Hai C-Glycosid flavonoid phân lập từ lá cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC. Rutaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> HAI C-GLYCOSID FLAVONOID PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY XUYÊN TIÊU<br /> (ZANTHOXYLUM NITIDUM (ROXB.) DC. RUTACEAE)<br /> Lê Thị Ngọc Hiệp*, Chung Khánh Linh*, Lê Văn Huấn*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Xuyên tiêu từ lâu đã được sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới để trợ tiêu hóa, đau<br /> răng, đau dây thần kinh, phong thấp… Tại Việt Nam, Xuyên tiêu được sử dụng chủ yếu với bộ phận dùng<br /> là quả. Các công trình khoa học trước đó đã cho thấy dược liệu này rất đa dạng về mặt hóa học, gồm có<br /> alkaloid, flavonoid, triterpenoid, lignan… Những nghiên cứu về được lý cũng chỉ ra rằng các bộ phận khác<br /> cũng sở hữu tiềm năng dược lý trong giảm đau, kháng viêm. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân<br /> lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong cao ethyl acetat chiết từ lá Xuyên tiêu, làm tiền đề cho các thử<br /> nghiệm sinh học và tiêu chuẩn hóa dược liệu.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Lá Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.,<br /> Rutaceae) thu hái tại tỉnh Quảng Ngãi tháng 10 năm 2016. Dược liệu được chiết với cồn 96%, rồi lắc phân<br /> bố lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các kỹ thuật sắc ký (sắc ký cột chân không, sắc ký<br /> cột cổ điển, sắc ký cột Sephadex LH-20) được sử dụng cho mục đích phân tách và phân lập hợp chất tinh<br /> khiết. Các hợp chất phân lập được xác định cấu trúc bằng kỹ thuật phổ UV, MS, NMR.<br /> Kết quả: Dược liệu chiết với cồn 96%, cao cồn toàn phần được lắc phân bố lần lượt với các dung môi<br /> n-hexan, cloroform, ethyl acetat và nước, thu được 4 cao phân đoạn. Từ cao ethyl acetat, bằng các kỹ thuật<br /> sắc ký đã phân lập được 2 hợp chất C-glycosid flavon: vitexin và isoorientin.<br /> Kết luận: Từ phân đoạn ethyl acetat chiết từ lá Z. nitidum đã phân lập được 2 hợp chất C-glycosid<br /> flavon. Trong đó, vitexin lần đầu tiên công bố phân lập từ dược liệu này. Các chất phân lập sẽ là tiền đề cho<br /> các thử nghiệm về sinh học cũng như làm chất chuẩn trong tiêu chuẩn hóa dược liệu.<br /> Từ khóa: Zanthoxylum nitidum, Xuyên tiêu, flavonoid, vitexin, isoorientin.<br /> ABSTRACT<br /> TWO FLAVONOID C-GLYCOSIDES FROM THE LEAVES<br /> OF ZANTHOXYLUM NITIDUM (ROXB.) DC., RUTACEAE<br /> Le Thi Ngoc Hiep, Chung Khanh Linh, Le Van Huan<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 1 – 5<br /> <br /> Background: Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC. has been used in many countries for su pporting<br /> intestinal problems, treating toothache, neuralgia, rheumatoid arthritis… In Vietnam, fruits of Z.<br /> nitidum are considered to be the main pharmacognostical resource for medicine. Recent studies have<br /> shown that other parts of this plant also possessed potential bioactivities, especially in pain-relief and<br /> anti-inflammation. This study was conducted to identify the chemical constituents of ethyl acetate<br /> extract from the leaves of Z. nitidum as a first step for further pharmacological study and<br /> standardization of this herbal medicine.<br /> Materials and methods: The leaves of Z. nitidum, collected in Quang Ngai Province, Vietnam in<br /> October, 2016. Plant material was macerated with ethanol 96%. The crude extract was separated by liquid-<br /> liquid distribution. The isolations of pure compounds were carried out by different means of column<br /> *<br /> Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Lê Văn Huấn ĐT: 0934126086 Email: lvhuan@ump.edu.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Dược 1<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> chromatography (vaccum liquid chromatography, classical column chromatography, Sephadex<br /> chromatography…). The structures of isolated compounds were identified by MS, NMR methods.<br /> Results: Plant material (3.5 kg) was macerated with 96% ethanol. The ethanol extract was evaporated<br /> to a concentrated residue under reduced pressure, then dissolved in water and partitioned with polarity<br /> ascending solvents (n-hexane, chloroform and ethyl acetate) to yield 4 fractions. The ethyl acetate fraction<br /> was separated by different means of chromatography to give 2 flavone C-glycosides: vitexin and isoorientin.<br /> Conclusion: The chemical study of ethyl acetate fraction extracted from the leaves of Z. nitidum led to<br /> the isolation of two flavone C-glycosides: vitexin and isoorientin. Moreover, vitexin was successfully<br /> isolated from the leaves of Z. nitidum for the first time. The compound should be used as marker compounds<br /> for quality measurement Z. nitidum’s leaves and for futher pharmacological studies.<br /> Key words: Zanthoxylum nitidum, vitexin, isoorientin<br /> ĐẶT VẤNĐỀ bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y<br /> Dược TP. Hồ Chí Minh.<br /> Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum (Roxb.)<br /> DC., Rutaceae) từ lâu đã được sử dụng trong Hóa chất<br /> dân gian để trợ tiêu hóa, trị giun sán, đau Ethanol 96%, n-hexan, cloroform, ethyl<br /> bụng, nôn mửa, đau nhức răng và đau acetat của Sci-Tech Co.Ltd (Trung Quốc),<br /> lưng ….Bộ phận được sử dụng nhiều nhất<br /> (3,5) methanol của Scharlau (Tây Ban Nha) dùng<br /> của Xuyên tiêu ở nước ta là quả với tên gọi cho chiết xuất.<br /> Hoa tiêu hay Thục tiêu(4) Các công trình khoa Chiết xuất-Phân lập<br /> học trước đó đã cho thấy dược liệu này rất đa 3,5 kg dược liệu sấy khô, xay nhỏ, chiết<br /> dạng về mặt hóa học, gồm có alkaloid, ngấm kiệt bằng ethanol 96%, cô thu hồi cồn<br /> flavonoid, triterpenoid, lignan… Những thu được dịch chiết cồn đậm đặc. Dịch chiết<br /> nghiên cứu về dược lý cũng cho thấy không đậm đặc tiếp tục bốc hơi trên bếp cách thủy<br /> chỉ riêng quả mà các bộ phận khác của Xuyên đến cao đặc, sau đó hòa vào nước, lắc phân bố<br /> tiêu cũng có tác dụng đáng chú ý, đặc biệt lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexan,<br /> trong giảm đau và kháng viêm(1). Tuy nhiên ở cloroform, ethyl acetat để phân tách các chất<br /> Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu sâu theo độ phân cực khác nhau.<br /> về hệ thống cây này và hầu hết các tài liệu<br /> không đề cập đến thành phần flavonoid trong Phương pháp sắc ký<br /> lá, đa phần dừng lại ở bộ phận dùng là quả. Vì Sắc ký lớp mỏng: Thực hiện trên bản<br /> vậy đề tài được tiến hành với mục đích phân mỏng silica gel 60 F254 (Merck). Sau khi khai<br /> lập và xác định các hợp chất trong phân đoạn triển bằng hệ dung môi thích hợp, phát hiện<br /> cao ethyl acetat từ lá Xuyên tiêu (Z. nitidum) dưới đèn UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử<br /> làm tiền đề cho các thử nghiệm sinh học và<br /> VS và thuốc thử FeCl3.<br /> tiêu chuẩn dược liệu.<br /> Sắc ký cột chân không: Chất hấp phụ là<br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU silica gel hạt vừa kích thước 40-63 μm. Tiến<br /> Nguyên liệu hành nạp mẫu khô, khai triển bằng hệ dung<br /> Lá của cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum môi DCM-MeOH.<br /> nitidum (Roxb.) DC., Rutaceae) được thu hái Sắc ký rây phân tử: Pha tĩnh là 50 g<br /> tháng 10 năm 2016 tại huyện Nghĩa Hành, tỉnh Sephadex LH-20 trương nở trong MeOH. Tiến<br /> Quảng Ngãi, mẫu được định danh và lưu tại hành nạp mẫu ướt, khai triển bằng MeOH.<br /> <br /> <br /> <br /> 2 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phương pháp xác định cấu trúc hóa học vết màu vàng và thuốc thử FeCl3 10% (TT)<br /> các chất: Kết hợp phương pháp đo phổ MS và xuất hiện vết màu xanh rêu với Rf = 0,53.<br /> phổ cộng hưởng từ NMR.<br /> Phổ ESI-MS cho tín hiệu ion [M-H]- =<br /> KẾT QUẢ<br /> 431,06 ở mode (-), suy ra khối lượng phân tử<br /> Chiết xuất và tách phân đoạn của ZN4 là 432 đvC, tương ứng với công thức<br /> 3,5 kg dược liệu lá Xuyên tiêu được chiết phân tử C21H20O10.<br /> xuất với 35 lít cồn 96%, cô thu hồi dung môi Phổ 13C-NMR, kết hợp DEPT-90 và DEPT-<br /> thu được 450 g cao cồn toàn phần. 400 g cao 135, cho 19 tín hiệu cộng hưởng tương ứng với<br /> cồn toàn phần được phân tán vào 1 lít nước 21 carbon, bao gồm 1 carbon nhóm carbonyl<br /> cất, lắc phân bố lần lượt với n-hexan, >C=O (δC 182,1), 8 carbon bậc 4, 11 carbon<br /> methin và 1 carbon methylen (δC 61,3).<br /> cloroform và ethyl acetat, thu được cao n-<br /> hexan (9,35 g), cao cloroform (43,3 g), cao ethyl Phổ 1H-NMR cho 2 tín hiệu đặc trưng của<br /> acetat (60 g) và phần nước còn lại cô cắn thu hệ AAʹBBʹ trên vòng thơm tại δH 8,02 (2H; d; J<br /> được cao nước (272 g). = 8,5 Hz; H-2ʹ,H-6ʹ) và δH 6,89 (2H; d; J = 8,5<br /> Hz; H-3ʹ, H-5ʹ); 2 tín hiệu proton đỉnh đơn δH<br /> Khi tiến hành cô giảm áp thu hồi dung môi<br /> 6,27 (1H; s) và δH 6,77 (1H; s) của một flavon;<br /> phân đoạn ethyl acetat, xuất hiện kết tủa vàng.<br /> và 1 proton δH 4,69 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-1ʹʹ) là<br /> Tủa được lọc và rửa nhiều lần bằng MeOH,<br /> proton anomer của một C-glycosid.<br /> thu được ZN4 (700 mg).<br /> Tương quan HMBC giữa proton δH 6,77<br /> 50 g cao ethyl acetat được tiến hành phân<br /> với các tín hiệu carbon tại δC 121,6 (C-1ʹ); δC<br /> tách bằng sắc ký cột chân không với hệ dung<br /> 164,0 (C-2); δC 104,1 (C-10) cho thấy đây là<br /> môi có độ phân cực tăng dần DCM-MeOH<br /> proton H-3. Tương tự, tương quan HMBC<br /> (100:0  70:30) thu được 9 phân đoạn<br /> giữa proton δH 6,27 với tín hiệu carbon tại δC<br /> (EA1EA9). Phân đoạn EA8 được tiếp tục<br /> 160,4 (C-5); δC 104,6 (C-8);δC 104,1 (C-10) cho<br /> phân tách bằng sắc ký cột cổ điển bằng dung<br /> thấy đây là proton H-6.<br /> môi ethyl acetat thu được 5 phân đoạn (EA8.1<br />  EA8.5), trong đó có phân đoạn EA8.4 có kết Hằng số ghép J=10,0 Hz của H-1ʹʹ cùng với<br /> tủa vàng khi tiến hành cô thu hồi dung môi. độ dời hóa học trong vùng 60-80 ppm của 6 tín<br /> Tủa được lọc và tinh chế bằng sắc ký cột hiệu carbon (δC 73,4; 70,9; 78,7; 70,6; 81,8 và<br /> Sephadex thu được ZN6 (54 mg). 61,3), kết hợp tương quan HMBC giữa proton<br /> δH 4,69 (H-1ʹʹ) với tín hiệu carbon δC 104,6 (C-8)<br /> Xác định cấu trúc các chất phân lập<br /> khẳng định đây là một flavon gắn đường<br /> Hợp chất ZN4<br /> glucose tại C-8. Thêm vào đó, tương quan<br /> Hợp chất ZN4 được phân lập dưới dạng<br /> HMBC giữa δH 8,02 (H-2ʹ, H-6ʹ) và 6,89 (H-3ʹ,<br /> bột màu vàng, tan trong ethyl acetat,<br /> H-5ʹ) với carbon δC 161,2 (C-4ʹ) cho thấy nhóm<br /> methanol; không tan trong n-hexan, DCM.<br /> hydroxyl gắn vào vị trí C-4ʹ của vòng B.<br /> SKLM bằng hệ dung môi ethyl acetat-<br /> So sánh với dữ liệu phổ từ tài liệu đã được<br /> methanol-nước (100:17:13) cho vết tắt quang ở<br /> công bố(2) ZN4 được xác định là vitexin.<br /> UV 254 nm, phát hiện bằng thuốc thử VS cho<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 3<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Bảng 1: Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) và 1H- Hợp chất ZN6<br /> NMR (500 MHz) của hợp chất ZN4 và vitexin(2) Hợp chất ZN6 được phân lập dưới dạng<br /> (đo trong DMSO-d6) tủa vô định hình màu vàng, tan trong ethyl<br /> Hợp chất ZN4 Vitexin(2) acetat, methanol, không tan trong n-hexan,<br /> Vị trí δC δH, m, (J, Hz) δC δH, m, (J, Hz) DCM. Khi triển khai trên bản mỏng với hệ<br /> 2 164,0 163,91<br /> ethyl acetat-methanol-nước (100:17:13), cho<br /> 3 102,5 6,77 s (1H) 102,41 6,77 s (1H)<br /> 4 182,1 182,04 vết tắt quang dưới UV 365 nm, hiện vết màu<br /> 5 160,4 160,38 vàng với thuốc thử VS, cho vết màu xanh rêu<br /> 6 98,2 6,27 s (1H) 98,14 6,27 s (1H) với TT FeCl3 10% (TT) với Rf = 0,42.<br /> 7 162,6 162,68<br /> Phổ ESI-MS cho tín hiệu ion [M-H]- =<br /> 8 104,6 104,59<br /> 9 156,0 155,98<br /> 447,05 ở mode (-), suy ra khối lượng phân tử<br /> 10 104,1 104,00 của ZN6 là 448 đvC, tương ứng với công thức<br /> 1’ 121,6 121,59 phân tử C21H20O11.<br /> 2’, 6’ 129,0 8,02 d (1H; 8,5) 128,92 8,02 d (1H; 8,0)<br /> Phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy các tín<br /> 3’, 5’ 115,8 6,89 d (1H; 8,5) 115,80 6,89 d (1H; 8,0)<br /> 4’ 161,2 161,12<br /> hiệu đặc trưng của một flavon glycosid, bao<br /> 1” 73,4 4,69 d (1H; 9,5) 73,36 4,69 d (1H; 10,0) gồm 1 carbon nhóm carbonyl (>C=O), 8 carbon<br /> 2” 70,9 3,84 t (1H; 9,5) 70,84 3,84 dd (1H; 10,0; bậc 5, 11 carbon methin và 1 carbon methylen.<br /> 9,0) Số liệu phổ ZN6 tương tự như vitexin, ngoại trừ<br /> 3” 78,7 3,28 s (1H) 78,65 3,29 s (1H)<br /> vị trí đường C-glucose tại C-6. Điều này được<br /> 4” 70,6 70,54 3,34 s (1H)<br /> 5” 81,8 3,26 s (1H) 81,80 3,26 s (1H) khẳng định nhờ tương quan HMBC giữa<br /> 6” 61,3 3,52 m (2H) 61,28 3,52 dd (2H; 11,0; proton anomer δH 4,59 với tín hiệu carbon δC<br /> 5,5) 108,9 (C-6). Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho 3<br /> tín hiệu proton đặc trưng của hệ ABX trên<br /> vòng B δH 7,40 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-2ʹ); δH 6,89<br /> (1H; d; J = 8,0 Hz; H-3ʹ) và δH 7,42 (1H; dd; J =<br /> 8,0 Hz; 2,0 Hz; H-6ʹ). Các vị trí nhóm chức còn<br /> lại được xác định nhờ các thông tin thu được<br /> từ phổ HSQC và HMBC.<br /> So sánh dữ liệu phổ với tài liệu đã được<br /> công bố (2)hợp chất ZN6 được xác định là<br /> isoorientin.<br /> <br /> <br /> Hình 1: Tương quan HMBC của hợp chất ZN4<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Tương quan HMBC của hợp chất ZN6.<br /> <br /> <br /> <br /> 4 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> Bảng 2: Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) và 1H- Với dược liệu lá Xuyên tiêu, nghiên cứu đã<br /> NMR (500 MHz) của hợp chất ZN6 và phân lập được 2 hợp chất C-glycosid flavon là<br /> isoorientin(2) (đo trong DMSO-d6) vitexin và isoorientin từ phân đoạn ethyl<br /> Hợp chất ZN6 Isoorientin(2) acetat. Hai hợp chất này được phân lập và tinh<br /> Vị chế bằng cách rửa nhiều lần với methanol lạnh<br /> δC δH, m, (J, Hz) δC δH, m, (J, Hz)<br /> trí và bằng sắc ký cột Sephadex, đã cho khối<br /> 2 163,7 163,28<br /> lượng khá lớn, gợi ý và tạo tiền đề cho những<br /> 3 102,8 6,67 s (1H) 102,8 6,67 s (1H)<br /> 4 181,9 181,86<br /> nghiên cứu đánh giá các tác dụng sinh học,<br /> 5 160,7 160,68 hoặc tạo nguồn phân lập chất chuẩn cũng như<br /> 6 108,9 108,87 tiêu chuẩn hóa cho dược liệu lá Xuyên tiêu.<br /> 7 163,3 163,66<br /> 8 93,56,48 s (1H) 93,52 6,48 s (1H)<br /> KẾT LUẬN<br /> 9 156,2 156,21 Từ cao ethyl acetat của dược liệu lá Xuyên<br /> 10 103,4 103,4 tiêu đã phân lập được hai C-glycosid flavon là<br /> 1’ 121,4 121,43<br /> vitexin (700 mg) và isoorientin (54 mg). Trong<br /> 2’ 113,3<br /> 7,40 d (1H; 2,0) 113,30 7,40 d (1H; 2,0)<br /> 3’ 145,8 145,75 đó, vitexin là hợp chất lần đầu tiên được công<br /> 4’ 149,7 149,72 bố phân lập từ lá Xuyên tiêu (Zanthoxylum<br /> 5 116,1<br /> 6,89 d (1H; 8,0) 116,06 6,89 d (1H; 8,0) nitidum).<br /> 7,42 dd (1H; 8,0; 7,42 dd (1H; 8,0;<br /> 6 119,0 118,97 TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 2,0) 2,0)<br /> 1” 73,1 4,59 d (1H; 9,5) 73,06 4,59 d (1H; 10,0) 1. Hu J, et al. (2006). Benzophenanthridine alkaloids from<br /> 4,04 dd (1H; 10,0; Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC, and their analgesic and<br /> 2” 70,6 4,04 t (1H; 9,0) 70,62 anti-inflammatory activities. Chem Biodivers, 3(9): pp.990-995.<br /> 9,0)<br /> 3” 79,0 3,16 s (1H) 78,95 3,16 s (1H) 2. Le Canh Viet Cuong, Do Thi Trang, et al. (2015). Flavonoid<br /> glycosides from Antidesma ghaesembilla. Vietnam Journal of<br /> 4” 70,2 3,22 s (1H) 70,22 3,22 s (1H)<br /> Chemistry, 53(2e): pp.94-97.<br /> 5” 81,6 3,14 s (1H) 81,55 3,14 s (1H)<br /> 3. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam quyển II, NXB Trẻ,<br /> 3,43 dd (2H; 11,0; Thành phố Hồ Chí Minh, tr.410.<br /> 6” 61,5 61,49<br /> 5,0) 4. Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở<br /> Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.1143-1145.<br /> BÀNLUẬN<br /> 5. Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999), Cây cỏ có ích ở Việt Nam, NXB<br /> Hiện nay, hầu hết dược liệu Xuyên tiêu Giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.568.<br /> <br /> trên thị trường đều sử dụng bộ phận dùng là<br /> quả. Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu thành Ngày nhận bài báo: 18/10/2018<br /> phần hóa học trong lá nhằm khai thác tiềm Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018<br /> năng sử dụng của bộ phận dùng này. Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 5<br />