Giáo trình thực vật có hoa part 6

Chia sẻ: Afsjkja Sahfhgk | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:15

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Proteaceae chẳng hạn hoặc giải thích sự tồn tại các nhóm nguyên thủy của cây Có hoa rải rác trên các đảo Thái Bình Dương và lục địa Đông Nam á. Đó cũng là cơ sở để giải thích sự tồn tại các loài của họ Magnoliaceae có ở Tây Bắc Mỹ và Đông á trong thời đại ngày nay. Hạt phấn sớm nhất của Có hoa tìm thấy ở Crêta hạ (Raven and Axelrod, 1974). Trong suốt thời kỳ địa chất đó nhóm đại lục phía Bắc (Bắc Mỹ, Âu á) mà các nhà địa chất gọi là Laurasia...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình thực vật có hoa part 6

77 Proteaceae chẳng hạn hoặc giải thích sự tồn tại các nhóm nguyên thủy của cây Có hoa rải rác trên các đảo Thái Bình Dương và lục địa Đông Nam á. Đó cũng là cơ sở để giải thích sự tồn tại các loài của họ Magnoliaceae có ở Tây Bắc Mỹ và Đông á trong thời đại ngày nay. Hạt phấn sớm nhất của Có hoa tìm thấy ở Crêta hạ (Raven and Axelrod, 1974). Trong suốt thời kỳ địa chất đó nhóm đại lục phía Bắc (Bắc Mỹ, Âu á) mà các nhà địa chất gọi là Laurasia phân cách xa với khối ở phía Nam (Nam Mỹ, châu Phi, châu úc, châu Nam Cực và bán đảo ấn Độ) gọi là Gôndvana. Khi hai khối chuyển dịch nằm cạnh nhau là lúc cây có hoa đầu tiên xuất hiện trên trái đất (đầu Crêta). Những thông báo về hạt phấn nhiều nhất của cây có hoa khi mà các lục địa Gôndvana còn liên kết với nhau cho phép trao đổi các yếu tố thực vật. Các thực vật có sự phát tán phóng xạ khắp mọi phía chiếm các nơi sống thích hợp và tạo thành các ranh giới riêng. Địa lý sinh vật có sự ảnh hưởng lớn đến việc giải thích quan điểm tiến hóa cây có hoa. Việc giải thích mô hình phân bố và mối quan hệ lẫn nhau hoặc sự đứt quãng của giới hạn đã tạo sự chú ý của các nhà hệ thống học giải thích sự phân bố của các taxôn là một vấn đề trung tâm của địa lý sinh vật.
78 Chương 7 Các phương pháp phân loại 7.1 Phương pháp phân loại hình thái (Xem chương 9 và 10) 7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá Biểu bì lá là một dấu hiệu có ý nghĩa trong phân loại đã được nhiều người sử dụng trước hết cấu trúc của các kiểu tế bào biểu bì ví dụ ở Vulpa (hình 7.3) hay các kiểu lông trên bề mặt, ví dụ ở Combretum (hình 7.1). Các kiểu lông tùy theo điều kiện chúng ta có thể xem dưới kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2). Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lông, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc các lớp biểu bì để xem cấu tạo hệ thống lỗ khí hoặc người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt lá rồi sau đó bóc ra để xem cấu tạo các tế bào quanh lỗ khí. Ba mươi lăm kiểu lỗ khí đã tìm thấy trong thực vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn trong phân loại. Những kiểu đó thường có ý nghĩa ở các bậc taxôn cao. Ví dụ như ở Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, trong khi đó có liên quan chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm mạnh và các dấu hiệu đặc trưng rất hạn chế. Do đó người ta quan tâm các dấu hiệu giải phẫu cơ quan dinh dưỡng và tế bào học hơn trong đó các tế bào biểu bì được quan tâm. 7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ Cấu tạo giải phẫu gỗ được nghiên cứu trên các bản cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm và tiêu bản làm mủn. Nó có ý nghĩa lớn trong tiến hóa (hình 7.3 – 7.8). Dụng cụ nghiên cứu là kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi vật kính. 7.2.2.1 Làm tiêu bản lát cắt Theo tính chất của gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, nếu là gỗ mềm thì cắt trực tiếp ngay, không cần qua các bước xử lý cũng được. Nếu là gỗ cứng thì xử lý bằng glyxerin và cồn hoặc đun trong nước sôi và để vài tiếng đồng hồ mới tiến hành cắt. Mục đích cho tống hết các bọt khí làm cho gỗ mềm ra và tiêu bản nguyên vẹn. Chuẩn bị mẫu:
79 Hình 7.1. Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974) A. anomocytic, B. cycocytic; C. amphicyclocytic; D. actinocytic, E. anisocytic, F. amphianisocytic, G. adiacytic, H. amphidiacytic, I.paracytic, J. amphiparacytic, K. brachyparacytic, L. amphibrachyparacytic, M. hemiparacytic, N. paratetracytic, O. amphitetracytic, P. brachyparacytic, Q. amphibrachyparatetracytic, R. staurocytic, S. anomotetracytic, T. parahexacytic-monopolar, U. parahexacytic-dipolar, V. brachyparahexacytic-monopolar, W. brachyparahexacytic-dipolar, X. polocytic, Y. copolocytic, Z. axillocytic, AA. coaxillocytic, BB. desmocytic, CC. pericytic, DD. copericytic, EE. amphipericytic Hình 7.2. Các dạng lông tuyến của chi Combretum: 6 tuyến có cuống và các tuyến khác dạng khiên (theo Dilcher, 1974) * Khử nước ở nguyên liệu: Vật mẫu lấy ra khỏi dung dịch làm mềm phải được rửa thật kỹ bằng nước thường rồi ngâm lần lượt vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần
80 thứ hai và lần thứ ba. Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút hoặc hơn tùy theo độ dày của vật mẫu. * Chuyển vào dung môi trung gian: sau khi lấy mẫu ra khỏi cồn tuyệt đối lần thứ ba, chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, rồi lần thứ hai, mỗi giai đoạn để 1 - 2 giờ sau đó đưa vào xylen lần thứ nhất và lần thứ hai, mỗi giai đoạn không quá 30 phút. * Chuyển vào parafin: từ trong môi trường xylen ta chuyển tiếp như sau: Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), để ở nhiệt đồ bình thường trong 1 - 2 giờ. Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ. Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 3), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ, sau đó cho vào parafin nóng chảy trong tủ sấy ở nhiệt độ tủ cao không quá 62oC. Thời gian để phụ thuộc vào bề dày của mẫu và bản chất của mô, có thể để từ 10 - 12 giờ đến vài ngày. Nhiệt độ tủ sấy phải giữ đều. Hình 7.3. Các dạng tế bào biểu bì của Vulpia alopecuros: A. Mặt bụng; B. Mặt lưng và V. tenuis: C. Mặt bụng; D. Mặt lưng (theo Cotton và Stace, 1977). Tế bào silic có màu đen * Đúc khối parafin để dựng vật mẫu: Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào vật mẫu thì đem đúc thành khối, sau đó để nguội. Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào giữa khối parafin. Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau khi parafin đã đông đặc thì phải dùng một kim sắt hơ nóng để cho parafin chảy nóng trở lại. • Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: trong khối parafin nói trên thường chứa nhiều vật mẫu do đó phải chia mỗi mẫu nằm trong một khối parafin nhỏ riêng. Sửa các khối parafin mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vuông. Các cạnh đối diện của mặt cắt phải song song với nhau. Gắn khối parafin này lên một miếng gỗ nhỏ bằng cách hơ nóng lưỡi dao mổ trên đèn cồn rồi làm chảy parafin ở hai mặt cắt gắn với nhau. Sửa lại khối parafin một lần nữa để cho mặt cắt phải thật phẳng, các cạnh thật vuông góc với nhau và để cho các lát cắt vào ngay với mặt cắt.
81 - Tiến hành cắt: Có thể cắt bằng tay hoặc bằng máy cắt. Sau khi gỗ đã được làm mềm tiến hành cắt theo 3 mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến và xuyên tâm. Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa mỏng vừa giữ được các yếu tố nguyên vẹn. Sau đó sửa thành các mảnh một cách cân đối (vuông hay chữ nhật). - Loại parafin ở lát cắt: để có thể nhuộm và Hình 7.4. quan sát được vi phẫu, cần loại hết parafin trên lát cắt. Các giai đoạn tiến hóa của phiến rây từ kép đến Phương pháp loại parafin như sau: chuyển các mẫu đơn (Takhtajan 1964) qua lần lượt các ống Boren đựng các dung dịch dưới đây. Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút Xylen (lần thứ hai) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút Cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút Cồn 96o Thời gian 5 phút Cồn 70o Thời gian 5 phút Cồn 50o Thời gian 5 phút Cồn 30o Thời gian 5 phút Nước cất: Thời gian 5 phút Sau đó chuyển tiêu bản vào các chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu. * Nhuộm màu: Thuốc nhuộm safranin 1 - 9% trong cồn tuyệt đối, khi dùng ta phải pha lo•ng gấp đôi. Cách nhuộm: Lấy các lát cắt ra thấm khô và tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm safranin từ 5 phút đến 2 giờ. Sau đó cố định trong HCl và rửa bằng nước cất cho sạch. Chuyển sang giai đoạn loại nước. Loại nước: Để loại hết nước các bản cắt được ngâm trong các dung dịch cồn từ nồng độ thấp đến cao. Vì cồn tan trong nước và Hình 7.5. sẽ rút dần dần nước ra. Sau đó chuyển sang Lát cắt xuyên tâm gỗ của Tetracentro sinensis (Takhtajan dung dịch cồn + xylen. D•y các dung dịch 1964) xylen nồng độ cao dần để loại hết cồn ra (do keo canada chỉ tan trong xylen). Cuối cùng chuyển sang dung dịch xylen + cacbon có tác dụng khử trùng. Vật mẫu ngâm trong các dung dịch với khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút hoặc hơn.
82 * Dán tiêu bản: Chuẩn bị lamen và lam kính sạch. Đặt các lát cắt đã loại hết nước và ngâm trong dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada và đậy từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất hiện. Hình 7.6. 7.2.2.2 Làm tiêu bản ngâm mủn Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ từ kiểu hình thang của kiểu trung gian và từ kiểu đối nhau tới kiểu cách nhau Dựa trên nguyên tắc một số hóa chất có tác (Takhtajan 1964) dụng phá hủy màng gắn giữa các tế bào, làm cho các tế bào tách rời nhau ra. Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu từng tế bào nguyên vẹn mà không làm hư hại chúng. Phương pháp tiến hành như sau: * Làm mủn: Cũng lấy ở mẫu gỗ ban đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm, cho một vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3 và sau đó thêm một ít nước cho ngập gỗ và đun bằng đèn cồn khoảng 15 - 20 phút. Khi thấy các que gỗ đã trắng ra, dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để lắng và dùng nước cất rửa axit, sau đó ngâm trong cồn khoảng 15 phút. Tiến hành quá trình nhuộm. * Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm là Hình 7.7. safranin 1 - 9% trong cồn. Thấm khô mẩu Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ hình thang từ kiểu thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ gỗ mủn bằng giấy thấm, cho vài giọt chuyên hóa chỉ có một số vách ngang (Takhtajan 1964) thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu) để khoảng 5 phút, cố định bằng HCl, rửa nước và sau đó tiến hành loại nước. • Loại nước: Ngâm trong dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau đó là quá trình rút cồn khỏi tế bào bằng xylen (vì keo canada chỉ tan trong xylen chứ không tan trong cồn). Quá trình này tiến hành bằng cách chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai và cuối cùng là cacbon xylen tương tự như trên tiêu bản cắt lát.
83 • Dán tiêu bản: Sau khi mẫu đã được loại nước và thấm xylen lấy một ít 5 6 9 mủn, dùng kim mũi mác dàn đều trên lam kính đã sạch và khô, nhỏ vài giọt keo canada và từ từ đậy lamen. 4 8 3 2 1 A 7 B Hình 7.8. Sơ đồ tiến hóa của các kiểu chính của tia (A) và nhu mô gỗ (B) 1. Dị hình hỗn hợp với tần cùng dài; 2. Dị hình hỗn hợp với tận cùng ngắn; 3. Dị hình một dãy; 4. Đồng hình hỗn hợp; 5. Đồng 7.2.2.3 Quan sát hình nhiều dãy; 6. Đồng hình một dãy; 7. Nhu mô phân tán; 8. Không dính mạch trong giải (gian mạch); 9. Nhu mô quanh bó * Quan sát bằng mắt thường cấu tạo (Takhtajan 1964) chung của gỗ. * Quan sát trên kính hiển vi và mô tả. * Đo đạc trên kính hiển vi dựa trên trắc vi vật kính và trắc vi thị kính các yếu tố cần mô tả. * Chụp ảnh và mô tả. 7.2.2.4 Đánh giá và phân loại Căn cứ trên bản mô tả và các sơ Hình 7.9. đồ tiến hóa, chúng ta phân tích, Các giai đoạn tiến hóa của các thành phần mạch với kiểu thủng lỗ đơn, ở đánh giá các mức độ tiến hóa khác phần mạch đầu tiên trên bản thủng lỗ dưới còn lại một vạch ngang (Takhtajan 1964) nhau, có thể lập thành khóa xác định. 7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa Phấn hoa là một dấu hiệu được nhiều nhà phân loại sử dụng bởi tính ổn định của nó, dễ lấy mẫu, phương pháp đơn giản, ít tốn kém và thời gian tiến hành ngắn phù hợp với nghiên cứu trong phân loại. Mặt khác chúng thể hiện các mức độ tiến hóa một cách rõ ràng qua các dấu hiệu về hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt rất đa dạng của chúng cũng như sự có mặt rãnh, số lượng rãnh, sự có mặt các lỗ, số lượng của chúng trên rãnh, cấu trúc rãnh (hình 7.10 - 7.12).
84 4 3 2 1 Hình 7.10. Hình thái hạt phấn 1. Hình bầu dục đứng; 2. Hình cầu gai; 3. Hình ngũ giác gai thấp; 4. Hình bầu dục đứng rộng bề mặt mạng lưới (Webster) Phương pháp này tiến hành theo các bước sau: + Lấy mẫu nghiên cứu: mẫu hạt phấn lấy từ hoa đã trưởng thành của các mẫu cho vào một túi giấy nhỏ và ghi rõ tên khoa học của tiêu bản, số hiệu và nơi lưu giữ. + Xử lý mẫu: hiện nay có nhiều phương pháp để xử lý mẫu bào tử phấn hoa nhưng phương pháp axetolyza được sử dụng phổ biến, nhuộm và làm sáng. Các bước tiến hành như sau: * Cho mẫu chứa phấn hoa vào ống nghiệm, khẽ nghiền nhỏ. * Pha hỗn hợp axetoliza: cho vào ống đo 4,5 ml alhydric, sau đó cho thêm vào 5 ml H2SO4 đậm đặc. A * Đổ hỗn hợp trên vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hoa, sau đó đun sôi trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 70 – 100oC, vừa đun vừa khuấy đều bằng đũa thủy tinh, rồi đưa ra ly tâm 3 phút với vận tốc 300 vòng/phút, đổ dịch trong đi. * Rửa vật mẫu nhiều lần bằng cách cho hỗn hợp cồn 95o và nước cất theo tỷ lệ 3:1 vào ống nghiệm rồi ly tâm và đổ nước đi, cho thêm một ít nước cất vào ống nghiệm, lọc mẫu. * Chia vật mẫu thành 3 phần A,B,C và xử lý tiếp như B sau: Hình 7.11. • Phần A cho thêm vào ống nghiệm hỗn hợp cồn 95o Ảnh hiển vi cấu trúc bề mặt hạt phấn A: với nước cất theo tỷ lệ 3:1, ly tâm và gạn nước trong đi. một loài trong họ Cúc - Compositae; B: một loài trong họ Thầu dầu – • Phần B nhuộm màu. Cho vào ống nghiệm chứa mẫu Euphorbiaceae phấn hỗn hợp và nước cất và 1 giọt fusxin, để yên từ 2 - 5 phút; quay ly tâm gạn nước trong và rửa vật mẫu bằng hỗn hợp cồn và nước cất rồi ly tâm gạn nước trong. • Phần C làm mẫu sáng. Rửa vật mẫu trong hỗn hợp cồn và nước cất, ly tâm gạn nước trong. Đổ hỗn hợp làm sáng mẫu vào ống nghiệm để yên 2 phút sau đó ly tâm 5 phút gạn nước trong. Hỗn hợp làm sáng gồm có: Axit axetic đặc (8ml), NaClO3 30% (12 giọt), HCl (1ml). Đổ phần B và phần C vào phần A, cho vào ống nghiệm một ít nước cất khuấy đều, ly tâm 5 phút rồi gạn nước trong.
85 Rửa vật mẫu bằng cồn 95o và nước cất, ly tâm và gạn nước trong. Cho vào ống nghiệm một ít glyxerin đặc, khuấy đều rồi để yên. + Làm tiêu bản hiển vi hạt phấn: hút mẫu bằng pipet, nhỏ một ít dịch mẫu lên lam kính để soi, quan sát (chụp ảnh, mô tả, đo kích thước trên các tiêu bản tạm thời với kính hiển vi quang học ở các vật kính *20, *40. + Phương pháp đo hiển vi: để đo kích thước hạt phấn gồm đo trục xích đạo và trục cực của hạt phấn dùng thước đo vật kính và thước đo thị kính. Mỗi chỉ số đo ít nhất 30 mẫu, các số đo kích thước được xử lý theo phương pháp thống kê để tính được kích thước trung bình và độ lệch chuẩn của mỗi mẫu. + Phương pháp mô tả: đối với mỗi loài cần có một bản mô tả. Đây là phần tư liệu cơ sở của nghiên cứu, sơ đồ mô tả gồm: Tên khoa học, họ; địa điểm thu mẫu, người thu, số hiệu, nơi lưu giữ như Bảo tàng hay phòng mẫu; kiểu hạt phấn, kích thước và các đặc điểm khác... + Phương pháp chụp ảnh hiển vi: phương pháp này nhằm mục đích minh hoạ cho phần mô tả hình thái hạt phấn, đòi hỏi phải phản ánh chính xác hình dạng, cấu trúc hạt phấn ở các vị trí khác nhau trong đó cơ bản là hai vị trí: cực và xích đạo, đôi khi cả vị trí nghiêng nếu cần. Phải làm rõ cấu trúc phân lớp của vỏ hạt phấn bằng các ảnh phân tích sáng. Các quan sát để chụp ảnh tiến hành trên các tiêu bản tạm thời gắn trong glyxerin với kính hiển vi quang học. Hiện nay với kỹ thuật hiện đại người ta có nhiều cách chụp khác nhau để thể hiện một cách đầy đủ các chi tiết của đối tượng. + Đánh giá và lập khóa định loại: trên cơ sở những thông số mô tả chúng ta căn cứ trên những dấu hiệu liên quan đến tiến hóa để xây dựng khóa phân loại. 7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ thể nhiễm sắc của toàn bộ các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao. Để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc phục vụ cho hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào nguyên nhiễm cụ thể người ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng đang ở giai đoạn phân chia mạnh nhất và vùng phân chia ở ngay ở dưới lớp bao của các cơ quan đó. Bên cạnh đó người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể người ra dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau hay khi mới nhú bông hoặc nụ hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống nghiệm. Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt độ 23 – 25oC cho hạt nẩy mầm. Thời gian nẩy mầm tuỳ theo từng loại 1 - 2 ngày đến vài tuần lễ. Độ dài của rễ từ 0,8 - 2 cm là dùng được. Người ta tiến hành dùng panh hay kim mũi mác ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định. Bên cạnh gieo hạt trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất ẩm và tơi xốp. Đối với các loài cây gỗ có hạt to và có vỏ cứng tốt nhất lấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng của thân hay lá non hoặc có thể trồng thành cây con và sau đó lấy trực tiếp từ đỉnh rễ non. Trước khi lấy 1 - 2 giờ hoặc từ đêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủ ẩm để kích thích rễ phát triển. Thời gian lấy rễ tốt nhất trong khoảng 8 - 10 giờ sáng tùy mùa, đối với các loài cây sinh sản
86 bằng căn hành, thân củ hay bằng hom v.v. thì phải đặt hom, củ hay căn hành trong cát ướt hoặc trong lọ đựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo. Hình 7.12. Hình thái rãnh trên bề mặt hạt phấn (Webster) 1., 2. Hạt phấn 3 rãnh, 3. Hạt phấn 4 rãnh; 4. Hạt phấn nhiều rãnh; 5. Hạt phấn 4 rãnh; 6. Hạt phấn 3 rãnh; 7. Hạt phấn 1 rãnh; 8.Hạt phấn không rãnh 7.4.1.1 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định Trong một số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc hoặc thể nhiễm sắc quá dài thì trước khi cố định phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8 - oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen hoặc làm lạnh. Đối tượng sau khi ngắt khỏi cơ thể thực vật phải cho ngay vào dung dịch 8 - oxyquinolin ở nồng độ 0,002 M ở nhiệt độ 10-14oC trong khoảng 3 giờ. Trong trường hợp này người ta pha dung dịch như sau: dùng 0,58 g 8 - oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm. Xử lý bằng chất này để làm tăng độ lớn của thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài của chúng, đồng thời làm cho các eo sơ cấp và thứ cấp hiện rõ hơn. Muốn xem thể nhiễm sắc dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý đối tượng cần làm lạnh ở 0oC trong 24 giờ vì lúc đó thể nhiễm sắc sẽ co ngắn đáng kể. Kagava đã ngâm trong dung dịch chloranhydrat 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm sắc sau đó cho vào nước cất để rửa trong một giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 - 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định. Những năm gần đây người ta sử dụng dung dịch Consixin 0,01 - 0,05% để xử lý trong thời gian 2 giờ trước khi cố định. Đối với lá non người ta ngâm trong dung dịch consixin 0,2% trong 1 - 2 giờ. Người ta cũng có thể dùng dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc để xử lý rễ ở nhiệt độ 12 - 16oC trong 2 - 3 giờ. Để có dung dịch này chúng ta lấy 5 - 10 g tinh thể paradiclorobenzen hòa tan trong 500 ml nước cất để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 60oC trong 10 - 12 giờ. Để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch consixin kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ. Hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 60oC. Để nghiên cứu hình thái thể nhiễm sắc đôi khi trước khi cố định người ta xử lý theo một trong các phương pháp sau: 1. Ngâm vào dung dịch cumarin 2% trong 2 giờ ở nhiệt độ 12-16oC 2. Ngâm vào hỗn hợp dung dịch cumarin 2% và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ 16oC (Nikolop Daxcalop, 1966).
87 7.4.1.2 Cố định vật mẫu Vật mẫu sau khi đã được xử lý được chuyển vào dung dịch cố định trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào các dung dịch khác nhau. Khi tiến hành cố định cần chú ý một số nguyên tắc: 1. Lượng dung dịch để cố định phải nhiều hơn khối lượng của vật mẫu cố định 50 - 100 lần. 2. Cố định vật mẫu ngay sau khi vừa tách vật mẫu ra khỏi cơ thể cây, không được tiến hành việc cố định ngoài ánh nắng. 3. Đối với vật mẫu lớn phải tách nhỏ hoặc bỏ những bộ phận không cần thiết trước khi cố định. 4. Trước khi lấy mẫu ra khỏi cây phải tạo mọi điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, về độ ẩm để thúc đẩy quá trình phân chia tế bào như tưới nước, để ở nhiệt độ 20 - 25oC. 5. Phải chuẩn bị các ống nghiệm, tốt nhất là các lọ penicilin hay lọ nút nhám có nh•n đầy đủ. Nh•n trên lọ phải khớp nh•n trên đĩa petri, trên chậu hay trên đồng ruộng. 6. Nếu cây trồng trong chậu thì dùng tay trái lật ngược chậu lên và dùng tay phải bỏ chậu ra. Các rễ mới mọc sẽ bám trắng xung quanh bồn đất. Dùng kéo cắt các rễ non trắng nõn, khoắng vào chậu nước cho sạch đất rồi nhúng ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định. Nếu gieo hạt trong đĩa petri thì dùng panh và kim mũi mác để ngắt rễ. Mỗi lần ngắt xong cho ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố định. Hiện nay có nhiều loại dung dịch cố định khác nhau. Về nguyên tắc các dung dịch này có tác dụng làm cho tế bào thực vật chết một cách nhanh chóng mà không gây ảnh hưởng đến số lượng và hình thái thể nhiễm sắc của tế bào. Để nghiên cứu thể nhiễm sắc người ta thường dùng nhất dung dịch Navasin và Cacnua. Tất cả các thuốc cố định hoặc được pha trong cồn hoặc được pha trong nước. Thuốc pha trong cồn thường ngấm nhanh hơn nên chỉ giữ vật mẫu trong đó từ 30 phút đến 12 giờ, còn thuốc pha trong nước mức độ ngấm vào mô chậm hơn do đó có thể giữ trong đó đến 24 giờ hay lâu hơn nữa. * Dung dịch Navasin 10:4:1 Dung dịch này được sử dụng phổ biến hiện nay. Thời gian cố định các rễ non là 24 giờ trong tối. Thành phần: • Axit cromic 10% : 10 phần • Foocmalin 16% tức là foocmalin thị trường 40% : 4 phần • Axit axêtic đã kết băng: 1 phần Thuốc này chỉ pha ngay trước khi dùng vì rất nhanh hỏng. Đây là thuốc có tác dụng rất dịu và giữ được cấu trúc của thể nhiễm sắc tốt. * Dung dịch Cacnua 6 : 3 : 1 : Dung dịch này được sử dụng phổ biến hơn. Thời gian cố định từ 2 - 12 giờ. Thành phần: • Cồn êtylic 96% hay 100%: 6 phần • Clorôphooc: 3 phần • Axit axêtic đã kết băng: 1 phần * Dung dịch Clac (còn gọi là dung dịch Cacnua cải tiến 3 : 1) Thời gian cố định 2 - 12 giờ đôi khi có thể để lâu hơn, nhiệt độ 0-3oC Thành phần:
88 • Cồn êtylic 96 độ hay 100 độ : 3 phần • Axit axêtic đã kết băng : 1 phần Ba loại dung dịch trên đây được sử dụng phổ biến nhất hiện nay vừa đơn giản, vừa dễ kiếm. Ngoài ra hiện nay đối với đối tượng thực vật có thể dùng các công thức sau (Sacma, 1965): 1) - Axit propionic: 1 phần - Cồn êtylic 95 độ: 3 phần hoặc : - Axit propionic: 100 ml - Cồn êtylic 95 độ: 100ml - Hydroxit sắt : 0,4 g 2) - Axit propionic: 1phần - Clorophooc: 4 phần - Cồn êtylic 95 độ: 8 phần 3) - Phoocmalin: 1 phần - Cồn êtylic 95 độ: 15 phần - Axit propionic: 1 phần Dung dịch thứ 3 này có tác dụng trong 1 - 2 giờ và được dùng cho thực vật lẫn động vật. 7.4.1.3 Rửa vật mẫu Sau khi cố định xong vật mẫu cần được rửa sạch thuốc cố định. Đối với thuốc pha trong nước người ta cho vật mẫu lẫn nh•n vào túi vải màn rồi cuộn lại ngâm vào trong cốc thủy tinh chứa nước và phía trên được đặt một vòi nước chảy liên tục. Thời gian rửa 1 - 2 giờ trong mùa hè, 2 - 3 giờ trong mùa đông. Sau khi rửa xong phải làm mất nước bằng cách cho vào dung dịch cồn êtylic theo từng mức độ 20%, 40%, 60%, 80%. Mỗi lần ngâm trong thời gian 30 phút mục đích để cho vật mẫu không bị quăn lại trong khi làm mất nước. Sau khi làm mất nước người ta có thể giữ vật mẫu lâu dài trong cồn 80%. Đối với thuốc cố định pha cồn thì vật mẫu sau khi cố định xong được rửa sạch trong cồn 80% mỗi lần 1 - 2 giờ cho đến khi hết mùi axit axêtic. Muốn thế người ta dùng vải màn bịt lọ rồi đổ thuốc ra và đổ cồn 80% vào, sau 1 - 2 giờ lại thay cồn 1 lần. Vật mẫu đã rửa sạch có thể giữ lâu dài trong cồn 80%. Để đơn giản người ta có thể rửa vật mẫu bằng nước cất rồi giữ vật mẫu trong tủ lạnh. 7.4.1.4 Làm mủn vật mẫu Giai đoạn này rất quan trọng nhất là đối với vật mẫu chuẩn bị làm tiêu bản ép. Để làm mủn người ta dùng axit axêtic 45%, axit propionic 40 - 45%, chloranhydrat, axit chlohydric 1N hoặc các enzym. ở đây chúng tôi giới thiệu phương pháp đơn giản và dễ làm như sau: Sau khi rửa vật mẫu bằng nước cất liền cho vật mẫu ngâm vào dung dịch HCl 1N trong 5 phút (dung dịch HCl 1N được chuẩn bị như sau: Lấy 82,5 ml HCl tỷ trọng 1,19 cho nước cất vào tới mức 1000 ml) Sau đó tiếp tục cho vật mẫu vào dung dịch HCl: H2O (tỷ lệ 1 : 1) trong thời gian 20 phút. Rửa vật mẫu trong nước theo phương pháp trên. 7.4.1.5 Nhuộm vật mẫu Phương pháp nhuộm vật mẫu để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc có nhiều, ở đây chúng tôi chỉ giới thiệu hai phương pháp chính dễ sử dụng và cho kết quả tốt: 1. Nhuộm bằng axêtôcacmin
89 Chuẩn bị thuốc nhuộm: lấy 1 g cacmin hòa vào 45 ml axit axêtic đã kết băng và 55 ml nước cất. Việc hòa tan được tiến hành trong bình cầu có thiết bị làm nguội, đặt bình cầu trên bếp, đun cách thủy trong thời gian 30 - 60 phút, nếu không có thiết bị làm nguội thì đậy bằng một cái phễu trước khi đặt lên bếp. Dung dịch axêtocacmin có màu đỏ tối, sau khi làm lạnh thì được lọc và đổ vào lọ đậy nút nhám (cặn trên giấy lọc có thể sử dụng lại cho lần sau). Theo Snao (1953) có thể chuẩn bị cacmin trong cồn êtylic có thêm HCl. Muốn vậy thì lấy 4 g cacmin hòa tan vào 15 ml nước nóng cho thêm 1ml HCl để nguội rồi đổ vào 95 ml cồn 85% rồi lọc. Cách nhuộm: Cho vật mẫu vào dung dịch thuốc nhuộm trong 5 phút, rửa trong nước rồi chuyển vào dung dịch phèn sắt amôni 3 - 5% và hơ nóng cho đến bốc hơi. 2. Nhuộm bằng hêmatôxylin: Chuẩn bị thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm hêmatôxylin có nhiều công thức nhưng để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc, chúng tôi giới thiệu công thức của Gormôri vừa đơn giản vừa dễ làm: * 1 g hêmatôxylin hòa tan trong 100 ml nước; * 3 g phèn crôm hòa tan trong 100 ml nước; * 4 ml crômat kali hoặc bicrômat kali; * 4 ml H2S04 5%. Nếu hêmatôxylin có dạng hạt, trước hết hòa tan với một ít cồn sau khi đã hòa tan riêng biệt từng loại một ta lần lượt hỗn hợp lại 4 thứ với nhau theo thứ tự như sau: Phèn crôm - hêmatôxylin - crômat kali - H2S04 dung dịch được để yên 2 - 3 ngày sau mới được sử dụng. Thời gian sử dụng thuốc từ 4 - 8 tuần lễ. Cách sử dụng: Vật mẫu sau khi đã làm mủn trong HCl rửa vật mẫu bằng nước cất rồi cho ngâm vào dung dịch hêmatôxylin để trong tủ ấm 60oC trong thời gian 20 - 30 phút. 7.4.1.6 Làm tiêu bản tạm thời Sau khi nhuộm vật mẫu, vớt vật mẫu ra cho vào lọ nước cất và có thể giữ lâu dài ở đó trong nhiệt độ 30oC. Vật mẫu được vớt lên bản kính đặt trong một giọt axit axêtic 45% gạt bỏ phần thừa rồi đậy phiến kính lên một cách nhẹ nhàng tránh các bọt khí, dùng que diêm hay đầu của kim mũi mác ấn nhẹ làm cho vật mẫu dát mỏng đều đặn và từ từ. Nếu vật mẫu cứng khó dát mỏng thì trước đó cần hơ qua trên đèn cồn để cho vật mẫu mềm ra (chú ý khi hơ tránh làm khô nước axit axêtic dưới phiến kính). Khi dát xong trên phiến kính, quan sát từ bộ giác nhỏ đến bộ giác lớn để tìm những tế bào đang có các thể nhiễm sắc tách rời nhau rõ nhất và có bộ thể nhiễm sắc hiện cấu trúc rõ nhất và đầy đủ nhất. 7.4.1.7 Chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định Trong thực tế có nhiều phương pháp chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định. Phương pháp đơn giản nhất dùng khí cacbonic để làm rắn tiêu bản. Quá trình tiến hành như sau: Sau khi đã quan sát thấy rằng tiêu bản tạm thời tốt thì chuyển ngay sang giai đoạn cố định bằng cách mở van bình khí cacbonic xì vào mặt lưng của tiêu bản, nước trong tiêu bản, kết tinh lại và tiêu bản hóa đá, lấy lưỡi dao cạo râu tách phiến kính ra khỏi bản kính, dùng cặp con kẹp lấy phiến kính rồi cho cả bản kính và phiến kính vào lọ cồn 96o - 100o. Sau 10 - 30 phút vớt ra hong khô bằng không khí trong phòng. Vật mẫu được dán bằng Euparon. Nếu không có Euparon thì phải dán bằng keo Canada.
90 Cách tiến hành có thể thay đổi như sau: Vật mẫu ngâm trong cồn 96o từ 2 - 3 phút rồi chuyển sang cồn 100o trong 2 - 5 phút, cồn 100o và Xylen từ 2 - 5 phút, cuối cùng chuyển vào Xylen, sau đó dán tiêu bản bằng keo Canađa. C 1 2 3 4 5 6 Hình 7.13. Hình ảnh NST từ tiêu bản (A), vẽ lại (B) và sơ đồ hóa (C) (theo Stace 1996) 7.4.1.8 Xác định vị trí tế bào và đo đếm, chụp ảnh thể nhiễm sắc Sau khi đã dán tiêu bản và hong khô cho tiêu bản lên kính hiển vi có đầy đủ 3 vật kính. Quan sát từ vật kính nhỏ đến vật kính lớn để xác định các tế bào chứa các thể nhiễm sắc rõ và thể hiện cấu trúc tốt nhất rồi dựa vào thước đo trên bàn kính hiển vi để đánh dấu số hiệu mẫu nghiên cứu và số hiệu của vị trí các tế bào tốt được ghi vào một nh•n con được dán vào một đầu của bản kính. Các bước nghiên cứu trước hết tiến hành đếm số lượng thể nhiễm sắc trên nhiều tế bào của một tiêu bản và trên nhiều tiêu bản để khẳng định một cách chính xác. Mỗi loài cần được thu mẫu và tiến hành nghiên cứu trên nhiều địa điểm cách xa nhau, ít nhất từ 3 địa điểm trở lên. Sau khi đã khẳng định chính xác số lượng thể nhiễm sắc của loài thì sang bước 2 tiến hành xác định tế bào thể hiện hình thái thể nhiễm sắc tốt nhất rồi tiến hành vẽ hay chụp ảnh. Để vẽ hình thái thể nhiễm sắc người ta dùng dụng cụ vẽ PA - 4 lắp trên ống nối của kính hiển vi. Bên cạnh ảnh chụp thì việc vẽ hình rất cần thiết vì nó phản ảnh đầy đủ rõ nét những dấu hiệu nằm ở độ sâu khác nhau mà ảnh chụp không tài nào thể hiện được. Ngoài việc vẽ và chụp ảnh người ta còn tiến hành đo kích thước thể nhiễm sắc bằng cách lắp trắc vi vật kích và trắc vì thị kính vào kính hiển vi nhưng đòi hỏi khi tiến hành thí nghiệm cần phải thống nhất các bước và thời gian thu mẫu, thời gian xử lý, thời gian cố định cũng như thời gian nhuộm... 7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc Chúng ta có thể quan sát rõ hình thái thể nhiễm sắc ở pha giữa (metaphase) của sự phân bào vì giai đoạn này hình thái và cấu trúc thể thể nhiễm sắc hiện rõ nhất đó là lúc mà thể nhiễm sắc đông đặc nhất và dễ bắt màu nhất. Thể nhiễm sắc có hình que, hình chữ I hay hình chữ V có một chỗ eo gọi là eo cấp I chia thể nhiễm sắc thành 2 vai. Vị trí đó tương ứng với vị trí của tâm động (centromere). Tuỳ theo vị trí của tâm động mà người ta phân biệt các thể nhiễm sắc thành các kiểu khác nhau. Theo Levan et al. (1965, ghi theo Clive A. Stace, 1996) đã đưa ra thang phân chia loại nhiễm sắc thể theo tỉ lệ của vai dài so với vai ngắn, theo đó: M (m): 1 - 1,7; Sm: 1,7 - 3; SA: 3 - 7; A: 7 * * và T: *
91 7.4.2.1 Thể nhiễm sắc tâm cùng (Telocentric) kí hiệu T Là thể nhiễm sắc có tâm động ở tận cùng, vì thế thể nhiễm sắc bao gồm chỉ một vai. Loại này ít gặp ở thực vật. 7.4.2.2 Thể nhiễm sắc tâm mút (Acrocentric) kí hiệu A Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 7 - ∞ Hình 7.14. Hình thái và các kiểu nhiễm sắc thể (Levan et al. theo Stace 1996) 7.4.2.3 Thể nhiễm sắc tâm cận mút (Subacrocentric) kí hiệu Sa Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 3 - 7. 7.4.2.4 Thể nhiễm sắc tâm cận lệch (submetacentric) kí hiệu Sm Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm lệch xa khỏi điểm trung tâm, tỉ lệ vai dài và vai ngắn là 1,7 - 3,0. 7.4.2.5 Thể nhiễm sắc tâm giữa (Metacentric) kí hiệu M (m) Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm ở khoảng giữa, tỷ lệ của vai dài so với vai ngắn khoảng 1 - 1,7 (kí hiệu m), trong trường hợp tỉ lệ đó bằng 1 thì được gọi là thể nhiễm sắc tâm cân (M). Sơ đồ hóa hình thái thể nhiễm sắc được trình bày trong hình 7.14 trên. Một số thể nhiễm sắc có thêm eo thứ 2. Eo này thường nằm ở phần cuối của một vai ở một số khác ở tận cùng thể nhiễm sắc có mang một phần phụ hình cầu hay hình dài gọi là thể kèm. Thể kèm được nối với phần chính bởi một sợi nhỏ và vì không có axit Thymenucleic (sine acido thymonucleico) trong đó nên có tên gọi thể nhiễm sắc SAT; thật ra trong đó vẫn có ADN như trong phần chính của thể nhiễm sắc (Gây, 1931). Đối với tất cả các tế bào của cơ thể thì thể nhiễm sắc có hình dạng không đổi và cũng cố định đối với loài và cả chi nữa. Vị trí tâm động, chiều dài các vai, eo cấp 2 và thể kèm qui định đặc tính cá biệt của từng thể nhiễm sắc và ngay cả từng loài nữa. Bên cạnh các thể nhiễm sắc bình thường như đã trình bày ở trên gọi là thể nhiễm sắc A, ở một số loài và ngay một số cá thể trong cùng một loài người ta còn thấy xuất hiện một số thể