơ chế phức tạp với nhiều chức phận khác nhau. Điểm khởiđầu 5’ Điểm khởiđầu 3’ RNA polymerase phụ thuộc DNA RNA mồi 5’ 5’ 5’ mở xoắn Tổng hợp Cắt rời RNA và Hình thành chuỗi DNA 1 sợi RNA DNA mới thay thế bằng DNA Enzyme derulase Hình 2.29. Khởi đầu tái bản RNA Polimenrase Mỗi thứ 2 RNA mồi Primenson Relicase Mỗi thứ 1 Primenson DNAliên kết protein (SSB) Tổng hợp DNA bởi Primase DNA - plimerase Mồi RNA mới HoloEnzyme RNA mồi hình thành DNA Polymerase III Loại bỏ RNA mồi bởi DNA endonaclease hình thành I Polymerase đoạn okaseki Hình 2 Ligase Sợi dẫn Hình 2.28: Tái bản DNA Hình 2.30. Chạc ba tái bản Sợi đi đường theo Nối lại bởi Ligase Hình 2. 30. Các đoạn Okazaki nối với nhau Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 68 http://www.ebook.edu.vn
Tổng hợp RNA phụ thuộc DNA. Ở sinh vật nhân xơ (procaryote) chỉ có 1 loại Enzyme RNA polymerase phụ thuộc DNA thực hiện sự sao chép. Ở sinh vật nhân chuẩn (Eucaryote) có 3 loại RNA polymerase, mỗi loại có 1 chức năng riêng. Phân tử RNA được hình thành trong nhân, sau đó chuyển ra tế bào chất để hoạt động. Sự sao chép RNA chỉ thực hiên trên 1 sợi của DNA, hướng sao chép từ 5’-P -->3’-OH. RNA -Polymerase xúc tác tổng hợp RNA từ các ribonucleotide 5’-phosphate (ATP, GTP, UTP và CTP). Sự tăng trưởng sợi RNA bằng cách kết hợp các ribonucleotide ở đầu 3’-OH của chuỗi RNA (MMP)n + NTP ---> (MMP)n+1 + PP RNA Kéo dài RNA Hình 2.31. Sự sao chép RNA Sự sao chép chỉ xảy ra trên 1 sợi DNA làm khuôn, mỗi 1 nucleotide liên kết để tạo thành RNA mới được lựa chọn theo nguyên tắc cặp base bổ xung Watson-Crick. Uridine (U) trong RNA đối diện với Adenine (A) trong khuôn DNA, Adenine đối diện với Thymine, Guanine và Cytosine trong DNA đối diên với Cytosine và Guanine trong RNA mới. Bong bóng phiên mã RNA polymerase Tháo xoắn Sợi không làm khuôn Sợi khuôn RNA-DNA lai Hướng phiên mã Siêu xoắn âm Siêu xoắndương Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 69 Hướng phiên mã http://www.ebook.edu.vn
Sợi DNA dùng để làm khuôn cho tổng hợp DNA gọi là xơi khuôn hay sợi trừ (-). Sợi Hình 2.32: Sự phiên mã bởi RNA polymerase trong Ecoli. Khác với DNA polymerase, RNA polymerase không cần mầm để khởi đầu tổng hợp. Sự khởi đầu tổng hợp ở 1 đoạn đặc biệt gọi là gen khởi đầu (RNA được tổng hợp vẫn có 5’- triphosphate) ở gốc GTP và ATP trong quá trình phiên mã). Trong quá trình phiên mã tạo thành đoạn xoắn kép giữa RNA và DNA khuôn gọi là đoạn xoắn kép lai RNA-DNA (hình 2.32a). RNA trong sợi xoắn kép này lại được tách ra khỏi DNA. Sự tổng hợp RNA xảy ra trên một sợi DNA, nên sợi xoắn kếp DNA phải tháo xoắn, vùng tháo xoắn để phiên mã như là “bong bóng”. Ở E.coli vùng này khoảng 17 cặp base được tháo rời. Sự tháo DNA ở phía trước và cuộn lại ở phía sau. Quá trình này làm cho phân tử DNA quay đáng kể (hình 2.32 b), nếu quay về phía trước chuỗi là siêu xoắn dương, và nếu quay về phía sau là siêu xoắn âm. Ở E.coli sự phiên mã với tốc độ 50 nucleotide 1giây. DNA bổ sung với sợi khuôn gọi là sợi không làm khuôn hay sợi cộng (+), các base của nó rất giống với RNA được phiên mã chỉ khác U thay T. Sợi không làm khuôn thỉnh thoảng còn gọi là sợi mã hoá (hình 2.33) (5’) CGCTATAGCGTTT (3’) sợi DNA không làm khuôn (+) (3’) GCGATAT CGCAAA (5’) Sợi DNA khuôn (-) (5’) CGCUAUAGCGUUU (3’) RNA phiên mã. Hình 2.33: Hai sợi bổ sung của DNA được xác định rõ chức phận trong phiên mã. Cấu trúc và hoạt động của RNA polymerase. Ở Ecoli RNA polymerase đơn phụ thuộc DNA tổng hợp các loại RNA khá lớn (KLPT: 390.000) phức chất Enzyme này có 5 tiểu đơn vị là lõi Enzyme và 1 tiểu đơn vị thứ 6 là δ (xích ma) hày δ 70 (KLPT: 70 000) nó liên kết tạm thời với một lõi và hướng dẫn Enzyme đến vị trí khởi đầu đặc biệt trên DNA, 6 tiểu đơn vị này tạo thành holoEnzyme RNA polymerase (hình 2.34) β’ ω α α δ β Tiểu đơn vị Lõi Enzyme TLPT: α - 36.500, β - 151.000, β’ - 155.000 ω - 11.000, δ - 70.000. Tiểu phần β được cho rằng là vị trí xúc táctổng hợp RNA Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 70 http://www.ebook.edu.vn
Hình 2.34. HaloEnzyme RNA polymerase. Yếu tố δ còn gọi là yếu tố khởi động (yếu tố mồi) gắn vào RNA polymerase để nhận biết mã (codon) khởi đầu sao chép. Khi bắt đầu sao chép nó sẽ tách rời yếu tố ρ (rô) còn gọi là yếu tố kết thúc. Khi kết thúc thì yếu tố ρ được giải phóng (hình 2.35). RNA polymerase trượt trên DNA để tổng hợp RNA theo hướng 5’-->3’. Đến vị trí kết thúc, yếu tố ρ gắn vào RNA polymerase để nhận biết mã kết thúc và yếu tố ρ được giải phóng, RNA polymerase tách khỏi sợi khuôn DNA. Vùng khởi động. Hình 2.36: 5 đoạn gen khởi đầu của E.coli, các đoạn gen này ở sợi mã hoá (không làm khuôn) và đọc từ 5’ → 3’. Những vùng đệm số lượng nucleotide (N) có thể thay đổi. Bắt đầu Vùng –35 Vùng Vùng-10 Vùng đệm đệm RNA +1 Trp TTGACA 17N TTAACT 7N A tRNA+Ty TTTACA 16N TATGAT 7N A r Lac TTTACA 17N TATGTT 6N A Rec A TTGATA 16N TATAAT 7N A Dra CTGACG 18N TACTGT 6N A B,A,D Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 71 http://www.ebook.edu.vn
Đoạn TTGACA TATAAT chung Sự khởi đầu tổng hợp RNA trên phân tử DNA là vùng đặc biệt ở vùng đó phân tử RNA polymerase liên kết với DNA và được gọi là gen khởi đầu. Ở vị khuẩn gen khởi đầu là 2 đoạn ngắn với khoảng 10 và 35 cặp base (Hình 2.36) RNA được tổng hợp là +1. Các đoạn gen khởi đầu không giống nhau, nhưng cũng có nhiều nucleotide chung. Phần lớn các gen khởi đầu của E.coli và vi khuẩn ở vùng –10 (còn gọi hộp Pribonow) là (5’) TAAAT (3’) và ở vùng –35 là (5’) TTGACA (3’) m-RNA luôn luôn tạo ra AUG khởi đầu, phía trước AUG có một đoạn không ghi mã cho protein nào cả, chỉ để gắn vào ribosome. Gen khởi đầu RNA polymerase RNA polymerase hình thành phức hợp đóng ở vùng -35 Polymerase di chuyển đến vùng - 10 DNA được tháo ra tạo thành phức Sợi khuôn Nucleotide triphosphate purine Bắt đầu tổng hợp RNAm Tiểu phần ô tách ra khỏi polumerase vượt qua khởi NTP đầu PP ∞ Hình 2.37: Các giai đoạn trong sự khởi đầu phiên mã bởi RNA polymerase E.coli – RNA polymerase liên kết với gen khởi đầu cần phải 2 giai đoạn: Sự tạo thành của phức hệ đóng và mở – Tổng hợp RNA thông tin hầu như luôn luôn bắt đầu với nucleotide purine (Pu) – N là nucleotide bất kỳ. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 72 http://www.ebook.edu.vn
YÊU CẦU CẦN NẮM CHƯƠNG II: ACID NUCLEIC VÀ CƠ CHẾ DI TRUYỀN TẾ BÀO Khái niệm về acidnucleic, vai trò của các nucleotit tự do. Cấu trúc bậc I bậc II của acidnucleic. Phân loại acidnucleic Câu 1: Công thức của ATP? Vai trò của ATP trong hoạt động sống của động vật? Câu 2: Trình bày cấu trúc bậc I của axít nucleic? Codon, Anticodon là gì? Vai trò sinh học của cấu trúc này? Câu 3: Nội dung nguyên tắc bổ xung gốc kiềm trong chuỗi xoắn kép của axít nucleic? ý nghĩa sinh học của nguyên tắc này? Câu 4: Phân loại axit nucleic Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 73 http://www.ebook.edu.vn
CHƯƠNG III ENZYME VÀ XÚC TÁC SINH HỌC 1. Khái niệm Enzyme là những chất xúc tác sinh học, do cơ thể sống tổng hợp nên. Chúng xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, Nhờ có Enzyme mà các quá trình hoá sinh xảy ra rất nhạy, với tốc độ rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường (nhiệt độ cơ thể và pH môi trường mô bào). Enzyme có ở mọi sinh vật, trong tế bào sinh vật và là động lực của mọi quá trình sống. Hay có thể nói Enzyme là những chất mà dưới tác dụng của chúng các phản ứng hoá sinh được thực hiện rất nhanh chóng với nhịp điệu, trình tự hết sức rõ ràng chính xác trong quá trình trao đổi vật chất (TĐVC) của cơ thể. Sống là TĐVC mà TĐVC là tổ hợp của hàng loạt những phản ứng hoá sinh phân giải hoặc tổng hợp. Mỗi phản ứng như vậy được thực hiện rất nhanh chóng có khi hàng nghìn lần trong giây với nhịp điệu và trình tự hết sức rõ ràng vì mỗi phản ứng đó được thực hiện bởi một Enzyme đặc hiệu. Lịch sử Enzyme đã có từ lâu. Ngay từ đầu thế kỷ 19 đã có những nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học – Enzyme trong quá trình tiêu hoá ở nước bọt, dạ dày và ruột. Năm 1850, Pasteur đã nhận định quá trình lên men được một yếu tố xúc tác là ferment. Sau này yếu tố trên được gọi thống nhất là Enzyme. Năm 1897 người ta đã chứng minh chính dịch chiết của Enzyme chứ không phải toàn bộ tế bào nấm men có khả năng lên men đường thành rượu. Đó là bằng chứng về sự tham gia của bản thân Enzyme trong quá trình lên men. Năm 1926, lần đầu tiên Sammer đã thu được tinh thể Enzyme Urease. Năm 1930 Northrop thu được tinh thể Pepsin và Trypsin. Trong giai đoạn cuối của thế kỷ 20, các nghiên cứu trong lĩnh vực này được tập trung vào vai trò xúc tác của Enzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Việc tinh sạch được hàng nghìn Enzyme và nhờ vậy đã làm sáng tỏ các cấu trúc không gian và chức năng xúc tác của nhiều Enzyme khác nhau. Ngày nay Enzyme càng được sử dụng rộng rãi trong y học, công nghệ vi sinh, nông nghiệp, chế biến thực phẩm và cả trong lĩnh vực mỹ phẩm. 2. Bản chất của Enzyme Enzyme là protein vì chúng có cấu tạo từ các acid amin với các cấu trúc bậc I, II, III, IV như protein và chúng cũng có đầy đủ các tính chất vật lý hoá học của protein như đặc tính keo, điểm đẳng điện, hiện tượng sa lắng... và cũng bị phá huỷ bởi các yếu tố nhiệt độ, acid, kiềm mạnh như protein. Enzyme là một lớp protein đông đảo có ở khắp nơi trong giới sinh vật, chúng phân bố trong cơ thể cũng đa dạng, có Enzyme phân bố trong tế bào chất, là thành phần cấu trúc của màng, trong ty lạp thể, trong màng ty lạp thể, có loại cố định, có loại di động được như trong máu, trong sinh dịch... Ngoại trừ một nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, còn tuyệt đại đa số Enzyme đều có bản chất protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào các bậc cấu trúc từ I đến IV của phân tử protein cũng như trạng thái tự nhiên của nó. Enzyme có khối lượng phân tử thay đổi rất rộng từ 12.000 Dal đến hàng triệu Dal. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 74 http://www.ebook.edu.vn
Một số Enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác không cần sự có mặt của các yếu tố khác ngoài phân tử protein, đó là những Enzyme đơn giản. Ngược lại, ở những Enzyme phức tạp, ngoài phân tử protein còn có thêm nhóm ghép là CoEnzyme. Phần CoEnzyme có bản chất rất khác nhau nhưng trước hết và đông đảo hơn cả là dẫn xuất của các vitamin rồi đến các ion kim loại hoá trị 2 như Fe+2, Mg+2,Mn+2, Zn+2Co+2... Các ion kim loại này đóng vai trò cofactor hoặc cần sự có mặt và phối hợp tác động của các phức hữu cơ hoặc phức hữu cơ - kim loại làm yếu tố đồng Enzyme. Người ta gọi phần protein của Enzyme là apoEnzyme (hay apo-protein), còn các yếu tố khác gọi là nhóm ngoại Prosthetic và phức chứa đầy đủ cả 2 yếu tố được gọi là Enzyme hoàn chỉnh (HoloEnzyme). 3. Trung tâm hoạt động của Enzyme: Trung tâm hoạt động của Enzyme là nơi tiếp xúc giữa Enzyme với đối tượng tác động của nó (tức là cơ chất ), là nơi Enzyme thực hiện phản ứng. Trung tâm hoạt động được hình thành thông qua cấu trúc bậc III của phân tử protein Enzyme, thông qua đó một số gốc acid amin bình thường nằm xa nhau trong cấu trúc bậc I có thể được phân bố lại gần nhau, phối hợp với nhau để thực hiện chức năng xúc tác của Enzyme. Ở các Enzyme phức tạp thì do các gốc acid amin đó kết hợp với nhóm ghép tạo nên. Ví dụ trung tâm hoạt động của chimotrypsin của tuyến tuỵ, ít nhất là bao gồm gốc serin ở vị trí 195 và gốc histidin ở vị trí 57. Những gốc này tuy xa nhau về cấu trúc bậc I nhưng lại gần kề nhau về cấu trúc không gian khi Enzyme chimotrypsinogen được hoạt hoá bởi Entero- kinase (hình 3.1). Hình 3. 1. Mô hình cấu trúc của Enzyme chimotrypsinogen, sự hoạt hoá Enzyme này là Entero-kinase của tuyến ruột Các gốc acid amin thường tham gia vào trung tâm hoạt động là Cys với nhóm -SH, Ser, Tyr, Tre với nhóm - OH; Lys, Arg với nhóm -NH2, Glu, Asp với nhóm –COOH, His với nhóm imidazole. Khi Enzyme có thêm nhóm ghép tức là coEnzyme thì coEnzyme phân bố ngay ở trung tâm hoạt động. Cũng cần chú ý rằng có những Enzyme có một trung tâm hoạt động, nhưng cũng có những Enzyme có hai hoặc nhiều trung tâm hoạt động, ví dụ alcol dehydrogenase gan có hai trung tâm hoạt động, còn alcol dehydrogenase của nấm men có tới bốn trung tâm hoạt động. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 75 http://www.ebook.edu.vn
Có thể coi trung tâm hoạt động là phần quyết định trong hoạt động của Enzyme nên mọi tác động có ảnh hưởng tới Enzyme trước hết là ảnh hưởng tới trung tâm hoạt động như hiện tượng ức chế, hoạt hoá...Các chất tác dụng có thể làm tăng cường hoạt độ của Enzyme thì người ta gọi là chất hoạt hoá, nếu làm giảm hoặc tê liệt hoạt độ của Enzyme thì gọi là chất ức chế. Những chất này có thể tác dụng thẳng vào trung tâm hoạt động của Enzyme như một số ion kim loại: Cu++, Zn++, Mn++, Mg++, Co++, Ca++... có tác dụng hoạt hoá Enzyme do các ion này tham gia trực tiếp vào trung tâm hoạt động để vận chuyển điện tử hoặc tạo thành cầu nối giữa cơ chất và Enzyme. Một số chất có tác dụng ức chế Enzyme như KCN, ditrec... chúng có thể phóng bế hoặc bịt kín trung tâm hoạt động của Enzyme Các yếu tố ảnh hưởng tới trung tâm hoạt động: Nhiệt độ: là biểu hiện nội năng của vật chất, biểu hiện sự chuyển động nhiệt của các ion. Nhiệt độ thích hợp để các Enzyme hoạt động tốt là nhiệt độ của thân nhiệt (37-40 0C). Nhiệt độ cao quá làm cho chuyển động nhiệt của các ion tăng quá mạnh làm đứt các dây nối, phá vỡ cấu trúc bậc III, do đó Enzyme bị tê liệt hoặc bị phá huỷ hoàn toàn. Nhiệt độ thấp quá (0 0C) phân tử không chuyển động, sự va chạm giữa Enzyme với cơ chất giảm làm cho hoạt tính của Enzyme giảm hoặc mất hẳn. Tác động của nhiệt độ chưa sâu sắc thì Enzyme có thể phục hồi như khi nhiệt độ không cao quá hoặc thấp quá. Nhiệt độ tăng ở mức thích hợp thì có tác dụng kích thích hoạt động của Enzyme (sốt nhẹ). Giá trị Kcat của tuyệt đại đa số Enzyme gia tăng khi nhiệt độ môi trường của phản ứng gia tăng cho đến khi đạt giá trị xác định thì không tăng nữa và sẽ giảm hoạt tính xúc tác khi nhiệt độ tiếp tục tăng. Nhiệt độ mà ở đó Enzyme đạt giá trị hoạt tính cực đại gọi là nhiệt độ tối ưu của Enzyme. Độ pH: Mỗi Enzyme có một vùng pH hoạt động tốt nhất của mình, ngoài vùng đó hoạt độ của Enzyme bị giảm sút hoặc mất hẳn. Bản chất của sự ảnh hưởng này là do nồng độ H+ thay đổi đã ảnh hưởng đến sự phân ly của các gốc tạo nên cấu trúc bậc III của Enzyme, ảnh hưởng tới sự phân ly, phân cực giữa Enzyme và cơ chất... có nghĩa là pH ảnh hưởng tới pKa của các nhóm ion chức năng của Enzyme, cũng như cơ chất. Mỗi Enzyme có một pH tối ưu ví dụ: Chymotrypsin là 8,0; Trypsin là 2,0 v.v… Tác dụng dị lập thể (Allosteric): là một trong những kiểu tác dụng để điều chỉnh Hình 3.2. Sơ đồ về kiểu tác dụng dị lập thể. Khi gắn một phân tử tín hiệu vào m ột vị trí Trường ĐạiEnzyme dẫn ệp Hà ựộtihay đổi cấuHoá Sinh aộnó,vậừ…………………………… 7của trong học Nông nghi đến sN – Giáo trình trúc củđ ng t t đó thay đổi hoạt tính 6Enzyme http://www.ebook.edu.vn
hoạt độ của Enzyme. Một số chất tác động không trực tiếp vào trung tâm hoạt động mà vào một vị trí nào đó của Enzyme làm cho cấu trúc bậc III của nó thay đổi chút ít, từ đó hoạt độ của Enzyme thay đổi, nó có tính chất điều chỉnh hoạt độ của Enzyme, điển hình kiểu tác động này là cách tác động của các hormone (hình 3.2). 4. Chất phối hợp của Enzyme (cofactor). Nhiều Enzyme trong quá trình xúc tác lại đòi hỏi phải có sự phối hợp của một chất hữu cơ gọi là coEnzyme hay nhóm phụ, nhiều trường hợp đòi hỏi phải có kim loại tham gia vào cơ chế xúc tác. Những chất hữu cơ đặc hiệu và các ion kim loại có vai trò như vậy được gọi là chất phối hợp hay chất cộng tác (Cofactor). Các chất cộng tác khi kết hợp vào phân tử Enzyme đã bổ sung khả năng phản ứng và khả năng xúc tác cho phân tử Enzyme. Thiếu các chất này thường Enzyme không hoạt động được. Các chất hữu cơ có thể gắn chặt vào phân tử Enzyme hoặc cũng có thể chỉ kết hợp lỏng lẻo, xu thế hiện nay muốn gọi chung là coEnzyme. CoEnzyme thường hoạt động với số lượng rất nhỏ so với cơ chất và thường sau mỗi phản ứng có thể trở lại trạng thái ban đầu để tiếp tục tham gia phản ứng. Như vậy coEnzyme thực sự tham gia vào cơ chế xúc tác. Tuy nhiên, một số coEnzyme tham gia phản ứng giống như những chất tham gia phản ứng khác, cho nên theo quan niệm động học cũng như về cơ chất, những coEnzyme này có thể đựơc coi là những cơ chất thông thường. Nhưng nếu coEnzyme nào đó gắn chặt vào Enzyme bằng liên kết đồng hoá trị thì hiển nhiên nó chỉ đóng vai trò trong cơ chế xúc tác mà thôi. Số lượng coEnzyme tương đối ít, một coEnzyme có thể phối hợp với nhiều loại Enzyme, ví dụ NAD+, NADP+ có thể phối hợp với nhiều Enzyme khử hydro (Dehydrogenase). Nhiều chất chuyển hoá trung gian cũng mang những đặc tính của coEnzyme như acid Ascorbic, glucose –1-6-diphosphate.v.v. Về cấu trúc hoá học, nhiều coEnzyme có cấu trúc của một nucleotide đơn hoặc đôi hoặc một phần cấu tạo của nó là nucleotide, một số coEnzyme là những nhóm Hem. CoEnzyme có liên hệ chặt chẽ với các vitamin (bảng 3.1). Cơ thể động vật bậc cao có khả năng tổng hợp các coEnzyme từ các vitamin. Những coEnzyme thường gặp là những chất cộng tác của những Enzyme oxy hoá khử và những Enzyme vận chuyển nhóm. Các coEnzyme oxy hoá khử gồm 5 nhóm là: Nicotinamide, Flavin, Quinone, Metaloporphyrin và nhóm Protein –sắt. Các nhóm này khác nhau về thế năng oxy hoá khử, về số điện tử được vận chuyển trong quá trình chuyển từ dạng khử sang dạng oxy hoá. Ba nhóm đầu trao đổi ion Hydro và điện tử, các phản ứng do chúng xúc tác đều thuộc loại vận chuyển Hydro. Hai nhóm sau chỉ trao đổi điện tử và các phản ứng do chúng xúc tác thuộc nhiều loại khác nhau. Thế năng oxy hoá khử của loại này thay đổi rất nhiều, tuỳ thuộc vào các phân tử protein mà chất cộng tác gắn vào. Các coEnzyme vận chuyển nhóm chia thành hai nhóm chính: Nhóm một bao gồm CoEnzyme A, acid Lipoic và S-adenosyl-methionine. Phần hoạt động chính của các phân tử nhóm này là một nguyên tử lưu huỳnh, nguyên tử này có khả năng chứa 10 điện tử ở lớp ngoài cùng, có vai trò như cái túi hút điện tử, do đó làm tăng khả năng ion hoá nguyên tử Carbon liên kết với nó. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 77 http://www.ebook.edu.vn
Nhóm thứ hai gồm Biotin, Thiamine pyrophosphate, Pyridoxal phosphate và acid Folic. Tác dụng của những chất này chủ yếu là nhờ một hệ thống liên hợp bao gồm một dị nguyên tử. Với tác dụng của dị nguyên tử, bộ phận của coEnzyme được ion hoá thành anion. Sự ion hoá này tạo ra giai đoạn mở đầu quá trình phản ứng. Chúng ta hãy xem xét một số CoEnzyme sau đây: Bảng 3.1. Mối liên quan của một số vitamin với CoEnzyme CoEnzyme nicotinamide. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 78 http://www.ebook.edu.vn
Hình 3.3. Cấu tạo phân tử và cơ chế hoạt động của coEnzyme Nicotinamide Trong loại này thường gặp 2 chất chính là Nicotinamide Adenine Dinucleotid (NAD+ ) và Nicotinamide Adenine Dinucleotide phosphate (NADP+). Hai coEnzyme này có trong tất cả mọi tế bào. NAD+ thường nhiều hơn NADP+ khoảng 10 lần. Hai coEnzyme này tham gia vào những phản ứng oxy hoá khử do các Dehydrogenase xúc tác. Các Enzyme này rất đặc hiệu với NAD+ hoặc NADP+. Một số Enzyme có thể hoạt động với cả hai coEnzyme nhưng mức độ đặc hiệu với từng coEnzyme thì khác nhau. NAD+ thường tham gia các phản ứng oxy hoá khử để cung cấp năng lượng cho cơ thể. Còn NADP+ thường tham gia vào các phản ứng sinh tổng hợp. Các phản ứng có sự tham gia của các coEnzyme này thường là những phản ứng liên quan tới liên kết đôi giữa carbon và oxy, giữa carbon và nitơ và trong một số trường hợp là giữa carbon và carbon. Cơ chế hoạt động của hai coEnzyme này giống nhau: Trong quá trình oxy hoá khử, nhân niconamide trực tiếp tham gia phản ứng, carbon ở vị trí thứ 4 có khả năng nhường hoặc nhận một nguyên tử Hydro, phần còn lại của coEnzyme là để kết hợp vào Enzyme. Trong phản ứng này, một nguyên tử hydro của cơ chất đã gắn lên nhân nicotinamide, còn một nguyên tử hydro khác xuất hiện trong môi trường dưới dạng proton vì điện tử của nó đã kết hợp vào nhân nicotinamide và trung hoà điện tích dương này (hình 3.3). CoEnzyme flavin. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 79 http://www.ebook.edu.vn
Hình 3.4. Cấu tạo phân tử của FAD và cơ chế hoạt động của coEnzyme Flavin Loại này thường gặp hai chất quen thuộc là Flavin mononucleotide (FMN) và Flavin – Adenine – Dinucleotide (FAD). Các Enzyme kết hợp với coEnzyme flavin dưới tên chung là flavoprotein. Ngoài tác dụng vào liên kết giữa carbon với một dị nguyên tử như S, O, N … các Enzyme flavoprotein còn tác dụng vào nhiều loại liên kết khác. Cơ chế tác dụng: Các phản ứng khử xảy ra qua hai bước: Bước thứ nhất –một nguyên tử hydro được gắn lên N1 của flavin và làm giảm đi một liên kết đôi, nhân này mang một điện tử độc thân ở N5, điện tử này được giữ ổn định là do đặc tính cộng hưởng cao của nhân ; Bước 2 –một nguyên tử hydro nữa được kết hợp vào N5 và tạo nên coEnzyme dạng khử (hình 3.4). Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 80 http://www.ebook.edu.vn
CoEnzyme quinone. CoEnzyme này được gọi là coEnzyme Q hay Ubiquinone. Trên thực tế có hàng loạt coEnzyme quinone đều là dẩn xuất của benzo-quinone và đều có một liên kết nhánh dài gồm nhiều gốc terpen. Liên kết nhánh này của mỗi chất khác nhau (số n terpen khác nhau). CoEnzyme Q ở loài động vật có vú thường có liên kết nhánh dài tới 10 gốc terpen gọi là coEnzyme Q10 (n=10). Tất cả những chất này là những coEnzyme oxy hoá khử. Các chất này tham gia vào quá trình oxy hoá khử giữa những Dehydrogenase và Cytocrom b trong chuỗi hô hấp tế bào của ty thể. Vitamin K và E được xếp vào loại chất này (hình 3.5). Hình 3.5. Cấu tạo phân tử và cơ chế hoạt động của coEnzyme Quinone CoEnzyme hem. Nhiều Enzyme cần sự cộng tác của nhóm Hem. ví dụ: Hệ thống Cytochrome, Catalase, Peroxidase. Vai trò chủ yếu của các coEnzyme này là vận chuyển điện tử nhờ khả năng biến đổi thuận nghịch của sắt giữa trạng thái Fe2+ và Fe3+. Dạng khử Dạng Oxy hoá. CoEnzyme A (CoASH). Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 81 http://www.ebook.edu.vn
Hình 3.6. Cấu trúc phân tử CoEnzyme A. Cấu tạo của coEnzyme này gồm có một gốc 3’,5’diphosphoadenosine liên kết với một phân tử 4- phosphopantethein. Phần pantethein có nhóm thiol (-SH) hoạtđộng. CoEnzyme này vận chuyển nhóm acyl (gốc acid) và tham gia vào phần lớn các phản ứng ngưng tụ với các phân tử acetate hoặc acid béo khác để tạo ra những chuỗi carbon dài hơn. Trong phản ứng này acid béo phải được gắn vào coEnzyme A qua liên kết thioester giữa nhóm carbonyl của acid béo và nhóm thiol của coEnzyme A. Trong dẫn chất đồng hoá trị này, do tác dụng của nguyên tử lưu huỳnh, các điện tử được phân bố lại và do đó các nguyên tử bên cạnh dễ dàng ion hoá và tạo cho gốc acyl một hoạt tính mới, nghĩa là gốc acyl được hoạt hoá. Sự hoạt hoá này có thể xảy ra ở nhóm carbonyl (hoạt hoá đầu) hoặc ở nhóm methyl cuối cùng của gốc acyl (hoạt hoá đuôi) (hình 3.6). S- Adenosine methionine. Methyl hoá là một phản ứng rất quan trọng và methionine là chất cung cấp nhóm methyl quan trọng nhất. Nhóm methyl trong methionine được kết hợp bằng liên kết thioester có thế năng vận chuyển rất thấp, vì vậy quá trình vận chuyển nhóm methyl phải qua một giai đoạn hoạt hoá trung gian bằng cách gắn một phân tử adenosine (của ATP) vào nhóm methionine. Trong dạng kết hợp này, nguyên tử lưu huỳnh của methionine trở thành ion sulfonium có tác dụng hoạt hoá nhóm methyl, chuẩn bị cho phản ứng vận chuyển nhóm methyl đến chất tiếp nhận (hình3.7). Hình 3.7. Cấu trúc phân tử S-Adenosine methionine Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật …………………………… 82 http://www.ebook.edu.vn