Tham khảo tài liệu 'giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 1', khoa học tự nhiên, nông - lâm phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành part 1
- B GIÁO D C VÀ ðÀO T O
TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I
***
NGUY N XUÂN THÀNH (Ch biên) VŨ TH HOÀN
NGUY N TH BÌNH - ðINH H NG DUYÊN
Ch biên & hi u ñính
PGS.TS NGUY N XUÂN THÀNH
TH C T P VI SINH V T
Chuyªn ngµnh
Chuyªn
Hà N i - 2007
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1
- M CL C
N i dung Trang
Bài s 1: Trang thi t b c n thi t trong nghiên c u vi sinh v t 1
Bài s 2: Phương pháp c ñ nh tiêu b n và nhu m t bào vi sinh v t 12
Bài s 3: Chu n b d ng c và môi trư ng nuôi c y vi sinh v t 16
Bài s 4: Nuôi c y vi sinh v t 26
Bài s 5: Phương pháp l y m u ñ phân tích vi sinh v t 31
Bài s 6: Phương pháp phân tích vi sinh v t 33
Bài s 7: ðánh giá ñ c tính sinh h c c a vi sinh v t 37
Bài s 8: Phân l p tuy n ch n Azotobacter t ñ t 40
Bài s 9: Phương pháp l y m u và phân l p tuy n ch n vi khu n 42
Rhizobium
Bài s 10: Phương pháp xác ñ nh nhanh trao ñ i ch t vi sinh v t 46
Bài s 11: Vi sinh v t trong môi trư ng 50
Bài s 12: Phương pháp xác ñ nh n m men, n m m c, t o và 53
nguyên sinh ñ ng v t
Bài s 13: Quá trình chuy n hoá nitơ dư i tác d ng c a vi sinh v t 60
Bài s 14: Chuy n hoá lưu huỳnh dư i tác d ng c a vi sinh v t 63
Bài s 15: Vi sinh v t phân gi i lân (phospho) 65
Bài s 16: Enzym trong quá trình trao ñ i nitơ, phospho, lưu huỳnh 67
Bài s 17: Xác ñ nh sinh kh i vi sinh v t ñ t 75
Bài s 18: Sinh trư ng c a vi sinh v t 83
Bài s 19: Thăm quan ki n t p v vi sinh v t 86
Ph l c 88
Tài li u tham kh o 91
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2
- Bài s 1
TRANG THI T B C N THI T TRONG NGHIÊN C U VI SINH V T
M c ñích yêu c u:
+ N m ñư c nh ng máy móc, trang thi t b c n thi t trong nghiên c u v
vi sinh v t.
+ Bi t s d ng thành th o m t s máy móc thông d ng c a phòng nghiên c u.
+ Hi u ñư c t m quan tr ng c a công tác tiêu ñ c, kh trùng.
+ S d ng thành th o kính hi n vi
+ Phân bi t các d ng hình thái c a vi sinh v t
N i dung :
+ Gi i thi u nh ng trang thi t b c n thi t trong phòng nghiên c u vi sinh v t.
+ Gi i thi u các d ng c và nguyên li u c n thi t ñ nghiên c u vi sinh
v t: d ng c l c, kh trùng, d ng c quang h c, d ng c ño lư ng, môi trư ng
nuôi c y.
+ Thao tác v n hành và s d ng các trang thi t b trong phòng nghiên c u
vi sinh v t
+ C u t o và s d ng, b o qu n kính hi n vi
+ Quan sát hình thái vi sinh v t
I. MÁY MÓC
1. T nuôi c y vi sinh v t (Incubator)
T nuôi c y hay còn g i là t ñ nh ôn là thi t b quan tr ng dùng trong công
tác nghiên c u vi sinh v t, vì nhi t ñ trong t có th thay ñ i t 00 – 900 C tuỳ
theo ý mu n c a ngư i nghiên c u và nhi t ñ trong t sau khi ñã ñư c xác ñ nh
thì luôn luôn tr ng thái n ñ nh trong su t th i gian nuôi c y.
1.1. C u t o
C u t o v t nuôi c y có 2 l p: l p trong là kim lo i d n nhi t ñ gi nhi t
ñ bên trong c a t , l p ngoài là kim lo i dày hơn và ñư c b c phía trong b i
m t ch t cách nhi t (amiant). Gi a l p trong và l p ngoài là kho ng tr ng ñ gi
cho nhi t ñ trong t ít b bi n ñ i.
Trong t có b ph n c m nhi t ñ báo nhi t ñ lên xu ng cho rơ-le ho t
ñ ng và qu t gió ñư c l p ph n gi a thân ñ ñi u hoà nhi t ñ bên trong.
Ph n ngoài t nuôi có h th ng b ng ñi n t ñ ñi u ch nh nhi t ñ theo
yêu c u c a nghiên c u. Phía trên t ñư c l p van an toàn, n u nhi t ñ trong t
vư t quá dao ñ ng biên ñ , van an toàn s t ng t.
1.2. Cách s d ng
ðóng m ch ñi n, b m nút m công t c t (có th gi vài giây ñ n khi xu t
hi n ñèn báo trên b ng ñi n t ). Sau ñó b m nút ñ t nhi t ñ và th i gian (set
up) theo yêu c u nuôi c y, ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian b ng n nút tương
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1
- ng mũi tên lên ho c xu ng. Nhi t ñ trong t m tăng d n và ñ t t i nhi t ñ ñã
xác ñ nh.
Nhi t ñ s ñư c duy trì trong su t th i gian nuôi c y ñã ñ nh s n. Trên
b ng ñi n t luôn xu t hi n ch s báo nhi t ñ th c t trong t . Khi ñ th i gian
nuôi c y, t s phát ra ti ng báo hi u và rơ le t ng t ñ t ñ ng t t ch ñ làm
vi c.
N u mu n nuôi c y liên t c lâu dài có th không c n ñ t ch ñ th i gian,
ch ñ t nhi t ñ . Khi nào mu n k t thúc thì b m nút t t công t c ngu n.
1.3. Khi s d ng máy c n chú ý nh ng ñi m sau ñây
+ Hi u ch nh thi t b trư c khi s d ng.
+ Ph i n i t v i dây ñ t và ki m tra ñi n th c a máy v i ñi n th nơi
ñ t máy xem có gi ng nhau không, trư ng h p không gi ng nhau ph i dùng
bi n th .
+ Khi s d ng t m l n ñ u, ph i ki m tra b ph n ñi u ch nh nhi t ñ
xem có chính xác không, nhi t ñ trong t có ñ u không.
+ C a t luôn luôn ph i ñóng kín, tr khi l y ho c cho nguyên li u vào
nuôi c y nhưng cũng không ñư c m c a t r ng và lâu.
+ Luôn luôn ph i ñ m b o cho t m ñư c khô ráo, s ch s , ph i cho t
ho t ñ ng thư ng xuyên nh t là nh ng hôm tr i m. Khi làm ñ các ch t d ch
nuôi c y ho c làm b n trong t , ph i lau chùi và sát trùng ngay.
+ Nên ñ t trong t 1 c c nư c vô trùng trong quá trình nuôi c y ñ giúp
cho qu t gió ho t ñ ng t t.
+ Khi không dùng, t t công t c ñi n và rút phích c m ñi n ra.
2. T s y khô (Drying oven)
2.1. Tác d ng
Dùng t s y khô ñ kh trùng các d ng c th y tinh, ñ s như ng nghi m,
xi lanh, h p l ng, c c, ph u, c i ch y s ..., các ñ kim khí như dao, kéo, panh và
các d ng c khác không có nư c khác như bông, băng, v i... Tr v t li u làm t
cao su và môi trư ng nuôi c y không ñư c kh trùng b ng t s y khô.
Nguyên lý c u t o c a t s y khô cũng g n gi ng như t m, ch khác là có
th ti t trùng nhi t ñ 175 - 200o C.
2.2. Cách s d ng t s y khô
Các d ng c ph i r a s ch, ñ khô, bao gói c n th n trư c khi cho vào t , sau
khi s p x p các th vào trong t r i ñóng kín c a và ñóng các l thông khí. B t công
t c ñi n, ñ t ch ñ làm vi c cho t (ñi u ch nh nhi t ñ và th i gian gi ng như v i
t ñ nh ôn). Thông thư ng d ng c nuôi c y và phân tích vi sinh v t ñư c kh trùng
160-180oC trong 2 gi . V i các d ng c , như: pipét, xi lanh,… không ñư c s y
quá 60oC vì nhi t ñ cao làm giãn n thu tinh d n ñ n m t ñ chính xác c a d ng
c . Lưu ý khi s y không nên ñ t d ng c sát thành t vì ñ y nhi t ñ thư ng cao
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2
- hơn nhi u d làm cháy gi y gói ho c nút bông, cũng không nên x p d ng c quá khít
nhau ñ không khí có th lưu thông ñư c và làm nóng ñ u các v t c n kh trùng.
Sau khi ng t m ch ñi n, ch nhi t ñ h d n xu ng b ng nhi t ñ phòng thì
m i ñu c m c a t ñ l y d ng c s y ra. D ng c l y ra ph i ñ trên giá g ,
trên gi y ho c v i, không ñư c ñ trên g ch men, trên sàn g ch ho c sàn xi
măng vì d ng c ñang nóng g p l nh s d v và làm nh hư ng ñ n tính vô trùng
c a d ng c .
3. N i h p hơi nư c cao áp (Autoclave)
3.1. Nguyên lý
N i h p hơi nư c cao áp (hình 1) làm b ng kim lo i ch u ñư c nhi t ñ cao
(ít nh t là 135o C) có th dùng ñi n, dùng c i ho c dùng than ñun cho nư c sôi,
hơi nư c s nén d n l i trong n i và n u ti p t c ñ cho nư c sôi thì áp l c
trong n i s tăng d n, áp l c càng tăng thì nhi t ñ c a hơi nư c trong n i càng
cao, như v y gi a nhi t ñ t0 c a hơi nư c và áp l c P c a nó có liên quan v i
nhau, nhưng không ph i theo m t t l ñư ng th ng (xem ñ th ).
Khi áp l c k ch s 0 có nghĩa là: áp l c P trong n i h p = áp l c P không khí.
Cho nên khi áp l c k ch 1kg/cm2 thì chính là ch hi u s gi a áp l c bên
trong v i áp l c không khí t n t i trong n i.
1kg/cm2 = P (trong n i) - P (không khí trong n i)
Do ñó áp l c P trong n i không phù h p v i P áp l c k hay nói m t cách
khác, nhi t ñ trong n i không tương ng v i nhi t ñ c a áp l c k . Vì v y
mu n cho nhi t ñ trong n i phù h p v i áp l c k thì ph i lo i b h t không khí
trong n i ra (1kg/cm2 = 1atm = 1 phoud).
B ng 1. So sánh m i liên quan gi a áp su t ghi trên áp k c a n i h p
bi u th b ng atmosphere và nhi t ñ trong n i ñã lo i h t không khí
Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t
ñ (oC) ñ (oC) ñ (oC) ñ (oC)
su t su t su t su t
(atm) (atm) (atm) (atm)
0,0 100,0 0,5 112,5 1,0 121,0 1,5 127,0
0,1 102,5 0,6 114,5 1,1 129,9 1,6 128,0
0,2 105,0 0,7 116, 1,2 124,0 1,7 129,0
0,3 107,5 0,8 117,0 1,3 125,0 1,8 130,0
0,4 110,0 0,9 119,0 1,4 126,0 1,9 131,0
2,0 132,0
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………3
- Hình 1. Sơ ñ n i h p áp l c
ð lo i b h t không khí trong n i ra có 2 cách:
a) ðóng khóa thoát hơi ñ tăng áp l c trong n i lên ñ n kho ng 0,3 atm
r i xì cho thoát h t hơi ra, sau ñó khóa l i và cho tăng áp l c.
b) M khóa thoát hơi và ñun cho ñ n khi hơi nư c b t ñ u thoát ra thành
m t lu ng hơi tr ng khá m nh, khá ñ u thì ñóng l i và cho tăng áp l c.
3.2. Cách s d ng n i h p cao áp
- ð nư c vào n i h p v i lư ng v a ñ (xem v ch ngang ghi trên ng
th y tinh ho c bình ch a l p bên ngoài n i h p). Chú ý nư c ph i ng p dây may
so trong n i n u là n i h p xách tay.
- Các d ng c ñem h p ph i ñư c bao gói k , ñ i v i các bình và ng môi
trư ng có nút bông ph i b c b ng gi y d u ho c gi y nhôm ñ tránh hơi nư c
ñ ng làm ư t nút.
- Khi s p x p d ng c vào n i h p không nên ñ sát nhau quá, ñ v t n ng
xu ng dư i v t nh lên trên.
- ð y n p, khóa ch t các c theo t ng ñôi ñ i x ng nhau ñ kh i vênh,
kh i h , khi tháo khóa cũng ph i làm như v y. ðóng van ñi u áp và van x hơi.
- M m ch ñi n ho c ñ t nhiên li u ñ cung c p nhi t cho n i, n nút m
công t c n i (nút on), ñ t ch ñ làm vi c (nhi t ñ và th i gian h p) cho n i
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………4
- b ng cách ñi u ch nh mũi tên lên xu ng. Ch ñ làm vi c luôn th hi n trên
b ng ghi ñi n t . Sau khi h p ñ theo nhi t ñ và th i gian ñ nh s n, rơ le s t
ng t, n i phát ra ti ng kêu báo hi u quá trình h p ñã k t thúc.
V i n i h p xách tay ph i luôn luôn có m t ñ theo dõi kim ch áp l c trên
ñ ng h áp l c k trong khi h p, lo i h t không khí trong n i theo 2 phương
pháp ñã nêu trên. Khi ñ t t i m c c n thi t thì ñi u ch nh ngu n nhi t ñ duy trì
áp l c không ñ i trong m t kho ng th i gian c n thi t.
Nhi t ñ và th i gian h p kh trùng ph thu c vào v t ñem kh trùng và
m c ñích nghiên c u. Ngư i ta thư ng h p nhi t ñ 121oC trong kho ng 20
phút thì nha bào c a m t s lo i vi khu n cũng s b tiêu di t.
- Khi ñ t t i th i gian c n thi t thì ng t ñi n ( n nút off) ho c rút h t
nhiên li u ra và ñ i cho áp l c h d n xu ng 0o C, nhi t ñ trong n i gi m h n
r i m i ñư c m n p l y d ng c ñã kh trùng ra. Chú ý tránh h áp l c ñ t
ng t b ng cách m van xì hơi ra quá m nh s làm r n n t ho c v d ng c .
Cũng không nên ñ n i h p ngu i l nh m i l y d ng c ra, vì lúc này n p n i s
mút ch t vào mi ng ñ m cao su r t khó m .
- Các d ng c l y ra không ñư c ñ n n g ch men, n n ñá, n n xi măng (vì
d ng c ñang nóng g p l nh s v , n t) và ñ m bào tính vô trùng cho d ng c .
4. T l nh (Freezer)
T l nh là m t thi t b quan tr ng dùng ñ gi và b o qu n gi ng vi khu n,
virus và b o qu n các lo i huy t thanh, các lo i vacxin, các môi trư ng dùng ñ
nuôi c y...
T l nh 0o- 4o C dùng ñ gi gi ng vi khu n.
T l nh -15o C ñ n -30o C dùng ñ gi gi ng virus.
5. Máy ly tâm (Centrifugal machine)
5.1. Công d ng
- T p trung ñáy ng các ph n t c n nghiên c u ch a trong m t b nh ph m
hay ch t mang.
- T p trung vi khu n nuôi c y trong môi trư ng l ng ñ tách riêng vi
khu n.
- Làm trong m t ch t l ng ch a nhi u ph n t ñ c v n ñ c.
- Tách h ng c u riêng v i huy t tương….
5.2. Cách s d ng
Máy ly tâm thông thư ng có m t tr c quay tròn, v phía trên c a tr c có
m t hình sao ñ nh n các ng ch a ch t l ng c n ly tâm. Các ng này ñư c móc
vào sao b ng m t cái quai. Khi quay các ng s giãn ra th ng góc v i tr c quay
ñ ng và các h t l ng xu ng theo ñư ng tr c c a ng và d n v phía ñáy. V i
ki u máy này, t c ñ t i ña là 4500 - 6000 vòng trong m t phút.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………5
- Các máy ly tâm g n ñây có b ph n thăng b ng t ñ ng, có máy ñ th i
gian t ñ ng, có ñ ng h ch t c ñ v.v..., khi ly tâm ch c n v n các nút theo ý
mu n.
6. Nh ng thi t b c n thi t khác
- Máy hút chân không (vacuum gauge)
- Máy ñ m khu n l c (colony counting)
- Máy ño pH (pH meter) hay thang ño pH (pH paper set)
- Máy c t nư c (Deionizers)
- Máy ñánh m u (Mixers)
- Máy ñ m t bào (cell counting)
- Máy l c (shaker)
- Phòng ho c bu ng vô trùng (clean bench, laminars)
II. CÁC D NG C VÀ THI T B PHÒNG THÍ NGHI M
1. Thi t b quang h c
- Kính hi n vi quang h c (Microscopy)
- Kính hi n vi ch p nh
- ðèn soi kính hi n vi
- T quang n n ñen
- Thư c ño v t kính và thư c ño th kính
- Kính lúp hai m t ñeo trán
- Máy projector
- Máy Over head
- Máy nh
- ðèn t ngo i (UV lamp)
2. Thi t b ño lư ng
- Cân k thu t (technical balance)
- Cân ti u ly có l ng kính
- Cân ti u ly xách tay
- Cân bàn
- Cân phân tích ñi n
- Nhi t k treo tư ng và các lo i nhi t k ño nhi t ñ khác
- ð ng h ñi n t ñ m phút, giây
3. Các lo i d ng c khác
- Các lo i d ng c th y tinh: Phi n kính, h p l ng, ng nghi m, l , bình,
ph u, c c ng ñong, xi lanh, pipet, que g t, ñèn c n...
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………6
- - Các lo i d ng c kim lo i: Dao m các lo i, kéo th ng, kéo cong, panh,
que c y, ñèn xì, h p tiêu ñ c, cưa xương...
- Các lo i d ng c ñ men, s : Khay men, c i chày s , xoong n i ñ pha
ch môi trư ng.
- Các lo i d ng c cao su, v i, bông, băng: Găng tay ñ m và ñ r a
d ng c , ng, bông th m nư c, bông không th m nư c, v i g c, v i l c, v i
màn.
- Các lo i hóa ch t ñ ch môi trư ng, r a d ng c th y tinh và sát trùng
tiêu ñ c.
- Các lo i thu c nhu m và thu c th ph n ng sinh hóa.
- Các lo i gi ng vi khu n và virus, các lo i kháng huy t thanh ñ ch n
ñoán, các lo i khu n t ñ ch n ñoán.
III. KÍNH HI N VI
Kính hi n vi là m t d ng c quang h c r t c n thi t ñ nghiên c u hình
thái vi sinh v t và nghiên c u nh ng v t h t s c nh mà m t thư ng không th
nhìn th y ñư c, có nhi u lo i kính hi n vi khác nhau.
* C u t o kính hi n vi quang h c
Kính hi n vi quang h c g m có 2 b ph n:
1. B ph n cơ h c
1.1 Chân kính hay ñ kính
Dùng ñ ñ kính hi n vi tr ng thái cân b ng, c u t o t kim khí ñ c bi t.
1.2 Thân kính
N i li n v i chân kính, ñư c t o t lo i kim khí ñ c bi t. Thân kính ñ g n
toàn b các b ph n c a kính hi n vi.
1.3 ng kính
Là m t ng kim khí r ng hình tr l p trên tr kính, ñ u trên c a ng kính l p
th kính, phía dư i c a ng kính là bàn xoay dùng ñ l p các v t kính. Tác d ng
c a ng kính là khi v t nh ñư c phóng ñ i l n th nh t b i v t kính, thì ñưa v t
nh qua ng kính t i th kính ñ phóng v t nh l n th 2. Như v y v t nh ta
quan sát th y chính là nh o.
1.4 Khay kính hay ñĩa kính
Có th hình vuông hay hình tròn là nơi ñ t tiêu b n ñ quan sát, gi a có l
th u quang ñ ñưa ánh sáng t b t quang kính lên tiêu b n. Trên khay kính có
b ph n k p tiêu b n cho v ng và b ph n g i là xa ñ di chuy n tiêu b n theo
hai chi u khác nhau, t trái sang ph i, t trư c ra sau và ngư c l i ñ tìm v t
nh. Ngoài ra, khay kính còn có th di chuy n theo các chi u b ng cách v n hai
c hai bên khay kính.
1.5 c ñi u ch nh
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………7
- G m có c ñi u ch nh l n ( c sơ c p) và c ñi u ch nh nh ( c vi c p). c sơ c p
dùng ñ ñi u ch nh tiêu ñi m, c vi c p dùng ñ ñi u ch nh cho nh v t rõ nét.
2. B ph n quang h c:
2.1. Gương ph n chi u
ð t phía dư i khay kính g m có hai m t, m t m t ph ng và m t m t lõm,
dùng ñ l y ánh sáng.
2.2. T quang kính
ðư c l p vào phía dư i khay kính b i m t c c ñ nh, dùng ñ t p trung ánh sáng
vào tiêu b n.
2.3. B ph n ch n sáng
Có hình gi ng như con ngươi ñ t phía dư i t quang kính có th m r ng
hay h p dùng ñ ñi u hòa ánh sáng vào tiêu b n.
2.4. V t kính
Là m t h th ng quang h c r t quan tr ng và ph c t p, g m m t s th u
kính, nó tr c ti p phóng ñ i nh th t c a v t xem, kh năng phóng ñ i c a v t
kính ph thu c vào tiêu c t c là ph thu c vào bán kính cong c a th u kính;
th u kính càng cong, tiêu c càng ng n thì kh năng phóng ñ i càng l n. V t
kính khi dùng ñư c l p vào bàn xoay phía dư i ng kính. Có hai lo i v t kính:
+ V t kính khô: là v t kính có ñ phóng ñ i th p x8; x20; x40; dùng ñ
xem tươi, xem vi khu n di ñ ng, xem khu n l c, hay xem ký sinh trùng ho c
xem các tiêu b n t ch c...
+ V t kính d u: là v t kính có ñ phóng ñ i cao x 90; x100; x 120…, nó
có m t vòng khác màu ñ u v t kính ñ phân bi t v i v t kính khô.
V t kính khô và v t kính d u khác nhau ch t mà ánh sáng ph i ñi qua
tiêu b n (phi n kính) và v t kính. v t kính khô ch t ñi qua là không khí mà ch
s khúc x (chi t xu t) c a không khí là n = 1 r t khác v i ch s khúc x c a
th y tinh n = 1,52; do ñó các tia sáng khi ra kh i tiêu b n s b ph n x và ph n
ngoài c a chùm ánh sáng không l t ñư c vào v t kính.
v t kính có ñ phóng ñ i l n ngư i ta dùng d u b ch hương (huile de
cèdre) có ch s khúc x n =1,51 x p x v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52
ñ t vào gi a tiêu b n và v t kính. Lúc này th y tinh và d u b ch hương là m t
môi trư ng g n như ñ ng nh t, nên ánh sáng khi ñi qua th y tinh s không b
khúc x mà chi u th ng vào v t kính.
Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………8
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
