Giáo trình Vi sinh vật học part 8

Chia sẻ: Afasg Agq | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

155
lượt xem 45
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất chua. Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định N phân tử. e. Phân đạm Trong đất Azotobacter có khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn N đối với Azotobacter không phải chỉ là N phân tử mà còn là muối amon, nitrat, amino acid. Tuỳ thuộc vào nồng độ của các hợp chất chứa N có trong môi trường mà quá...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh vật học part 8

187 chroococcum và A. beijerinck khoảng 5,5; đối với A. marocytoges là khoảng 4,6. Phần lớn Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn hơn 6, vì vậy ít gặp chúng ở đất chua. Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định N phân tử. e. Phân đạm Trong đất Azotobacter có khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng từ môi trường. Nguồn N đối với Azotobacter không phải chỉ là N phân tử mà còn là muối amon, nitrat, amino acid. Tuỳ thuộc vào nồng độ của các hợp chất chứa N có trong môi trường mà quá trình cố định N sẽ bị ức chế nhiều hay ít . g. Phân lân. Phốt pho rất cần cho quá trình cố định N của Azotobacter chỉ bắt đầu xảy ra khi nồng độ PO43- đạt đến 4 mg trong 100 ml môi trường. Ngược lại khi nồng độ PO43- đạt tới 800 mg trong 100 ml quá trình cố định N sẽ bắt đầu ngừng lại. Sự mẩn cảm mạnh mẽ của Azotobacter với phốt pho cho phép người ta sử dụng chúng như loại vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về phospho của đất. h. Phân kali. Sự phát triển của Azotobacter rất cần đến kali, nhưng với lượng nhỏ. Nếu đưa vào môi trường một lượng muối kali quá dư thừa chúng sẽ làm ức chế sự phát triển của Azotobacter, có thể tác hại này là do gốc anion của muối này gây ra. i. Canxi. Canxi ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Azotobacter. Khi thiếu canxi tế bào Azotobacter sẽ tạo thành nhiều không bào ảnh hưởng xấu đối với việc tổng hợp ATP và sự tạo thành các polyphotphat. Những điều tra ở Việt Nam cho thấy trong đất có lượng chứa CaO cao hơn 0,4% luôn có mặt một số lượng lớn các tế bào Azotobacter. Hầu như không phát triển trong mẫu đất có có lượng chứa CaO dưới 0,25% (Nguyễn Lân Dũng 1965) Riêng đối với A.chroococcum nồng độ CaCl2 ,thích hợp nhất là 0,01% ,nếu cao hơn sẽ ảnh hưởng không tốt đối với hoạt động cố định N của chúng. Có tác giả đã dùng A. chroococum như là loài vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về vôi của đất, nguyên tố Mg được Azotobacter đòi hỏi với số lượng cao hơn sắt khoảng 10 lần .
188 Cùng với nguyên tố đại lượng, các nguyên tố vi lượng cũng cần thiết đối với Azotobacter, đáng chú ý hơn cả là molybden, bo(Bo), mangan(Mn) k. Các nhân tố sinh học Sự phát triển và cố định N của Azotobacter trong đất còn chịu ảnh hưởng mật thiết của khu hệ các sinh vật đất. Bên cạnh các nhóm vi sinh vật có ảnh hưởng tốt còn có nhiều nhóm có khả năng ức chế sự phát triển của Azotobacter . Đã có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ gữa Azotobacter với cây trồng với số lượng cao hơn nhiều so với ngoài vùng rễ . Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có tác dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria …) 1.6. Tình hình nghiên cứu ứng dụng Azotobacter. Trong nhiều năm, ở nhiều nước khác nhau ,người ta đã sản xuất ở quy mô công nghiệp hoặc thủ công nghiệp những chế phẩm Azotobacter và gọi là azotobacterin. Đó là những dịch nuôi cấy Azotobacter được hấp thụ vào than bùn hoặc các loại đất giàu chất hữu cơ đã trung hoà và bổ sung thêm một ít phân phospho, kali… Khác với nitragin, azotobacterin khi dùng để bón cho cây trồng thường đưa đến những hiệu quả không lớn và không ổn định (nếu có làm tăng sản lượng thường cũng không tăng quá 10% so với đối chứng ). Đa số các tác giả cho rằng hiệu quả của việc sử dụng azotobacterin chỉ tương đối với các đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều phân khoáng. Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sinh trưởng của cây trồng . Ở Việt Nam, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm azotobacterin chỉ đặt ra trong những điều kiện thâm canh có khả năng dồi dào về phân bón, cần bón vôi và bón phân lân để làm tăng số lượng Azotobacter trong đất. Azotobacterin chỉ có tác dụng tương đối rõ đối với các loại đất giàu chất hữu cơ hoặc trong trường hợp được bón thêm nhiều chất khóang.Có lẽ tác dụng chủ yếu của chúng không phải ở khía cạnh cố định N mà là ở khía cạnh tổng hợp các chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây trồng . a. Các phương pháp tạo chế phẩm Azotobacter
189 * Dạng môi trường thạch nghiêng Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Thành phần môi trường (g/l):Glucose-20; K2HPO4.3H2O -0,2; MgSO4 .7H2O -0,2; NaCl- 0,2; K2SO4 -0,1; CaCO3 -5,0; H20 -1 lít ;Thạch - 20 pH: 6,5-7. Chuẩn bị giống Azotobacter :Các ống giống đã được phân lập và tuyển chọn từ trước. Tạo chế phẩm: Cấy truyền giống vi khuẩn Azotobacter từ giống gốc vào những ống nghiệm thạch nghiêng. Ủ ấm ở nhiệt độ: 28-30 0 C trong thời gian 2-6 ngày, loại bỏ những ống bị nhiễm vi sinh vật khác ta thu được chủng Azotobacter thuần khiết. * Dạng dịch thể Chuẩn bị môi trường dịch thể Thành phần môi trường (g/l): Glucose 20 K2HPO4.3H2O 0,2 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,2 K2SO4 0,1 CaCO3 5,0 H2O 1 lít pH 6,5-7 Chuẩn bị giống vi khuẩn Azotobacter : Lấy 5-10 ml môi trường dịch thể (Có thành phần như trên không có thạch) đã khử trùng cho vào mỗi ống nghiệm φ 14 5ml Dùng que cấy gạt nhẹ, đưa dịch vi khuẩn vào bình nón (250- 500ml) đựng 150ml môi trường và nuôi chúng trên máy lắc(220 dao động/phút) . Khi khi dịch nuôi đạt mật độ 109 tế bào/ml thì có thể đem sử dụng * Dạng bột Nuôi cấy giống vi khuẩn Nhân giống Hâp thụ giống vào chất mang vi khuẩn Điểm quan trọng cua phương pháp này là lựa chọn chất mang vi khuẩn, chất mang vi khuẩn phải đạt yêu cầu thích hợp vớ sự tồn tại của Azotobacter trong quá trình bảo quản và độ sống sót trên hạt giống khi được tẩm vào, chất mang vi khuẩn có thể là than bùn, đất bột giàu chất hữu cơ, có nơi sử dụng cả trấu, bã bia làm chất mang vi khuẩn
190 Ngày nay chất mang vi khuẩn được sử dụng bởi than bùn thích hơp trong việc sử dụng chế phẩm vi khuẩn nói chung và chế phẩm Azotobacter nói riêng. Ngoài đặc tính của than bùn là không độc, có tính hấp thụ cao, giữ nước tốt , nó còn là nguyên liệu rẻ tiền sẳn có ở nhiều nơi. 1.2. Clostridium pasteurianum và một số VSV cố định N khác C.pasteurianum là trực khuẩn kị khí bắt buộc, có bào tử, bào tử nằm ở giữa làm tế bào phình lên như hình thoi. C. pasteurianum là một loại vi khuẩn butyric, chúng có thể sử dụng các hydratcarbon thông thường và làm lên men suinh ra acid butyric, acetic, CO2 và H2. Chúng có thể sử dụng hợp chất N vô cơ và hữu cơ làm nguồn thức ăn N, khi những hợp chất này đầy đủ thì tác dụng cố định N của chúng hạ thấp hoặc hoàn toàn không có. Tác dụng cố định N của C. pasteurianum thấp hơn Azotobacter. Cứ mỗi khi tiêu thụ 1g hydratcarbon thì chúng cố định được 2-3 mg N. Tuy nhiên C.Pasteurianum rất nhiều và phân bố rộng rãi hơn Azotobacter nên nguồn N mà chúng cố định cho đất là rất quan trọng. Chúng lại phát triển được ở ruộng ngập nước, yêu cầu pH không gắt gao nên thích hợp cho các loại ruộng của ta. Ngoài hai loài trên, trong các VSV cố định N còn có một số vi khuẩn thuộc chi Clostridium, Bacillus và Azotomonas. Tuy nhiên, vì những loài này phân bố không nhiều và hiệu lực cố định N cũng thấp nên tác dụng thực tế không lớn lắm. 2. Vi khuẩn cố định N cộng sinh. Phần lớn các cây thuộc họ đậu không cần thức ăn hợp chất, chúng có thể sử dụng được N không khí. Nhưng khả năng này không phải bản thân cây họ đậu có mà do những vi khuẩn nốt rễ cộng sinh với cây họ đậu mang lại. 2.1. Vi khuẩn nốt rễ Người đầu tiên chứng minh rằng các cây bộ đậu có thể sinh trưởng trong đất không chứa N là H. Hellrigel và H. Wilfarth (1886). Năm 1886 M.W.Beijerinck đã phân lập được vi khuẩn từ nốt rễ một số cây đậu. Giống (chi) Rhizobium (Franck, 1889) là loại vi khuẩn đơn bào ở đất, rất dễ nhầm với Pseudomonas, trực khuẩn tự do có kích thước 1,2(m x 0,5 chuyển động nhờ nhung mao và tiên mao ở cực, hiếu khí. Khi hình thành nốt sần thì trực khuẩn biến dạng (có hiện tượng đa hình thái), nó thay đổi hình dạng tùy theo lứa tuổi và điều kiện sống. Khi còn non chúng là trực khuẩn nhỏ bé, không có bào tử, di động nhờ tiên mao. Trong quá trình phát triển, chúng sẽ chuyển thành hình cầu và những dạng phân nhánh hình chữ Y, chữ V gọi là giả khuẩn thể (Bacteroids).
191 Năm 1963, Manil đã chia các vi khuẩn nốt sần thành 3 nhóm: -Rhizobium leguminosa (đậu Hà Lan), R. trifolii (cỏ ba lá), R. phaseoli (đậu cô ve, đậu xanh). -Rhizobium lupini (mục túc, linh lăng), gộp nhóm 1 và 2 thành Rhizobium mọc nhanh. - Rhizobium lupini (đậu đũa, lupin), R. Japonicum (đậu nành) với nhiều loài phụ. Nhóm này hiện nay được định loại là Bradyrhizobium (gồm tất cả các chủng mọc chậm. Hiện nay, người ta xếp vi khuẩn nốt rễ vào một chi chung là Rhizobium.Chúng có thể sử dụng nhiều hydratcarbon khác nhau làm nguồn C. Khi sống riêng lẻ trong đất hoặc trong môi trường nuôi cấy chúng không có khả năng cố định N. Về hô hấp, chúng là loại vi hiếu khí. Rhizobium có nhiều loài và có tính chất chuyên tính, nghĩa là mỗi loài chỉ có thể xâm nhập và tạo thành nốt rễ trong một số cây họ đậu nhất định. Vi khuẩn nốt rễ khi gặp cây họ đậu thích hợp sẽ xâm nhập vào tế bào rễ, kích thích rễ tạo thành những nốt rễ. Nốt rễ thường thường bằng hạt gạo, nốt rễ to bằng hạt đậu nhỏ, trong nốt rễ chứa đầy vi khuẩn. Sau khi hình thành nốt rễ giữa vi khuẩn và cây họ đậu làm thành một thể cộng sinh có lợi cho cả hai bên. Ngoài các cây họ đậu, một số rễ cây khác cũng có thể cộng sinh với vi khuẩn cố định N. Gần đây người ta còn thấy nốt sần ở lá một vài loài cây nhiệt đới. Trong nốt sần đó cũng chứa vi khuẩn cố định N gần giống ở rễ. 2.2.Phân bón nốt rễ (nitragin) Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là nitragin: Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914). Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizobium do Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp của họ đậu. Từ đó cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia spp, Azotobacter spp, các vi khuẩn cố định N sống tự do Clostridium pasteurianum, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng giải cellulose, hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các
192 nguồn dự trữ phospho và kali ở dạng khó hoà tan với số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, phosphorid v.v... chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây trồng có thể hấp thụ được. Trong các loại vi sinh vật kể trên, vi khuẩn nốt rễ có ý nghĩa hết sức to lớn trong nông nghiệp. Cường độ cố định N cộng sinh lớn hơn nhiều so với cường độ cố định N không cộng sinh. Sau khi trồng các cây họ đậu đất giàu thêm N rất nhiều. Chính vì vậy, từ đầu thế kỷ XX người ta nghiên cứu sử dụng phân bón nốt rễ với mục đích là để tiếp giống nhân tạo, làm cho đất không chứa vi khuẩn nốt rễ thích ứng sẽ có vi khuẩn thích ứng, làm cho cây họ đậu không sinh nốt rễ sẽ có thể sinh nốt rễ và những cây có thể sinh nốt rễ thì càng sinh nhiều hơn, cố định N càng mạnh mẽ hơn. Cách sử dụng phân bón vi khuẩn nốt rễ là đem trộn phân với hạt giống, rồi để khô, sau đó đem gieo. Cũng có thể dùng nốt rễ tốt, nghiền nát để trộn với hạt giống. Khi sử dụng có thể tăng sản lượng cây họ đậu lên 15- 20%. Ngoài hai nhóm vi khuẩn cố định N sống cộng sinh với thực vật và sống tự do trong đất như đã nói ở trên, còn một số vi khuẩn có khả năng cố định N sống trên bề mặt rễ và ăn sâu vào vào lớp tổ chức bề mặt rễ của một số cây hòa thảo như lúa, ngô, mía,... Đó là một loài vi khuẩn có dạng xoắn được phát hiện từ năm 1974 thuộc chi Azospirillum. Ngoài các nhóm vi khuẩn cố định N nói trên ra, còn có một số loài vi tảo đơn bào cũng có khả năng cố định N. Ví dụ như vi khuẩn lam sống tự do và sống cộng sinh trong bèo hoa dâu. Các loài này cũng đóng góp không nhỏ vào quá trình cố định N không khí. Câu hỏi ôn tập chương 9 1.Hãy nêu tổng quát chu trình chuyển hóa N trong thiên nhiên và vai trò của vi sinh vật trong chu trình đó ? 2.Các nhóm vi sinh vật cố định N ? ý nghĩa thực tế của việc nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 3.Nêu một số thành tựu hiện nay về nghiên cứu vi sinh vật cố định đạm. 4. Naza là gì ? Cơ chế hiện biết của quá trình cố định N phân tử. 5.Các loại phân bón vi sinh vật ? cơ sở khoa học của việc sản xuất và sử dụng các loại phân bón vi sinh vật? 6. Trình bày các bước chủ yếu điều chế Azotobacterin và Nitragin. Trong điều kiện hiện nay ở Việt Nam có thể sản xuất 2 chế phẩm này được không ? Tại sao ?
193 Chương 10 Di truyền học vi sinh vật Di truyền là đặc tính chung của mọi sinh vật giữ lại những và truyền cho con cháu những đặc điểm về cấu tạo và phát triển của tổ tiên, hay nói cách khác, là hiện tượng các cá thể trong một gia đình có những thuộc tính cấu tạo và phát triển giống tổ tiên, với cha mẹ hoặc giữa con cái với nhau. Biến dị là đặc tính chung của mọi sinh vật có thể mang những sự khác biệt về nhiều chi tiết tính trạng so với bố mẹ của chúng và với các cá thể khác cùng loài. Đối tượng nghiên cứu của di truyền học không chỉ là hiện tượng di truyền mà cả hiện tượng biến dị. Tính biến dị có vẻ như độc lập với tính di truyền nhưng thực ra sự khác biệt giữa các cá thể trong một loài trong nhiều trường hợp liên quan đến sự biến đổi hoặc trong trường hợp khác đến sự phản ứng của vật chất di truyền của sinh vật. Ở vi sinh vật biến dị thể hiện ở mức độ lớn hơn ở vi sinh vật bậc cao nhờ số cá thể trong một quần thể lớn, đơn allele, sinh sản đồng loạt, giai đoạn sinh dưỡng ngắn, tần số đột biến và tái tổ hợp cao và có khả năng trao đổi di truyền ngoài loài. Dù cơ chế xuất hiện khác nhau nhưng ở phần lớn các trường hợp biến dị đều tạo ra những dòng hay tập đoàn có sự thích ứng tốt nhất với điều kiện ngoại cảnh vốn luôn biến động. I. Cơ sở vật chất di truyền ở vi sinh vật 1. Vật chất di truyền ở vi khuẩn Acid nucleic là cơ sở vật chất di truyền của tất cả các dạng sinh vật. Ở tất cả các sinh vật nhân sơ (prokaryote, còn gọi là sinh vật nhân sơ sơ, bao gồm các vi khuẩn) hay nhân chuẩn (eukaryote, còn gọi là sinh vật nhân chuẩn, bao gồm nấm, tức chân khuẩn, nguyên sinh động vật, tảo, thực vật và động vật bậc cao), trừ virus và các yếu tố sinh học đơn giản hơn như viroid và prion, tính trạng được mã hóa và tồn trữ dưới dạng mã hóa là trình tự thẳng của các nucleotide trong thành phần acid deoxyribonucleic (DNA). Vật chất di truyền này được thể hiện thành tính trạng của cá thể thông qua quá trình tổng hợp từ khuôn DNA thành phân tử RNA thông tin (quá trình phiên mã) và sau đó RNA thông tin này lại làm khuôn để tổng hợp protein (cấu trúc, enzyme, thụ thể, kích thích, kìm hãm,...) trong quá trình gọi là dịch mã (transcription) dẫn đến biểu hiện tính trạng. Vật chất di truyền được truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác (và từ thế hệ này sang thế hệ khác) nhờ quá trình tự sao
194 (replication) của phân tử DNA. Quy tắc này được gọi là quy tắc trung tâm biểu hiện di truyền. Ở vi khuẩn DNA có thể gặp ở hai dạng: DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid. Nhân (thể nhân) vi khuẩn là một nhiễm sắc thể vi khuẩn cấu tạo từ một phân tử DNA duy nhất xoắn kép (gồm hai mạch xoắn), khép kín (không có đầu tự do), phân bố trong tế bào chất. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một nhân (thể nhân) duy nhất, mặc dù trước khi phân bào số lượng nhân (nhiễm sắc thể) thường thấy là 2, 4 hoặc nhiều hơn do quá trình phân bào diễn ra chậm hơn quá trình phân nhân. Vì vậy, thông thường nhiễm sắc thể được mô hình hóa trong tế bào vi khuẩn dưới dạng một vòng tròn. Hình 10.1: Mô hình cấu trúc một đoạn phân tử DNA: một dẫn xuất purine liên kết qua cầu nối hyđrô với một dẫn xuất pyrimidine nên khoảng cách giữa hai sườn đường ribose - Acid phosphoric của hai chuỗi là không đổi, guanine luôn kết hợp với cytosine, adenine kết hợp với thymine của chuỗi song đối nên trình tự hai chuỗi không bao giờ giống nhau nhưng trình tự một chuỗi quy định trình tự của chuỗi kia, hơn nữa các sườn có nhiều nhóm ái thủy nên DNA tan tốt trong nước.
195 Hai mạch xoắn của phân tử DNA thực chất là hai chuỗi polymer và có mối quan hệ chặt chẽ với nhau về thành phần hóa học cũng như trình tự sắp xếp của các monomer được gọi là một nucleotide. Mỗi chuỗi polymer được cấu tạo từ bốn loại monomer có cấu trúc tổng quát gồm ba thành phần: bazơ nitơ dị vòng (dẫn xuất purine hoặc pyrimidine), đường deoxyribose (C5) và Acid phosphoric. Ở DNA, có bốn loại nucleotide: adenine (A), thymine (T), guanine (G) và cytosine (C) (hay xitôzin). Các nucleotide khác nhau bởi gốc bazơ khác nhau. Chuỗi polymer của mỗi mạch (sợi) DNA được hình thành nhờ liên kết phosphoester giữa Acid phosphoric và đường deoxyribose tạo nên bộ "sườn" của phân tử ((-P-C5- )n). Còn các gốc bazơ nitơ gắn vào nguyên tử C 1' của phân tử đường deoxyribose. Phân tử Acid phosphoric trong một nucleotide gắn vào vị trí C 5' của phân tử đường deoxyribose, trong khi đó nguyên tử C 3' gắn với Acid phosphoric của nucleotide kế tiếp. Do trình tự hoạt động của các enzyme tổng hợp DNA từ đầu C 5' đến đầu C 3' của mỗi mạch DNA nên người ta quy ước mô tả mạch theo hướng C 5'→C 3'. Ví dụ, nếu không có chú giải khác thì mạch ATT CGC GCA TCA GCT cũng có nghĩa là 5'- ATT CGC GCA TCA GCT-3' hay 5'-ATT CGC GCA TCA GCT. Hai chuỗi của một phân tử DNA gắn kết với nhau nhờ các mối liên kết hyđrô giữa các gốc bazơ, một gốc purine được gắn kết với một gốc pyrimidine theo nguyên tắc "tương bù": adenine gắn với thymine bằng hai mối liên kết hyđrô, còn guanine gắn với cytosine bằng ba mối liên kết hyđrô. Hai chuỗi như vậy không đối xứng mà chạy ngược hướng (đối nghịch song song, hay song đối) từ 5'→3' hoặc ngược lại. Do một gốc purine của một chuỗi liên kết với một gốc pyrimidine của chuỗi kia nên khoảng cách giữa hai sườn (-P-C5-)n của phân tử DNA ở mọi điểm không đổi. Và nhờ vậy mà sườn này hướng ra phía ngoài và xoắn quanh trục tưởng tượng xuyên qua các lớp gốc bazơ nitơ vòng, nên với tính ái thủy của Acid phosphoric và đường deoxyribose, DNA là chất tan tốt trong nước và khá bền vững trong dung môi này. Do số lượng mối liên kết hyđrô giữa guanine (G) và cytosine (C) cao hơn nên DNA có nhiều G+C thường có mức nhiệt biến tính hay "nhiệt nóng chảy" (melting point) cao hơn hay bền vững hơn. Hơn nữa, bên cạnh cấu trúc xoắn phải (B-DNA) nêu trên, ở những vùng hàm lượng G+C cao DNA còn có cấu trúc xoắn trái (Z-DNA) là nơi DNA có sự gấp khúc mạnh và xuất hiện đoạn DNA xoắn chuỗi ba. Có thể những Z-DNA đóng vai trò quan trọng trong tái tổ hợp gen cũng như điều hòa hoạt động của gen. Một đoạn DNA mã hóa một RNA (như RNA ribosome, RNA vận chuyển) hay mã hóa một protein (qua RNA thông tin) được gọi là một gen. Gen mã hóa phân tử protein được gọi là gen cấu trúc. Ở vi khuẩn toàn bộ trình tự nucleotide gen cấu trúc được phiên mã thành RNA thông tin và sau đó dịch toàn bộ thành trình tự Acid amin trong phân tử protein.
196 Mặc dù được cấu tạo bởi hai chuỗi nhưng ở vi khuẩn (cũng như ở sinh vật nhân chuẩn) gen chỉ có một mạch "hiệu lực", tức chỉ một mạch làm khuôn tổng hợp nên RNA thông tin. Hiệp hội sinh hóa quốc tế quy ước chuỗi làm khuôn để tổng hợp nên RNA thông tin (hay tổng hợp RNA hoạt động, như RNA ribosome,...) là chuỗi âm. Như vậy, chuỗi dương của một gen là chuỗi có trình tự nucleotide tương đương với trình tự nucleotide của RNA thông tin. Ngoài ra, do một polypeptide được khởi đầu tổng hợp với Acid amin methionine (mã AUG trên RNA thông tin), kết thúc bởi một trong những "mã dừng" (UAA, UAG và UGA) và chỉ có thể có thuộc tính protein nếu đủ lớn (dài hơn 50 Acid amin), đồng thời, thông tin di truyền được giải đọc từng "khung" bộ ba nucleotide (tức ba nucleotide liền kề nhau mã hóa cho một Acid amin trong sản phẩm protein) nên chỉ có những đoạn DNA bắt đầu từ bộ ba ATG (theo cả ba cách đọc của mỗi chuỗi DNA) đến một mã dừng (TAA, TAG, TGA) đủ dài (hơn 150 nucleotide) mới có thể là (nhưng không nhất thiết phải là) một gen cấu trúc. Đoạn DNA này được gọi là một "khung khả phiên" (hay một "khung đọc mở" - open reading frame). Ngoài ra, không phải tất cả các đoạn DNA đều mang gen cấu trúc, chức năng của nhiều đoạn còn chưa biết, đồng thời còn có các đoạn DNA đặc biệt tham gia vào điều hòa hoạt động của các gen cấu trúc. Nhờ vậy, các tính trạng quy định trong genome chỉ biểu hiện trong điều kiện môi trường nhất định, đồng thời quá trình tổng hợp các cơ chất nguyên liệu cho quá trình tổng hợp các thành phần tế bào cũng diễn ra và đình chỉ một cách hiệu quả và tiết kiệm. Ở sinh vật nhân sơ các gen cấu trúc (các cistron) được gắn liền nhau thành tập hợp và cùng chịu sự kiểm soát của các gen điều hòa gồm gen (hay vùng) khởi động (promotor - P), gen (hay vùng) điều hành (operator - O, còn gọi là gen chỉ huy) và gen điều hòa (regulator - R). Gen điều hòa (R) nằm ở vị trí nào đó trong nhiễm sắc thể xa với các gen cấu trúc và điều khiển việc tổng hợp một protein đặc biệt có tác động (phong tỏa hoặc giải tỏa) trực tiếp hoặc gián tiếp lên các vùng P hoặc O. Cả tập hợp bao gồm các vùng khởi động, vùng điều hành và các gen cấu trúc tạo thành một đơn vị hoạt động gọi là operon. RNA gồm ba loại khác nhau: RNA ribosome là thành phần chủ yếu cấu tạo nên ribosome, có chức năng hoạt động như một enzyme tức xúc tác quá trình sinh tổng hợp protein. (Những RNA xúc tác phản ứng sinh học thường được gọi là ribozyme). RNA thông tin được sao chép từ chuỗi âm của gen có vai trò sao mã di truyền từ nhiễm sắc thể cho RNA ribosome giải mã thành phân tử protein có mạch polypeptide có thành phần và trình tự Acid amin xác định. Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein còn có nhóm các RNA vận chuyển. Đây là những phân tử RNA tương đối ngắn có tác dụng hoạt hóa Acid amin nguyên liệu và vận
197 chuyển Acid amin này đến RNA thông tin cũng đã được hoạt hóa nhờ gắn kết với ribosome. Trình tự RNA thông tin quyết định trình tự Acid amin trong thành phần polypeptide, nhưng quá trình nhận biết trình tự Acid amin mã hóa trong RNA thông tin là nhờ RNA vận chuyển. Mỗi Acid amin được mã hóa bởi một bộ ba nucleotide trên RNA thông tin, và bộ ba này tương bù với trình tự bộ ba nucleotide nhận biết của RNA vận chuyển. Nhờ mỗi Acid amin có loại RNA vận chuyển riêng nên trình tự mã bộ ba được dịch một cách chính xác. Bảng 10.1 : Mã di truyền trên nhiễm sắc thể (biểu hiện trên mRNA, chiều 5' đến 3') Chữ thứ hai của mã Đầu U C A G 5' UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C U UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A Chữ thứ nhất của mã (đầu 5') Chữ thứ ba của mã (đầu 3') UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C A AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C G GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G Khác với DNA, các RNA đều cấu tạo chỉ từ một chuỗi nucleotide. Ngoài ra, trong thành phần của các RNA còn có những điểm khác biệt khác: uracine thay thế thymine, đường deoxyribose được thay thế bởi ribose trong sườn của mạch polymer cũng như sự có mặt một số bazơ dẫn xuất khác của purine và pyrimidine. Chính vì có thêm một gốc -OH ở vị trí C 2' (của đường ribose) mà cầu nối phosphoester giữa nguyên tử C 3' và Acid phosphoric của nucleotide tiếp theo thường yếu hơn so với cầu nối C 3' với Acid phosphoric trong DNA. RNA, vì vậy, cũng kém bền vững hơn DNA. Tuy cấu tạo từ chỉ một chuỗi nucleotide nhưng cấu trúc không gian của các loại RNA lại ổn định nên chức năng của chúng cũng ổn định. Tính ổn định của cấu trúc có được nhờ các mối liên kết hyđrô xuất hiện giữa hai đoạn trình tự tương bù ngược hướng của cùng chuỗi nucleotide. Hai đoạn có trình tự tương bù ngược hướng tạo thành một đoạn xoắn kép,
198 trong khi đoạn nucleotide nằm giữa chúng hình thành một "thòng lọng" mạch đơn. Vì vậy, chẳng hạn, các phân tử RNA vận chuyển có dạng "lá ba chẽ" với chức năng đặc hiệu. Bên cạnh DNA nhiễm sắc thể ở vi khuẩn còn có thể gặp cơ sở vật chất di truyền ngoài nhiễm sắc thể gọi là plasmid. Về bản chất hóa học, plasmid cũng là một phân tử DNA xoắn kép, khép kín, nhưng có phân tử lượng thấp hơn nhiều (khoảng 106 - 108 Dalton, hay khoảng 1/100 đến 1/200 lần nhiễm sắc thể vi khuẩn). Một vi khuẩn có thể không mang, hoặc mang một hoặc một số plasmid. Plasmid có thể phân bố trong tế bào chất ở trạng thái tự do và có thể sao chép một cách độc lập với nhiễm sắc thể hoặc nằm trong nhiễm sắc thể (tái tổ hợp), khi đó plasmid được gọi là episome. Ở trạng thái tái tổ hợp trong nhiễm sắc thể (hay episome) plasmid thường được sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác của vi khuẩn. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp (như chủng Hfr) plasmid tái tổ hợp lại có thể điều khiển sao chép độc lập, làm cho bản thân plasmid hoặc một đoạn plasmid kèm theo một đoạn DNA nhiễm sắc thể được tổng hợp đồng loạt với tần suất cao. Có loại plasmid có số phiên bản cao (high-copy plasmid), trong khi đó có loại plasmid có số phiên bản thấp (low-copy plasmid). Hình 10.2: Bản đồ enzyme hạn chế của plasmid pBR322, là một plasmid được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Plasmid cải biến nhân tạo này mang hai gen kháng thuốc (tetR đề kháng tetracycline và ampR đề kháng ampicillin) và một loạt vị trí cắt của enzyme hạn chế trong đó mỗi enzyme này chỉ có một vị trí phân cắt, nhờ vậy plasmid vector này áp dụng được với nhiều DNA khác nhau.
199 Thêm hoặc mất một plasmid thường dẫn đến mất hoặc bớt một hoặc một số tính trạng, mặc dù nhiều plasmid không thể hiện tính trạng (plasmid "câm"). Tính trạng mà các plasmid điều khiển đa dạng nhưng nhìn chung plasmid không phải là yếu tố thiết yếu đối với sự sống còn của vi khuẩn. Dựa vào sự tương hợp của các sản phẩm của plasmid mà người ta chia các plasmid thành một số nhóm: plasmid giới tính, plasmid đề kháng, plasmid điều khiển sinh tổng hợp (nhóm chất nào đó),... và thường liên quan đến tính gây bệnh của các vi khuẩn. Ví dụ, đã xác định được rằng một số loài (hoặc còn được coi là dạng huyết thanh học) vi khuẩn Salmonella có được độc tính nhờ mang plasmid. Bảng10.2 : Plasmid độc tính đặc hiệu một số loài (dạng huyết thanh) Salmonella Độ lớn (kb) Biểu hiện tính gây bệnh chủ yếu Salmonella 90 Độc tính gây chết, giảm thiểu tính thẩm thấu S. typhimurium của các chất kỵ thủy Độc tính gây chết, tính đề kháng huyết thanh, 75 S. dublin năng lực tăng trưởng trong tế bào hệ lưới nội bì 75 Giống như plasmid ở S. dublin ( hay serovar S. naestved Dublin) 54 Độc tính gây chết S. enteritidis 50 Độc tính gây chết, gây chứng máu nhiễm S. choleraesuis khuẩn ở chuột S. gallinarum- 85 Độc tính gây chết pullorum Plasmid giới tính còn gọi là yếu tố sinh dục hay yếu tố F (fertility factor), là plasmid điều khiển sự hình thành các pili giới tính (nhung mao giới tính), sự tiếp hợp và sự vận chuyển thông tin di truyền (gen plasmid hay gen nhiễm sắc thể) một chiều từ tế bào cho sang tế bào nhận. Trong trường hợp này tế bào mang plasmid F là tế bào cho thường được gọi là tế bào đực hay tế bào F+, còn tế bào nhận được gọi là tế bào cái hay tế bào F-. Yếu tố F có thể nằm ở trạng thái tự do trong tế bào chất hay ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể hay trạng thái episome. Trong trường hợp sau quá trình vận chuyển thông tin di truyền thường diễn ra với tốc độ và tần suất cao nên những chủng vi khuẩn này thường được gọi là chủng Hfr (bắt nguồn từ tiếng Anh: high frequency of recombination). Yếu tố đề kháng, hay yếu tố kháng thuốc, hay plasmid R (resistance factor), là plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với các chất kháng sinh và thuốc chống vi khuẩn khác. Cơ chế đề kháng này là sự điều khiển việc tổng hợp các enzyme (như penicillinase,...) phân
200 hủy thuốc kháng sinh thành các sản phẩm vô hoạt hoặc ức chế sự xâm nhập của thuốc kháng sinh vào tế bào (như chặn các lỗ khổng trên màng tế bào chất đối với tetracycline hoặc thuốc kháng sinh họ macrolide,...). Yếu tố R lan truyền được (transmissible R factor) là yếu tố F kháng thuốc, gồm hai miền gen. Một miền gen điều khiển sự đề kháng. Số lượng yếu tố bị đề kháng có thể là 1 đến 10 hoặc nhiều hơn nữa, trường hợp sau thường gọi là plasmid đề kháng đồng loạt. Miền gen thứ hai (miền RTF) là gen điều khiển sự vận chuyển các plasmid vào tế bào khác. Thông thường sự vận chuyển các plasmid này có tốc độ cao, nhưng yếu tố vận chuyển cũng có thể tự ức chế hoặc bị ức chế bởi yếu tố khác. Yếu tố R không lan truyền được (non-transmissible R factor) chỉ mang miền gen điều khiển tính đề kháng. Các plasmid này không tự vận chuyển sang tế bào khác mà chỉ làm cho tế bào mang chúng có tính đề kháng thuốc kháng sinh. Chúng có thể tồn tại và phổ biến trong quần thể vi khuẩn nhờ quá trình sinh sản của vi khuẩn hoặc nhờ các quá trình vận chuyển vật chất di truyền qua dịch thể tức quá trình biến nạp (transformation) hoặc sự vận chuyển của virus của vi khuẩn (phage, hay thực khuẩn thể) tức nhờ quá trình tải nạp (transduction). 2. Vật chất di truyền ở virus Khác với các sinh vật khác, virus chỉ mang một trong hai loại Acid nucleic (hoặc DNA hoặc RNA), có loại virus mang genome dưới dạng DNA (tương tự genome của vi khuẩn, động vật và thực vật) nhưng có loại lại mang genome dưới dạng RNA. Hầu hết các virus thực vật có genome RNA, còn hầu hết virus của vi khuẩn có genome DNA, trong khi các virus động vật có genome hoặc loại này hay loại khác. Cũng như bản chất hóa học, cấu trúc genome của virus rất đa dạng, có loại virus mang DNA một sợi (chuỗi) âm hoặc dương, có loại DNA hai sợi, có loại mang RNA một sợi âm hoặc dương hoặc lưỡng nghĩa (ambisense RNA: có đoạn âm có đoạn dương, hay đồng thời với khung khả phiên một gen cấu trúc còn mang khuôn của một khung khả phiên một gen khác ngược hướng). Genome nhiều virus là một sợi acid nucleic duy nhất nhưng cũng có loại virus genome bao gồm một số đoạn. Thông tin di truyền trên genome của virus cũng có sự khác biệt khác so với genome vi khuẩn. Đó là hiện tượng gen chồng lặp (overlapping genes): có thể có hai RNA thông tin khác nhau được sao chép từ một đoạn genome. Dưới đây trình bày ngắn gọn về cấu trúc genome một số virus. Genome các virus thuộc chi Parvovirus là virus chứa DNA một sợi âm nhưng cũng thấy khoảng 1 - 50% số virion chứa DNA một sợi dương. Ở các chi Dependovirus và Densovirus thì số lượng virion chứa
201 DNA chuỗi âm và virion chứa DNA chuỗi dương tương bù về căn bản tương đương nhau. Genome của các Adenovirus (họ Adenoviridae) là một phân tử DNA 2 sợi chuỗi thẳng. Genome các virus họ Papillomaviridae là một phân tử DNA hai sợi chuỗi vòng khép kín, phân tử lượng khoảng 5 kbp . Genome của các baculovirus (họ Baculoviridae) rất lớn, tương đương genome của các tế bào côn trùng, là một phân tử DNA duy nhất hai sợi, trong đó có chứa một gen cho tiểu đơn vị lớn của enzyme ribonucleotide reductase (RR1). Genome của các hepadnavirus (họ Hepadnaviridae) là một phân tử DNA mạch vòng, có vùng gồm 2 sợi, có vùng chỉ một sợi. Sợi DNA âm là sợi đầy đủ, có chiều dài toàn bộ là 3,0 - 3,2 kb có khấc (nick) đặc hiệu ở một số chỗ. Còn sợi DNA dương thì có độ dài không hoàn toàn và không ổn định, thường từ 1,7 đến 2,8 kb. Genome của các orthomyxovirus (họ Orthomyxoviridae) là RNA một sợi gồm 8 phân đoạn (riêng virus cúm C có 7 phân đoạn). Các bunyavirus (họ Bunyaviridae) có genome gồm 3 phân tử RNA một sợi âm có kích thước khác nhau (gọi là các RNA L, M và S). Riêng RNA S của chi Phlebovirus có một đoạn có cơ năng của sợi dương, nên thường gọi "RNA lưỡng nghĩa (ambisense RNA"). Genome các arenavirus (họ Arenaviridae) có 2 phân tử RNA một sợi. Ngoài ra, bên trong virion còn có các RNA 28 S, 18 S, 4 - 6 S có nguồn gốc từ tế bào ký chủ. Các RNA 4 - 6 S chứa RNA thông tin dưới genome (subgenomic mRNA) mã hóa protein Z có thể là nhân tố điều tiết sao chép. RNA genome cũng lưỡng nghĩa (ambisense). Genome picornavirus (họ Picornaviridae) cấu tạo từ 1 phân tử RNA một sợi dương chuỗi thẳng, phân tử lượng 2,4 - 2,7 x 106 (khoảng 7,5 - 8,5 kb), có chuỗi poly-A ở đầu 3', còn đầu 5' kết hợp cộng hóa trị với phân tử protein VPg có phân tử lượng khoảng 2.400 Da. Genome của các birnavirus (họ Birnaviridae) là phân tử RNA hai sợi, gồm hai đoạn (đoạn A có kích thước 3,1 kbp và đoạn B 2,9 kbp). 3. Vật chất di truyền ở vi sinh vật nhân chuẩn Ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) vật chất di truyền cũng có bản chất hóa học là acid nucleic DNA, RNA. Chức năng hai loại acid này tương tự ở tế bào nhân sơ. DNA mang mật mã thông tin di truyền trong khi RNA tham gia chuyển hóa mật mã này thành protein mà thể
202 hiện tính trạng. Quá trình tự sao chép DNA cũng là cơ sở di truyền từ thế hệ tế bào này sang thế hệ tế bào khác hay thế hệ này sang thế hệ khác. Điểm khác biệt lớn giữa sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ là nhân chuẩn có màng nhân và genome thường gồm hai bộ (lưỡng bội) hoặc đôi khi nhiều hơn nhiễm sắc thể (ở thực vật: tam bội, tứ bội, đa bội) cũng cấu tạo từ DNA xoắn kép nhưng không khép kín (có đầu tự do). Tuy nhiên ở nhiều nấm và thực vật còn tồn tại chu trình đơn bội, khi đó trong tế bào nhân chỉ chứa một bộ nhiễm sắc thể. Thể đơn bội này ở nhiều nấm tồn tại song song với thể lưỡng bội và dạng tế bào song nhân có hai nhân đơn bội riêng rẽ. Ở các nấm chuyển hình hoàn toàn (holomorphous fungi) thể lưỡng bội thường là điểm khởi đầu của sự hình thành cơ quan sinh bào tử hữu tính từ đó sản sinh các bào tử đơn bội. Còn ở các nấm chuyển hình không hoàn toàn (imperfect fungi) không có giai đoạn lưỡng bội. Điểm khác biệt nữa là, DNA nhiễm sắc thể nhân chuẩn còn quấn quanh các phân tử protein histone. Tổ chức gen sinh vật nhân chuẩn còn có sự khác biệt khác so với sinh vật nhân sơ. Gen cấu trúc bao gồm nhiều đoạn và chỉ một số đoạn mã hóa cấu trúc protein. Trong quá trình phiên mã, gen trên nhiễm sắc thể được sao chép thành RNA thông tin sơ cấp trong nhân tế bào nhưng để trở thành RNA thông tin thành thục đặc hiệu thì RNA phải trải qua quá trình biến đổi. Một số đoạn của RNA thông tin sơ cấp bị cắt bỏ khỏi đoạn RNA thông tin (trong quá trình gọi là splicing - "cắt xén", hay "tách ghép"), đồng thời đầu 5' được methyl hóa, còn đầu 3' được bổ sung đoạn dài adenine (poly-A). Methyl hóa đầu 5' làm cho RNA thông tin có thể nhận biết đối với ribosome, còn quá trình poly-A hóa RNA thông tin góp phần đẩy RNA này ra khỏi lỗ khổng màng nhân mà đi vào tế bào chất. Phần gen tương ứng phần còn lại của RNA thông tin thành thục là phần được biểu hiện thành tính trạng nên được gọi là exon, phần bị cắt bỏ gọi là intron. Đoạn DNA mã hóa RNA thông tin sơ cấp được gọi là một đơn vị gen. Cấu trúc gen không liên tục này đóng vai trò quan trọng đối với sự biệt hóa tổ chức trong quá trình sinh trưởng của cá thể. Ngoại lệ có thể gặp là gen histone và interferon không có intron. (Ngoài ra, genome nhiễm sắc thể ở động vật bậc cao còn có trình tự lặp giàu G+C ở đầu nhiễm sắc thể, gọi là telomer, thường bị ngắn dần sau mỗi lần phân bào do đoạn RNA mồi không được tổng hợp bù đắp bằng DNA, có thể liên quan đến quá trình lão hóa của cơ thể). Bên cạnh genome nhiễm sắc thể (ở trong nhân), ở các eukaryote còn có hệ thống tín hiệu di truyền khác là DNA trong các ty thể và lạp thể. Bộ gen này điều khiển sự tổng hợp một số protein của các cơ quan này và có bản chất tương tự bộ gen ở sinh vật nhân sơ (DNA cũng có cấu tạo mạch xoắn kép, khép kín) nhưng được cắt bớt đi nhiều. Ở sinh vật
203 sinh sản hữu tính (hợp tử hình thành từ giao tử đực và giao tử cái) bộ gen này ở mọi cá thể đều có nguồn gốc từ mẹ do trong quá trình thụ tinh giao tử đực không truyền được các ty thể (và lạp thể ở thực vật) vào giao tử cái. Genome của các tiểu cơ quan (ty thể và lạp thể) được phiên mã thành RNA thông tin tương ứng với quá trình diễn ra tương tự ở tế bào nhân sơ. Gen nhảy (transposon) là đoạn DNA đặc biệt gặp cả ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, không có vị trí ổn định trong nhiễm sắc thể. Đoạn này có thể tách rời khỏi vị trí vốn có của nó và di chuyển đến một vị trí khác của cùng nhiễm sắc thể hoặc sang nhiễm sắc thể khác. Tuy không phải là gen cấu trúc nhưng transposon ảnh hưởng rất lớn đến quá trình biểu hiện tính trạng. Nó có thể khống chế hoặc giải phóng một gen cấu trúc nào đó dẫn đến việc mất tính trạng hoặc xuất hiện tính trạng quy định bởi gen đó. Quá trình khống chế có thể diễn ra khi một gen nhảy chèn vào khoảng giữa gen khởi động (promoter) và gen cấu trúc cũng như chèn vào giữa gen cấu trúc làm cho quá trình phiên mã không thể khởi động hoặc bị gián đoạn. II. Di truyền và biểu hiện tính trạng 1. Tự sao hay tái tạo DNA (replication) Quá trình tổng hợp DNA trong nhân tế bào gắn chặt chẽ với quá trình bão toàn và truyền đạt thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Nguyên lý bổ sung các bazơ trong chuỗi xoắn kép DNA đáp ứng quá trình nhân đôi và tái bản chính xác trình tự các bazơ trong phân tử gốc hay DNA khuôn. Trong quá trình tái tạo DNA, phân tử này được tách đôi thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn của DNA gốc được dùng để làm khuôn tổng hợp một mạch mới có các nucleotide liên kết hyđrô tương bù với các nucleotide của chuỗi gốc. Phân tử DNA, như vậy, có một chuỗi là chuỗi gốc còn chuỗi thứ hai hoàn toàn được tổng hợp mới. Do đó, cơ chế tự sao DNA là cơ chế bán bão toàn. Đây là quá trình phức tạp có sự tham gia của nhiều enzyme và protein khác nhau. Đặc biệt ở DNA sinh vật nhân sơ, do DNA xoắn kép, khép kín nên hai sợi phải xoắn bện và lồng vào nhau không thể tách rời nên quá trình tự sao DNA lại càng phức tạp và có sự tham gia của nhiều yếu tố. Vị trí bắt đầu quá trình tái bản DNA được gọi là điểm khởi đầu tái bản, vùng có mạch gốc được tách đôi gọi là chạc tái bản. Sự phát sinh một chạc tái bản từ điểm khởi đầu được gọi là sự khởi đầu tái bản. Khi khởi đầu tái bản enzyme topoizomerase (tức gyrase) có chức năng cắt đứt một sợi của chuỗi DNA và khôi phục sợi này lại nhanh chóng làm cho DNA xoắn kép có thể tách đôi được mà vẫn giữ nguyên cấu trúc. Quá trình tháo duỗi xoắn của chuỗi đôi thành chuỗi đơn có sự tham gia của enzyme helicase. Đoạn mạch đơn duy trì được độ
204 căng của nó là nhờ các enzyme đặc biệt gọi là các protein liên kết DNA mạch đơn (ssDNA binding protein). Trong tế bào các nucleotide nguyên liệu được tổng hợp sẵn dưới dạng các phân tử cao năng nucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP và dCTP). Các nucleotide này không thể tự liên kết vào chuỗi DNA một sợi dù thỏa mãn tính tương bù mà phải còn cần có một oligonucleotide (tức một đoạn Acid nucleic mạch đơn) gọi là mồi (primer) gắn kết một cách tương bù với đoạn DNA một sợi đã được duỗi sẵn. Đoạn oligonucleotide mồi này thường là một đoạn RNA ngắn được enzyme primase xúc tác tổng hợp trực tiếp trên khuôn DNA và sau đó cung cấp đầu 3'-OH cho một nucleotide nguyên liệu lắp ráp vào. Nhờ đó, mạch của chạc tái bản luôn duy trì được đầu 3'-OH để từ đó một nucleotide mới khác lắp ráp vào. Quá trình lắp ráp tiếp diễn dưới sự xúc tác của enzyme DNA-polymerase III. Mồi RNA sau đó được phân hủy khỏi DNA khuôn và chỗ trống này được lấp đầy nhờ enzyme DNA- polymerase I. Quá trình tổng hợp DNA từ chạc tái bản, như vậy, tiếp diễn nhờ nối dài đầu 3'-OH của mỗi mạch mới theo hướng 3'→5'của sợi khuôn. Chính vì vậy, quá trình tổng hợp DNA trên một sợi khuôn là liên tục, còn trên sợi kia (sợi đối nghịch song song với sợi trước) quá trình tổng hợp lại diễn ra gián đoạn, trong khi chạc tái bản chuyển động liên tục về một hướng. Mạch có sự lắp ráp liên tục gọi là mạch tiến còn trên mạch kia sự tổng hợp lại diễn ra theo hướng ngược với chiều chuyển động của chạc tái bản gọi là mạch lùi hay mạch gián đoạn. Một khi đoạn khuôn mới được mở ra thì trên mạch lùi này lại diễn ra sự tổng hợp một mồi mới nhờ enzyme primase, rồi từ mồi này quá trình lắp ráp các nucleotide tương bù với trình tự của mạch khuôn lại diễn ra. Sau đó nhờ tác dụng endonuclease của enzyme DNA-polymerase I mà mồi bị loại bỏ, và cũng dưới sự xúc tác của enzyme này chỗ trống được lấp bởi sự lắp ráp các deoxyribonucleotide. Những đoạn mạch này được gọi là đoạn Okazaki (gọi theo tên người phát hiện). Mối liên kết giữa các đoạn Okazaki được kết nối sau đó nhờ enzyme ligase. Các protein trong tập hợp các protein tham gia quá trình tái bản DNA gọi là replisome. Nhờ hệ thống này mà quá trình tái bản DNA diễn ra với tốc độ cao (ở E. coli khoảng 30000 - 50000 đôi nucleotide trong một giây). Ở sinh vật nhân chuẩn quá trình tự sao DNA diễn ra theo quá trình tương tự nhưng cơ chế có thể phức tạp hơn và còn nhiều điểm chưa rõ. DNA nhiễm sắc thể tế bào nhân chuẩn rất dài và sự khởi đầu tái bản có thể đồng thời từ nhiều điểm khởi đầu tái bản và thường diễn ra theo cả hai chiều. Đoạn DNA giữa hai điểm khởi đầu tái bản được gọi là đơn vị tái bản. Trung bình độ dài một đơn vị tái bản đến 40000 bp. Khi bắt đầu tái bản từ điểm khởi đầu tái bản, enzyme topoisomerase cắt DNA ở một sợi và nhanh chóng khôi phục khía đứt để chuỗi siêu xoắn kép được tháo xoắn và duỗi thẳng. Enzyme DNA-helicase tham gia vào tháo duỗi xoắn
205 của chuỗi kép để tạo mạch đơn. Bên cạnh các DNA-polymerase, topoisomerase, helicase và primase, trong tổ hợp replisome của tế bào nhân chuẩn còn có các protein khác gọi là các yếu tố tái bản A, B, và C,... (RFA, RFB, RFC,...) cũng như kháng nguyên hoạt hóa nhân tế bào (PCNA). Cũng đã phát hiện được bốn loại DNA-polymerase khác nhau, ký hiệu theo độ lớn của phân tử lượng là α, β, γ, và δ. DNA-polymerase α, β và δ phát hiện thấy trong nhân tế bào còn DNA-polymerase γ thì chỉ phát hiện trong các ty thể và lạp thể. Quá trình tái bản DNA nhân chuẩn trên chạc tái bản diễn ra tương tự ở tế bào vi khuẩn. DNA-polymerase δ hoạt động tương đương DNA-polymerase III ở vi khuẩn: xúc tác kéo dài quá trình lắp ráp. Sự khởi đầu mỗi đoạn tái bản cũng do enzyme primase đảm nhận, nó tổng hợp một đoạn RNA trên khuôn DNA chuỗi đơn và nhờ đó cung cấp đoạn chuỗi đôi cho DNA-polymerase nhận biết và đầu 3'-OH cần thiết cho quá trình lắp ráp. Enzyme này xúc tác quá trình lắp ráp trên cả mạch tiến (mạch liên tục) lẫn mạch lùi (mạch gián đoạn). Tương tự DNA-polymerase I ở vi khuẩn, ở mạch lùi quá trình khử bỏ các RNA mồi và lấp chỗ trống của mồi bởi deoxyribonucleotide do DNA- polymerase α đảm nhận. (Vai trò của hai DNA-polymerase khác còn chưa rõ). Cuối cùng vết khấc giữa các đoạn Okazaki cũng được kết nối nhờ sự xúc tác của enzyme ligase. Tốc độ tái bản DNA phụ thuộc vào tốc độ làm việc của các hệ thống tái bản trên mạch lùi vì quá trình tái bản trên mạch này thường chậm trễ so với mạch tiến. Bên cạnh cơ chế tái bản phụ thuộc primase tạo mồi (ở sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn) nêu trên còn có cơ chế tái bản DNA khác gọi là cơ chế tái bản theo vòng lăn thường thấy ở plasmid và có thể diễn ra ở nhiễm sắc thể vi khuẩn cũng như nhiễm sắc thể sinh vật nhân chuẩn. Ở plasmid hoặc vi khuẩn, chẳng hạn, từ một điểm cắt bởi enzyme endonuclease trên một sợi hình thành đầu 3'-OH và đầu 5'-P. Đầu 5'-P tách dần ra khỏi vòng và được tổng hợp gián đoạn (có sự tham gia của primase), còn đầu 3'-OH được DNA-polymerase nhận biết và xúc tác quá trình lắp ráp không cần mồi RNA. Ở sinh vật nhân chuẩn tái bản kiểu vòng lăn diễn ra trong trường hợp khuyếch đại gen. Khi đó một mạch đơn của đoạn gen này bị cắt tại một điểm, tách ra rồi vòng lại, đầu 3'-OH hoạt động như một mồi cho DNA-polymerase tổng hợp liên tục nhiều vòng đoạn nhiễm sắc thể này. Kết quả là sau lần tái bản DNA tiếp theo số phiên bản của gen tăng cao trong thành phần của nhiễm sắc thể. Ở các virus RNA, quá trình tự sao genome có cơ chế đa dạng tùy thuộc loại virus DNA một sợi hay hai sợi, virus RNA một sợi hay hai sợi, hay virus có quá trình phiên ngược (hepadnavirus và retrovirus). Còn các virus DNA hai sợi, nhìn chung, có quá trình sao chép tương tự ở prokaryote và eukaryote. Ở virus DNA có genome chuỗi thẳng có cấu
206 trúc kẹp tóc (hair pin) ở đầu quá trình tái bản DNA có thể theo cơ chế tái bản theo vòng lăn. Các virus RNA hai sợi cũng có quá trình tương tự ở DNA hai sợi nhưng diễn ra trong tế bào chất tế bào ký chủ với sự xúc tác của enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA và sự sao chép RNA không cần đến đoạn mồi oligonucleotide. Ở các virus một sợi (DNA hoặc RNA), quá trình tái bản genome đều thông qua dạng tái tạo (replicative form) là dạng Acid nucleic (NA) hai sợi gồm một sợi NA virus và một sợi NA tương bù được tổng hợp trong tế bào ký chủ (nhưng không có trong thành phần virion). Sợi tương bù tiếp tục làm khuôn để tổng hợp đồng loạt các sợi NA virus. Trường hợp cá biệt xảy ra với các virus thuộc họ Hepadnaviridae và họ Retroviridae. Genome hepadnavirus gồm DNA hai sợi mạch vòng, sợi âm có cấu trúc khá đầy đủ nhưng có một điểm khuyết thiếu (khấc) đặc hiệu chi, còn sợi dương có độ dài không hoàn toàn và không ổn định. Nhờ DNA-polymerase sẵn có trong virion, sợi dương không hoàn toàn được tổng hợp thành sợi dương hoàn toàn (để tổng hợp RNA thông tin). Còn sợi âm làm khuôn tổng hợp sợi RNA dương. Sau đó, nhờ sự xúc tác của enzyme RT (enzyme phiên ngược - reverse transcriptase), hàng loạt sợi DNA âm của virus được tổng hợp từ khuôn là sợi RNA dương. Những sợi DNA âm này lại làm khuôn để tổng hợp DNA dương nhưng quá trình này chưa kịp hoàn thiện thì DNA hai sợi này bị nhồi vào vỏ capsid cũng đồng thời hình thành. Ở các retrovirus, genome là phân tử RNA gồm hai đoạn có đầu 5' giống nhau. Dưới tác dụng của enzyme RT và mồi là RNA vận chuyển chuỗi DNA âm tương bù được tổng hợp. Sau khi chuỗi RNA bị phân giải sợi DNA âm được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi DNA dương tương bù. Cấu trúc DNA hai sợi này có các đoạn dài trình tự lặp ở đầu cực (LTR - long terminal repeat). Nhờ LTR này mà sau khi di nhập vào nhân DNA retrovirus tái tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể tế bào ký chủ (trở thành tiền virus - provirus). Provirus nhờ tín hiệu sao chép trong LTR dưới tác dụng của RNA-polymerase của ký chủ mà tổng hợp RNA genome virus (đồng thời với việc tổng hợp các RNA thông tin có kích thước khác nhau). 2. Phiên mã (Transcription) Phiên mã là quá trình sao chép trình tự nucleotide trên DNA gen cấu trúc thành trình tự nucleotide trên RNA thông tin (mRNA). Thông tin di truyền trên DNA như vậy được truyền đạt sang hệ thống tổng hợp các yếu tố hình thành tính trạng. Quá trình này thường diễn ra trên chạc tái bản DNA nên khi hoàn thành quá trình tự sao DNA thì tế bào cũng đã chuẩn bị sẵn lượng lớn RNA thông tin cần thiết. Đồng thời, trên một khuôn DNA có nhiều RNA thông tin được tổng hợp. Về nguyên lý tổng