Hiệu quả các dịch chiết khổ sâm (Croton tonkinensis ) và đơn châu chấu (Aralia armata ) trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở điều kiện phòng thí nghiệm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của nghiên cứu này là thử nghiệm tính hiệu quả của hai dịch chiết Khổ sâm (Croton tonkinensis) và Đơn châu chấu (Aralia armata) về khả năng phòng AHPND được gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng gây cảm nhiễm thực nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hiệu quả các dịch chiết khổ sâm (Croton tonkinensis ) và đơn châu chấu (Aralia armata ) trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở điều kiện phòng thí nghiệm

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II HIỆU QUẢ CÁC DỊCH CHIẾT KHỔ SÂM (Croton tonkinensis ) VÀ ĐƠN CHÂU CHẤU (Aralia armata ) TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ở ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Trương Hồng Việt1*, Đỗ Thị Cẩm Hồng1, Vũ Thiên Ân1, Trần Bảo Ngọc2, Nguyễn Trần Gia Bảo2, Trần Minh Trung1 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009, sau đó phát tán đến Việt Nam năm 2010. Nó gây ảnh hưởng tiêu cực cho ngành công nghiệp tôm ở Việt Nam với thiệt hại kinh tế khoảng 7,2 triệu Đô la Mỹ trong năm 2012. Mục tiêu của nghiên cứu này là thử nghiệm tính hiệu quả của hai dịch chiết Khổ sâm (Croton tonkinensis) và Đơn châu chấu (Aralia armata) về khả năng phòng AHPND được gây ra bởi Vibrio parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng gây cảm nhiễm thực nghiệm. Có hai thí nghiệm được thực hiện: (1) Phòng bệnh bằng hai loại dịch chiết Khổ sâm hoặc Đơn châu chấu được trộn vào thức ăn với hai nồng độ gồm 2% (20 g dịch chiết/kg thức ăn) và 4% (40 g dịch chiết/kg thức ăn), tôm được cho ăn liên tục suốt 7 ngày trước và sau khi gây nhiễm bệnh bằng phương pháp ngâm trực tiếp dịch nuôi cấy vi khuẩn vào bể tôm. (2) Phòng bệnh bằng hai loại dịch chiết Khổ sâm hoặc Đơn châu chấu được cho trực tiếp vào nước nuôi tôm với hai nồng độ gồm 15 ppm (0,45 g dịch chiết/bể/30 lít nước) và 20 ppm (0,6 g dịch chiết/bể/30 lít nước). Tôm được ngâm dịch chiết 1 giờ trước khi gây nhiễm bệnh bằng phương pháp ngâm trực tiếp dịch nuôi cấy vi khuẩn vào bể tôm, và thêm 1 lần cùng nồng độ dịch chiết đó ở 24 giờ sau gây nhiễm bệnh. Kết quả thí nghiệm 1 cho thấy tỷ lệ sống trung bình khi kết thúc thí nghiệm phòng bệnh (7 ngày) với hai dịch chiết trên ở các nồng độ 2% và 4% đều lớn hơn 60%, và tỷ lệ này có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Philippines (2014) (De la Pena & ctv., 2015). Ở thiệt hại 52% diện tích nuôi tôm sú và 34,7% Việt Nam, ban đầu chỉ xảy ra tại một số vùng, diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng. Đa phần tôm sau đó lan ra các tỉnh vùng Tây Nam Bộ gồm ở giai đoạn 15-45 ngày tuổi, chủ yếu bị bệnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Bến Tre, Tiền Giang, Cà đốm trắng và hoại tử gan tụy (Tổng cục Thuỷ Mau, tính từ đầu năm 2010 đến tháng 6 năm sản, 28/2/2017). Theo kết quả điều tra 5 tháng 2011, tổng thiệt hại ước tính với tổng diện tích đầu năm 2017 cho thấy, diện tích bị bệnh hoại ao nuôi tôm là 98.000 ha. Theo báo cáo ở các trại tử gan tụy ở Đồng bằng sông Cửu Long là 1.557 tôm: ở Bạc Liêu có tổng diện tích ao tôm bị chết ha, chiếm khoảng 13,6%, trong đó tỉnh Bạc Liêu là 11.000 ha, ở Trà Vinh là 6.200 ha với tổng có diện tích bị bệnh lớn nhất (chiếm hơn 25,7% số 330 triệu tôm đã chết làm thiệt hại hơn 12 tỷ tổng diện tích tôm bị bệnh), tiếp đó là các tỉnh đồng và ở Sóc Trăng là 20.000 ha làm thiệt hại Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh (Tổng cục 1,5 tỷ đồng (Mooney, 2012). Trong năm 2014, Thuỷ sản, 11/7/2017). bệnh hoại tử gan tụy cấp xảy ra tại 237 xã, 62 Nguyên nhân chính của AHPND đã được huyện thuộc 22 tỉnh, thành phố. Tổng diện tích xác định là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nuôi tôm bị bệnh là 5.509 ha (chiếm 0,81% tổng (Tran và ctv., 2013). Bộ gen của các chủng gây diện tích thả nuôi của cả nước), trong đó tổng bệnh AHPND có chứa 2 gen tương đồng với các diện tích nuôi tôm theo hình thức thâm canh và gen gây độc của côn trùng Photorhabdus (Pir) bán thâm canh bị thiệt hại 5.067 ha; hình thức với tên gọi là PirA và PirB (Yang và ctv., 2014). nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến và tôm lúa Các gen này nằm trong đoạn ADN có kích thước 441 ha. Bệnh xảy ra trên cả tôm chân trắng và 3,5 kb (kilobase) bên trong một plasmid lớn tôm sú có độ tuổi từ 10 - 103 ngày sau thả; diện (được xem như là nhiễm sắc thể phụ) có kích tích thiệt hại chủ yếu trên tôm chân trắng (3,421 thước 69 kb được bao gồm trong bộ gen của V. ha, chiếm 62% tổng diện tích bị bệnh hoại tử parahaemolyticus, mã hoá cho hai độc tố gây gan tụy cấp) (Tổng cục Thuỷ sản, 22/1/2015). bệnh hoại tử gan tuỵ cấp (Yang & ctv., 2014; Trong năm 2016, bệnh xảy ra tại 299 xã của 82 Han & ctv., 2015). AHPND có thể gây chết đối huyện, thị xã thuộc 25 tỉnh của cả nước, gồm: với tôm sau khi thả nuôi trong khoảng 20-35 Bến Tre, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau. Tổng ngày đầu thả xuống ao nuôi với tỷ lệ chết có thể diện tích bị bệnh là 6.032,68 ha, chiếm 0,9% lên đến 100% (De Schryver & ctv., 2014). Tôm diện tích nuôi tôm. Diện tích nuôi tôm sú bị bệnh bị bệnh AHPND có các dấu hiệu chung như là là 2.456,44 ha; tôm thẻ bị bệnh là 3.576,24 ha. vỏ tôm bị mềm, dạ dày và ruột giữa không có Tôm bệnh có độ tuổi từ 2 - 127 ngày sau thả. thức ăn hoặc đường thức ăn không liên tục, gan Diện tích nuôi thâm canh và bán thâm canh bị tụy bị nhạt màu do màng bao mô liên kết bị bệnh là 5.087,55 ha; nuôi quảng canh, quảng mất sắc tố, và gan tuỵ bị teo và bị chai (NACA, canh cải tiến bị bệnh là 779,59 ha; còn lại nuôi 2012). Ở mức độ mô bệnh học, đặc điểm chính theo các hình thức khác là 165,54 ha. Tỉnh Bạc của AHPND là sự bong tróc hàng loạt các tế bào Liêu có diện tích bị AHPND lớn nhất (chiếm biểu mô của ống gan tuỵ như là tế bào tiết (tế 21,81 %), sau đó đến Sóc Trăng, Cà Mau và các bào B), tế bào sợi (tế bào F), tế bào hấp thụ và địa phương khác. So với năm 2015, bệnh tăng dự trữ (tế bào R), và tế bào phôi hay tế bào mầm về phạm vi 02 xã (chiếm 0,67 %) nhưng diện (tế bào E). Sự bong tróc này bắt đầu từ trung tích bị bệnh giảm 35,96 % (Tổng cục Thủy sản, tâm của cơ quan gan tuỵ rồi tiến triển ra vùng tế 22/2/2017). Đầu năm 2017, một số địa phương bào E. Trong quá trình bong tróc xảy ra không trên địa bàn tỉnh Trà Vinh thiệt hại rất cao như: xuất hiện bất cứ tác nhân nào là nguyên nhân xã Dân Thành (thị xã Duyên Hải) thiệt hại 77% gây bệnh. Tiến trình này xuất hiện theo trình tự diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng, xã Mỹ Long trước hết là giảm sự biệt hoá các tế bào biểu mô Nam (huyện Cầu Ngang) thiệt hại 59% diện tích của ống gan và sự tích tụ máu trong cơ quan gan nuôi tôm sú, xã Long Hữu (huyện Duyên Hải) tuỵ trước khi các tế bào bị bong tróc hàng loạt. 24 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Sau cùng, cơ quan gan tuỵ bị xâm nhập bởi vi Dịch chiết Khổ sâm (Croton tonkinensis) khuẩn và được gọi là sự nhiễm khuẩn thứ cấp chứa các lớp chất chủ yếu là các hợp chất (Thitamadee & ctv., 2016). terpenoid như là flavonoid, alcaloid, polyphenol, Trong những năm gần đây, sự gia tăng sử nó thuộc nhóm cây thuốc và vị thuốc dùng làm dụng kháng sinh và hoá chất để phòng trị bệnh thuốc bổ, thuốc bồi dưỡng, và có tác dụng tốt này đã gây ra tình trạng bất lợi trong lĩnh vực với tiêu hóa và dạ dày (Đỗ Tất Lợi, 2004). nuôi trồng thuỷ sản. Điều này có thể làm xuất Đối với dịch chiết Đơn châu chấu (Aralia hiện nhiều chủng vi khuẩn có khả năng kháng armata), thành phần hoá học có hai triterpenoid kháng sinh, và dư lượng của nó không những (3 β -hydroxyoleana-11,13(18)-diene-28,30- làm hại môi trường nuôi thuỷ sản mà còn ảnh dioic acid và 3-oxooleana-11,13(18)-diene- hưởng không tốt đến sức khoẻ của con người 28,30-dioic acid) và một triterpenoid glycoside (Syahidah, 2014). Theo Pandey & ctv. (2012), (3 β - O -6′- O -methyl- β - d -glucuronopyranosyl dịch chiết thảo dược không chỉ an toàn cho môi oleana-11,13(18)-dien-28-oic acid có khả năng trường, người tiêu thụ mà nó còn có nhiều lợi ích diệt cỏ dại (Miao H., & ctv., 2016). Ngoài ra, trong nuôi trồng thuỷ sản và kinh tế. Vì vậy, việc các hợp chất triterpenoid saponin loại olean có sử dụng dịch chiết thảo dược để kiểm soát bệnh khả năng kháng khuẩn, bảo vệ gan, và bảo vệ dạ nhiễm khuẩn như là chiến lược thay thế kháng dày (Sun & ctv., 2006). sinh và đã áp dụng thành công ở một số nước Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá như là Mexico, Ấn Độ, Thái Lan, và Nhật Bản (Yin & ctv., 2008). Ở Thái Lan, báo cáo cho thấy hiệu quả của hai loại dịch chiết bằng cồn của rằng dịch chiết củ Riềng (Alpinia galanga) có Khổ sâm và Đơn châu chấu trong việc phòng khả năng ức chết sự phát triển của 8 loài Vibrio trị AHPND do Vibrio parahaemolyticus gây ra gây bệnh trong đó có V. parahaemolyticus gây trên tôm thẻ chân trắng trong điều kiện phòng bệnh hoại tử cấp (Chaweepack & ctv., 2015a). thí nghiệm. Ở Việt Nam, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP một số cây có tính kháng khuẩn dùng để trị bệnh 2.1. Vật liệu trong nuôi trồng thuỷ sản từ thập niên 90. Hà Ký (1995) đã nghiên cứu một số loài thảo dược Dịch chiết thô Khổ sâm và Đơn châu chấu bao gồm rau nghể hay răm nước (Polygonum được cung cấp bởi Viện hoá học và các hợp chất hydropiper), rau sam (Portulaca oleracea), thiên nhiên. Dịch thô được tách chiết bằng cồn cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá tuyệt đối, cô đặc và được bảo quản ở nhiệt độ nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia phòng. calendulacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công Tôm thẻ chân trắng có trọng lượng từ 2-3 anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium gram được mua từ Trung tâm Giống Hải sản indicum) và cây chó đẻ răng cưa hay còn gọi là Nam Bộ. Tôm trước khi làm thí nghiệm được diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria) có thể sử nuôi thuần 5-7 ngày tại phòng thí nghiệm thuộc dụng trong phòng trị bệnh đốm đỏ ở cá trắm Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh thủy cỏ. Bùi Quang Tề & Lê Xuân Thành (2006) đã sản Nam bộ. Tôm trước khi thí nghiệm được nghiên cứu thành công 2 loại chế phẩm thảo dược kiểm tra bệnh hoại tử bằng phương pháp mô học VTS1-C, VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết để kiểm tra AHPND. tách từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia Chủng Vibrio parahaemolyticus ST8T calendulacea) sử dụng phòng bệnh nhiễm khuẩn (được phân lập từ mẫu tôm bệnh ở Sóc Trăng) cho tôm cá. Nguyễn Ngọc Phước & ctv., (2007) gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) được sản xuất chế phẩm sinh học bokashi được chiết cung cấp bởi Trung tâm Quan trắc Môi trường xuất từ lá trầu dùng để điều trị các bệnh do vi và Bệnh Thuỷ sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu khuẩn gây ra trên động vật thủy sản. Nuôi trồng Thuỷ sản II. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 25
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 2.2. Thử nghiệm khuếch tán trên đĩa giấy 3 đĩa môi trường thạch TCBS với thể tích 0,1 ml Hiệu quả kháng khuẩn của các dịch chiết trên mỗi đĩa. Đĩa thạch được ủ ở 30oC trong thời Khổ sâm và Đơn châu chấu được xác định gian 18-24 giờ. Chọn nồng độ có khuẩn lạc mọc bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa giấy. Thí rời với số lượng từ 30 đến 300. nghiệm được thực hiện theo Oometta-aree & 2.4. Chuẩn bị dịch vi khuẩn cho thí nghiệm ctv., (2006) và Chaweepack & ctv., (2015a) như cảm nhiễm sau: Một khuẩn lạc đơn Vibrio parahaemolyticus Phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cho cảm được cấy tăng sinh trên môi trường Nutrient agar nhiễm dựa vào phương pháp được mô tả bởi (NA) + 1,5% NaCl, đĩa thạch được ủ ở 30oC Joshi & ctv., (2014) và Trương Hồng Việt & ctv., trong 24 giờ. Huyền phù vi khuẩn trong dung (2017) với một vài bổ sung như sau: Một khuẩn dịch NaCl 2% để đạt được mật độ vi khuẩn 108 lạc đơn được tăng sinh trong 20 ml NB+1,5% CFU/ml (dựa vào ống Mc.Farland 0,5). Sau đó, NaCl, ủ 30oC, trong 2 giờ, lắc 200 rpm. Chuyển dịch huyền phù này được pha loãng đến mật độ 5 ml dịch khuẩn vào trong 500 ml NB+1,5% 106 CFU/ml và trải 1 ml lên môi trường Mueller NaCl, ủ 30oC, lắc 200 rpm, trong khoảng 3 Hinton agar. Đĩa giấy vô trùng (đường kính 0,6 giờ. Đo mật độ vi khuẩn bằng máy quang phổ mm) được tẩm 60 ml dịch chiết Khổ sâm hoặc (Biorad) với chỉ số OD600nm đến khi đạt được từ Đơn châu chấu có nồng độ là 2% trong cồn 0,800 đến 0,900. Dựa vào đường chuẩn y = a*x tuyệt đối và được để khô trong tủ cấy. Đặt các + b (y là mật độ vi khuẩn; x là giá trị OD600nm) đĩa giấy đã được tẩm dịch chiết lên đĩa thạch được xây dựng ở Mục 2.3 để suy ra mật độ vi đã được trải vi khuẩn và ủ ở 30oC trong 24 giờ. khuẩn. Liều cảm nhiễm phòng bệnh bằng dịch Hiệu quả của dịch chiết thực vật được đánh giá chiết thực vật là mật độ vi khuẩn gây chết tôm dựa vào vòng ức chế vi khuẩn. 85% (LD85). 2.3. Xây dựng đường chuẩn mật độ vi 2.5. Xác định mật độ vi khuẩn gây chết khuẩn theo giá trị mật độ quang (OD) 85% (LD85) Mật độ Vibrio parahaemolyticus (VP) dùng Để tìm LD85, thí nghiệm cảm nhiễm thăm dò cho thí nghiệm cảm nhiễm thực nghiệm được được thực hiện với 4 nồng độ V. parhaemolyticus ước lượng bằng cách xây dựng phương trình hồi theo tỷ 4/4, 3/4, 2/4, và 1/4. Dịch nuôi cấy vi qui tuyến tính y = ax + b (Despres J. P. & ctv., khuẩn được đo giá trị OD600nm đến khi đạt từ 1991) giữa các giá trị chỉ số OD ở bước sóng 0,800 đến 0,900. Dựa vào đường chuẩn (y = a*x 600 nm (OD600nm) và mật độ vi khuẩn (CFU/ml) + b) được xây dựng ở mục 2.3 để ước lượng mật được nuôi cấy và đếm số tế bào sống trong môi độ vi khuẩn của dịch nuôi cấy. Dịch nuôi cấy trường Nutrient Broth (NB) bổ sung 1,5% NaCl này được dùng cho cảm nhiễm bằng phương (NB+1,5% NaCl). Một khuẩn lạc đơn của VP pháp ngâm trực tiếp vi khuẩn để đạt được mật được tăng sinh trong 20 ml NB+1,5% NaCl, ủ độ cuối cùng theo tỷ lệ trên. Nghiệm thức đối 30oC trong tủ lắc 200 rpm, trong 2 giờ. Chuyển chứng âm được ngâm với thể tích môi trường mỗi 1 ml dịch nuôi cấy vào 3 bình khác nhau có NB bằng với thể tích dịch vi khuẩn cảm nhiễm ở chứa 100 ml môi trường NB+1,5% NaCl. Sau nồng độ cao nhất. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 bể, đó, 3 bình này được ủ ở 30oC, lắc 200 rpm, trong mỗi bể 20 tôm trong 30 lít nước biển có độ mặn khoảng 3 giờ, được đo và điều chỉnh để được 20 ppt trong bể nhựa 90 lít. Tôm được cho ăn các chỉ số OD600nm độc lập với nhau, bao gồm bằng thức ăn thương mại 3 lần/ngày, với lượng 0,80x; 0,85x và 0,90x tương ứng cho mỗi bình. 3% trọng lượng thân. Tôm chết được ghi nhận Mỗi giá trị OD600nm của dịch nuôi cấy vi khuẩn hàng ngày và thí nghiệm được kết thúc khi tôm được đếm số lượng tế bào sống bằng cách pha ở các nghiệm thức thí nghiệm ngưng chết trong loãng dãy nồng theo cơ số 10, mỗi nồng độ pha 3 ngày liên tục. Các bể tôm không được thay loãng (10-4, 10-5, và 10-6) được dùng để trải trên nước trong suốt thời gian thí nghiệm. LD85 được 26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II tính toán bằng cách xây dựng phương trình hồi 30 lít nước biển có độ mặn 20ppt trong bể nhựa qui tuyến tính Y = a*X+b (Y là tỷ lệ chết tích 90 lít. Đối với các nghiệm thức ăn thức ăn có luỹ sau cảm nhiễm; X là mật độ vi khuẩn CFU/ trộn dịch chiết, tôm tiếp tục cho ăn sau cảm ml) giữa các mật độ vi khuẩn cảm nhiễm và thời nhiễm 1 giờ, và cho ăn liên tục trong suốt thời điểm kết thúc thí nghiệm (Stephen C. E., 1977). gian thí nghiệm. Các bể tôm không được thay 2.6. Thử nghiệm độc tính của dịch chiết nướctrong suốt thời gian thí nghiệm. Tôm chết Thử nghiệm độc tính của dịch chiết Khổ được ghi nhận hàng ngày và thí nghiệm được sâm và Đơn châu chấu được thực hiện với hai thí kết thúc khi tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm nghiệm: Thí nghiệm (1) bằng cách cho tôm ăn ngưng chết trong 3 ngày liên tục. 3 lần/ngày với 5% trọng lượng thân, cho ăn liên 2.8. Phòng bệnh bằng dịch chiết qua đường tục suốt 7 ngày với 2 nồng độ bao gồm 2% (20 nước nuôi tôm g dịch chiết/kg thức ăn) và 4% (40 g dịch chiết/ Thí nghiệm được thực hiện bằng phương kg thức ăn); (2) bằng cách ngâm trực tiếp vào pháp ngâm hai loại dịch chiết Khổ sâm hoặc nước nuôi tôm với 2 nồng độ bao gồm 20 ppm Đơn châu chấu để đạt được nồng cuối cùng (0,6g/30 lít nước) và 40 ppm (1,2g/30 lít nước). là 15 ppm (0,45 g dịch chiết/bể/30 lít nước) Đối chứng âm không cho ăn hoặc ngâm dịch và 20 ppm (0,6 g dịch chiết/bể/30 lít nước). chiết. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại Tôm được ngâm dịch chiết 1 giờ trước khi 3 bể, mỗi bể 20 tôm trong 30 lít nước biển có cảm nhiễm vi khuẩn, và lặp lại nồng độ dịch độ mặn 20 ppt. Tôm được cho ăn bằng thức ăn chiết 1 lần sau 24 giờ gây nhiễm. Dịch nuôi thương mại, 3 lần/ngày với liều 3% trọng lượng cấy vi khuẩn được đo giá trị OD600nm đến khi thân. Các bể tôm không được thay nước trong đạt từ 0,800 đến 0,900. Dựa vào đường chuẩn suốt thời gian thí nghiệm. Thí nghiệm được theo (y = a*x + b) được xây dựng ở mục 2.3 để dõi trong suốt 7 ngày. ước lượng mật độ vi khuẩn của dịch nuôi cấy. 2.7. Phòng bệnh bằng dịch chiết qua đường Dịch nuôi cấy này được dùng cho cảm nhiễm thức ăn theo mật độ LD85. Nghiệm thức đối chứng Thí nghiệm được thực hiện với một trong âm được ngâm với thể tích môi trường NB hai loại dịch chiết Khổ sâm hoặc Đơn châu chấu tương đương với thể tích dịch vi khuẩn dùng với nồng độ 2% (20 g dịch chiết/kg thức ăn) và cảm nhiễm. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 bể, mỗi 4% (40 g dịch chiết/kg thức ăn), tôm được cho bể 20 tôm trong 30 lít nước biển có độ mặn ăn 3 lần/ngày với 5% trọng lượng thân, cho ăn 20 ppt trong bể nhựa 90 lít. Tôm được cho liên tục suốt 7 ngày trước khi gây nhiễm bệnh ăn bằng thức ăn thương mại, 3 lần/ngày với bằng phương pháp ngâm vi khuẩn. Sau 7 ngày liều 3% trọng lượng thân, và cho ăn liên tục ghi nhận số tôm chết để đánh giá khả năng gây trong suốt thời gian thí nghiệm. Các bể tôm độc của dịch chiết khi trộn vào thức ăn. Đối với không được thay nước trong suốt thời gian thí các nghiệm thức đối chứng, tôm được cho ăn nghiệm. Tôm chết được ghi nhận hàng ngày thức ăn không trộn với dịch chiết. Dịch nuôi và thí nghiệm được kết thúc khi tôm ở các cấy vi khuẩn được đo giá trị OD600nm đến khi đạt nghiệm thức thí nghiệm ngưng chết 3 ngày từ 0,800 đến 0,900. Dựa vào đường chuẩn (y liên tiếp. = a*x + b) được xây dựng ở mục 2.3 để ước 2.9. Phân tích thống kê lượng mật độ vi khuẩn của dịch nuôi cấy. Dịch Số liệu các thí nghiệm được phân tích thống nuôi cấy này được dùng cho cảm nhiễm theo kê bằng phần mềm SPSS. Phân tích ANOVA để mật độ LD85. Nghiệm thức đối chứng âm được tìm sự khác biệt giữa các nghiệm thức tại thời ngâm với thể tích môi trường NB tương đương điểm kết thúc thí nghiệm. Nếu khác biệt ý nghĩa với thể tích dịch vi khuẩn dùng cảm nhiễm. Mỗi được xác định, Tukey’s Testđược phân tích để nghiệm thức lặp lại 3 bể, mỗi bể 20 tôm trong tìm sự khác biệt ở mức ý nghĩa p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II III. KẾT QUẢ báo cáo của Oonmetta-aree & ctv., (2006), hoạt 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của hai dịch động ức chế sự phát triển vi khuẩn được xem là chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu kháng khi có đường kính vòng kháng khuẩn ≤ 9 mm, kháng vừa khi có đường kính vòng kháng Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn khuẩn ≥ 10-13 mm, và nhạy khi có đường kính của hai dịch chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu vòng kháng khuẩn ≥ 14 mm. Dựa vào các thông bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa giấy được số này suy ra dịch chiết Khổ sâm và Đơn châu thể hiện ở Bảng 1. Kết quả cho thấy đường kính chấu là nhạy đối với Vibrio parahaemolyticus trung bình của vòng ức chế vi khuẩn lần lượt gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp trên tôm. là 18 mm và 25 mm. Theo Lorian (1995) trong Bảng 1: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa Dịch chiết và dung môi Đường kính vòng ức chế Note n=6 vi khuẩn (mm) Khổ sâm 18 ± 0,3 Nhạy Đơn châu chấu 25 ± 0,3 Nhạy Cồn tuyệt đối 0±0 A B Hình 1. Vòng ức chế phát triển đối với Vibrio parahaemolyticus bởi các mẫu dịch chiết thô. Ảnh A: ĐCC (Đơn châu chấu), MB (Bọ mắm), KHD (Ké hoa đào), Eth (cồn tuyệt đối). Ảnh B: KS (Khổ sâm), HT (Hàn the), TD (Thuốc dấu), Eth (cồn tuyệt đối).. 3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn mật độ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Để ước lượng mật độ Vibrio parahaemolyticustại thời điểm gây nhiễm, đường chuẩn hồi qui tuyến tính tương quan giữa 3 giá trị mật độ quang (OD) bao gồm 0,805; 0,853 và 0,906 được đo ở bước sóng 600 nm và mật độ vi khuẩn được đếm số lượng tương ứng được trình bày ở Bảng 2 và Hình 2. Hình 2. Phương trình hồi qui tuyến tính được xây dựng dựa vào các chỉ số OD và mật độ vi khuẩn đếm được tương ứng. 28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 2 thể hiện phương trình hồi qui ước lượng dựa vào đường chuẩn là từ 9,0 x tuyến tính được xây dựng là y = 5,95*x-3,86 108 CFU/ml đến 1,5 x 109 CFU/ml tương ứng (y là mật độ vi khuẩn x 109 CFU/ml; x là giá với chỉ số OD cần gây nhiễm thực nghiệm từ trị OD được đo ở bước sóng 600nm) có hệ 0,800 đến 0,900. số xác định R2=99,5%. Mật độ vi khuẩn được Bảng 2: Mật độ vi khuẩn (CFU.mL-1) được trải đĩa và đếm theo các chỉ số OD600nm Số khuẩn lạc Hệ số pha Mật độ vi khuẩn OD600nm số đĩa trong 0,1ml loãng (CFU,ml-1) 1 95 9,5 x 108 1 0,805 2 98 10-6 9,8 x 108 3 89 8,9 x 108 1 121 1,21 x 109 2 0,853 2 114 10-6 1,14 x 109 3 123 1,23 x 109 1 154 1,54 x 109 3 0,906 2 150 10-6 1,50 x 109 3 157 1,57 x 109 3.3. Thử nghiệm độc tính của dịch chiết chiết thực vật, LD85 được xác định làm cơ sở thực vật đối với tôm cho thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ở điều Thử nghiệm độc tính của dịch chiết Khổ kiện phòng thí nghiệm. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sâm và Đơn châu chấu được thực hiện với hai đo được giá trị OD600nm là 0,892. Dựa vào đường thí nghiệm: Thí nghiệm (1) bằng cách cho tôm chuẩn (y = 5,95*x -3,86) ước lượng được mật ăn 3 lần/ngày với 5% trọng lượng thân, cho ăn độ vi khuẩn của dịch nuôi cấy vi khuẩn là 1,45 x liên tục suốt 7 ngày với 2 nồng độ bao gồm 2% 109 CFU/ml. Dịch nuôi cấy này được dùng cho (20 g dịch chiết/kg thức ăn) và 4% (40 g dịch cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm trực tiếp chiết/kg thức ăn); (2) bằng cách ngâm trực tiếp vi khuẩn để đạt được mật độ cuối cùng trong vào nước nuôi tôm với 2 nồng độ bao gồm 20 bể thí nghiệm là 2,12 x 106 CFU/ml (60ml dịch ppm (0,6g/30 lít nước) và 40 ppm (1,2g/30 lít nuôi cấy vi khuẩn); 1,59 x 106 CFU/ml (45ml nước). Kết quả cho thấy ở tất cả các nghiệm dịch nuôi cấy vi khuẩn); 1,06 x 106 CFU/ml (30 thức thí nghiệm được ghi nhận không có tôm bị ml dịch nuôi cấy vi khuẩn); và 0,53 x 106 CFU/ chết sau 7 ngày ăn hoặc tiếp xúc với dịch chiết. ml (15 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn). Kết quả gây Điều này có thể nói rằng các dịch chiết không nhiễm được trình bày ở Hình 3. độc đối với tôm thẻ chân trắng. Hình 3 bên dưới thể hiện tôm bắt đầu chết 3.4. Xác định mật độ gây chết 85% (LD85) nhiều ở ngày thức 2 và ngưng chết ở ngày thứ của Vibrio parahaemolyticus 7 sau gây nhiễm. Ngoài ra, kết quả thí nghiệm Để đưa ra biện pháp phòng bệnh hoại cũng cho thấy rằng tỷ lệ tôm chết càng cao tương tử gan tuỵ cấp (AHPND) gây ra bởi V. ứng với các mật độ vi khuẩn càng lớn. Ở mật parahaemolyticus nhiễm trên tôm thẻ bằng dịch độ vi khuẩn cao nhất (2,12 x 106 CFU/ml), tôm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 29
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ngưng chết ở ngày thứ 6, với tỷ lệ chết là 96,7%. chết tương ứng lần lượt là 85%, 55%, và 33,3%. Trong khi đó, ở 3 tỷ lệ vi khuẩn còn khác (1,59 Sau 9 ngày thí nghiệm gây nhiễm, nghiệm thức x 106 CFU/ml; 1,06 x 106 CFU/ml; và 0,53 x 106 đối chứng âm không ghi nhận tôm chết. CFU/ml), tôm ngưng chết ở ngày thứ 7, với tỷ lệ Hình 3. Tỷ lệ tôm chết được ghi nhận sau 9 ngày gây nhiễm trên tôm thẻ chân trắng với các mật độ Vibrio parahaemolyticus khác nhau.. Để xác định LD85, phương trình hồi qui vi khuẩn khác nhau. Kết quả được trình bày ở tuyến tính được xây dựng dựa vào số liệu tỷ lệ Hình 4. tôm chết sau 7 ngày gây nhiễm ở các mật độ Hình 4. Phương trình hồi qui tuyến tính được xây dựng dựa vào tỷ lệ tôm chết sau 7 ngày cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm với Vibrio parahaemolyticus. Hình 4 thể hiện phương trình hồi qui tuyến tỷ lệ chết tích luỹ sau 7 ngày cảm nhiễm; X là tính được xây dựng là Y = 52,21*X+1,82 (Y là mật độ vi khuẩn x 106 CFU/ml) có hệ số xác 30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II định R2=99,4%. LD85 được ghi nhận dựa vào (40 g/kg thức ăn). Dịch nuôi cấy vi khuẩn đo phương trình hồi qui tuyến tính là 1,6 x 106 được giá trị OD600nm là 0,876. Dựa vào đường CFU/mlsau 7 ngày. Mật độ này được sử dụng chuẩn (y = 5,95*x -3,86) ước lượng được mật cho thí nghiệm cảm nhiễm phòng bệnh AHPND độ vi khuẩn của dịch nuôi cấy vi khuẩn là 1,35 x bằng các dịch chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu. 109 CFU/ml. Dịch nuôi cấy này được dùng cho 3.5. Phòng bệnh bằng dịch chiết thực vật cảm nhiễm theo mật độ LD85 (1,6 x 106 CFU/ qua đường thức ăn ml) với thể tích dịch nuôi cấy vi khuẩn được Tôm được cho ănhai loại dịch chiết Khổ sử dụng là 36 ml. Nghiệm thức đối chứng âm sâm và Đơn châu chấu trước và sau gây nhiễm được ngâm với 36 ml môi trường NB. Số tôm 7 ngày với nồng độ 2% (20 g/kg thức ăn) và 4% chết được ghi nhận hàng ngày đến khi kết thúc thí nghiệm. Hình 5. Tỷ lệ sống của tôm sau 7 ngày gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus của thí nghiệm phòng bệnh bằng dịch chiết Khổ sâm với nồng độ 2% và 4% trộn vào thức ăn. Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghĩa thống kê (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bệnh với nồng độ 2% và 4% không có sự khác này có thể nói rằng dịch chiết Đơn châu chấu có biệt ý nghĩa thống kê (p>0,05), và 2 nghiệm hiệu quả phòng bệnh hoại tử gan tuỵ cấp ở tôm thức này có sự khác biệt ý nghĩa (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 7. Tỷ lệ sống của tôm sau 9 ngày gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus của thí nghiệm phòng bệnh bằng dịch chiết Khổ sâm với các nồng độ 15 ppm và 20 ppm cho vào nước nuôi. Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghĩa thống kê (p
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.7. Phân tích mô bệnh học Sau khi kết thúc thí nghiệm, tôm sống được - Kết quả mô học của thử nghiệm độc cố định trong dung dịch Davidson để kiểm tra tính đối với tôm được ngâm dịch chiết mô bệnh học. Hình 9. Cấu trúc mô học của gan tuỵ của tôm được thử nghiệm độc tính của dịch chiết ở nồng 40 ppm sau 7 ngày: (A) Dịch chiết Khổ sâm và (B) Dịch chiết Đơn châu chấu, gan tuỵ xuất hiện nhiều tế bào tiết hay tế bào B và có số ít tế bào dự trữ hay tế bào R. (C) Đối chứng, gan tuỵ có nhiều cả tế bào B và tế bào R. Mũi tên mập: tế bào B có chứa một không bào lớn; Mũi tên mảnh: tế bào R có chứa một hoặc nhiều không bào nhỏ. Độ phóng đại 400 lần. Kết quả cho thấy gan tuỵ của tôm ở tất của tôm có nhiều cả tế bào B và tế bào R. Điều cả các nghiệm thức thí nghiệm có biểu hiện cấu này có thể nói rằng các dịch chiết Khổ sâm và trúc mô học bình thường. Ở hai nhóm ngâm Đơn châu chấu không gây độc đối với tôm ngay dịch chiết Khổ sâm (Hình 9A) và Đơn châu cả ở nồng độ 40 ppm, các dịch chiết này còn chấu (Hình 9B) với nồng độ 40 ppm, các tế bào kích thích miễn dịch cho các tế bào biểu mô của biểu mô của ống gan tuỵ được biệt hoá thành ống gan tuỵ của tôm biệt hoá nhiều tế bào tiết nhiều tế bào tiết hay tế bào B (chứa một không hay tế bào B. bào lớn) và một số ít tế bào dự trữ hay tế bào R - Kết quả mô bệnh học của tôm thí (chứa một hoặc nhiều không bào nhỏ). Trong nghiệm phòng trị dịch chiết trộn vào thức ăn khi đó, ở nhóm đối chứng (Hình 9C), gan tuỵ 34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 10. Cấu trúc mô bệnh học của gan tuỵ tôm thí nghiệm phòng trị dịch chiết thực vật trộn vào thức ăn với liều 4%. (A) Đối chứng âm hiện diện nhiều tế bào Bvà R. (B) Dịch chiết Khổ sâm và (C) Dịch chiết Đơn châu chấuvẫn duy trì cấu trúc gan bình thường và xuất hiện nhiều tế bào B. (D) Đối chứng dương có dấu hiệu bong tróc các tế bào biểu mô và giảm số lượng không bào của tế bào B và R. Mũi tên mập: tế bào B có chứa một không bào lớn; Mũi tên mảnh: tế bào R có chứa một hoặc nhiều không bào nhỏ; Mũi tên đứt khúc: các tế bào biểu mô bị bong tróc và rơi vào ống gan. Độ phóng đại 400 lần. Gan tuỵ tôm ở nhóm đối chứng âm (Hình dịch chiết thực vật (Oonmetta-areea & ctv., 10A) biểu hiện cấu trúc bình thường bao gồm 2006; Vuddhakul & ctv., 2007; Chaweepack có nhiều tế bào tiết hay tế bào B (chứa một & ctv., 2015a và 2015b). Dịch chiết Khổ sâm không bào lớn) và nhiều tế bào dự trữ hay tế (Croton tonkinensis) được cho là có chứa các bào R (chứa một hoặc nhiều không bào nhỏ). lớp chất chủ yếu là các hợp chất terpenoid Trong khi đó, gan tuỵ của tôm ăn thức ăn có trộn như là flavonoid, alcaloid, polyphenol, nó 4% dịch chiết của Khổ sâm (Hình 10B) hoặc thuộc nhóm cây thuốc và vị thuốc dùng làm dịch chiết Đơn châu chấu (Hình 10C) vẫn duy thuốc bổ, thuốc bồi dưỡng, và có tác dụng tốt trì cấu trúc gần như bình thường và xuất hiện với tiêu hóa và dạ dày (Đỗ Tất Lợi, 2004). nhiều tế bào B. Ngược lại, gan tuỵ tôm sắp chết Thành phần hoá học của dịch chiết Đơn châu của nhóm đối chưng dương (Hình 10D) được chấu (Aralia armata) có hai triterpenoid thu mẫu sau 2 ngày gây nhiễm có dấu hiệu tổn (3 β -hydroxyoleana-11,13(18)-diene-28,30- thương cấu trúc mô học phù hợp với nhiễm bệnh dioic acid và 3-oxooleana-11,13(18)-diene- hoại tử gan tuỵ cấp (AHPND) điển hình như là 28,30-dioic acid) và một triterpenoid glycoside sự bong tróc các tế bào biểu mô của ống gan và (3 β - O -6′- O -methyl- β - d -glucuronopyranosyl nó bị rơi vào bên trong ống gan, cùng với đó là oleana-11,13(18)-dien-28-oic acid và các hợp số lượng không bào của tế bào B và R bị giảm chất triterpenoid saponin loại olean có khả năng nghiêm trọng. Các kết quả trên cho thấy rằng kháng khuẩn, bảo vệ gan, và bảo vệ dạ dày các dịch chiết Khổ sâm và dịch chiết Đơn châu (Sun & ctv., 2006; Miao H. & ctv., 2016). Theo chấu có khả năng giúp bảo vệ cấu trúc gan tuỵ Citarasu T., (2010) báo cáo rằng một số hợp của tôm tránh bị tổn thương do độc tố từ Vibrio chất như là phenolics, polyphenols, alkaloids, parahaemolyticus gây ra. quinones, terpenoids, lectines và polypeptides có khả năng thay thế hiệu quả cho kháng sinh IV. THẢO LUẬN trong phòng bệnhnhiễm khuẩn. Vì vậy, nghiên Việc nghiên cứu tìm ra các sản phẩm thân cứu này được thực hiện để xác định hiệu quả thiện và an toàn với môi trường để thay thế của các dịch chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu kháng sinh trong phòng AHPND ở tôm nuôi là trong việc phòng AHPND ở tôm thẻ chân trắng rất cần thiết và cấp bách. Nhiều báo cáo trước trong điều kiện phòng thí nghiệm. Theo kết quả đây đã chỉ ra khả năng kháng khuẩn của các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bằng phương TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 35
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II pháp khuếch tán đĩa cho thấy hai dịch chiết g/kg thức ăn) và 4% (40 g/kg thức ăn). Kết quả Khổ sâm và Đơn châu chấu là nhạy với Vibrio gây nhiễm cho thấy nghiệm thức phòng trị dịch parahaemolyticus. Các thí nghiệm phòng bệnh chiết ở nồng độ cao hơn cho tỷ lệ sống cao bằng dịch chiết thực vật dựa vào gây nhiễm hơn với tỷ lệ sống trung bình sau 7 ngày phòng thực nghiệm theo phương pháp ngâm trực tiếp trị bằng dịch chiết Khổ sâm lần lượt là 63,3% vi khuẩn vào bể tôm, nên việc ước lượng mật ± 7,6% và 71,7% ± 2,9%, còn phòng trị bằng độ vi khuẩn ở tại thời điểm gây nhiễm rất được dịch chiết Đơn châu chấu có tỷ lệ sống trung quan tâm. Theo các báo trước đây, mật độ Vibrio bình cũng tăng dần lần lượt là 61,7% ± 7,6% và parahaemolyticus được nuôi cấy đến pha log 73,3% ± 5,8%. Tuy nhiên, các tỷ lệ này không để đạt các chỉ số OD600nm trong khoảng 0,6 đến có khác biệt ý nghĩa thống kê (p>0,05). Các 0,93 tương ứng với mật độ vi khuẩn 108 CFU/ kết quả này cho thấy hai loại dịch chiết này ml (Joshi & ctv., 2014; Hong X. P., & ctv., 2016; có khả năng ức chế V. parahaemolyticus gây Trương Hồng Việt & ctv., 2017). Trong nghiên bệnh AHPND. Vì thế, tôm mà được ăn thức cứu này, các thí nghiệm gây nhiễm chỉ chọn mật ăn có trộn dịch chiết hoặc là Khổ sâm hoặc độ V. parahaemolyticus ở các chỉ số OD600nm từ là Đơn châu chấu có thể kháng tốt với nhiễm 0,800 đến 0,900 tương ứng với mật độ vi khuẩn khuẩn. Hiệu quả phòng trị này thấp hơn hiệu từ 9,00 x 108 CFU/ml đến 1,5 x 109 CFU/ml quả phòng trị bằng dịch chiết củ riềng mà được (dựa vào đường chuẩn y = 5,95*x-3,86 có hệ số báo cáo trước đây với nồng độ dịch chiết 1% xác định R2 = 99,5%) và thời gian tăng sinh vi và 2% cho tỷ lệ sống lần lượt là 73,3% và 80% khuẩn tối đa 5 giờ để đảm bảo vi khuẩn đang ở (Chaweepack & cvt., 2015a). Tuy nhiên, sự so pha log. Ngoài ra, liều vi khuẩn gây nhiễm cũng sánh hiệu quả này không thể kết luận điều gì rất quan trọng trong thí nghiệm phòng bệnh, bởi vì mỗi phòng thí nghiệm sử dụng chủng vi nó được đòi hỏi phải có khả năng gây chết tôm khuẩn khác nhau, nồng độ vi khuẩn gây nhiễm với tỷ lệ cao và thời gian chết phải kéo dài để khác nhau (2,85 x 105 CFU/ml), và phương thích hợp cho phòng bệnh. Vì vậy, nghiên cứu pháp gây nhiễm (tiêm trực tiếp vào tôm) cũng này được chọn mật độ gây chết tôm 85% (LD85) khác nhau. Theo Chaweepack & cvt. (2015b), sau 7 ngày là 1,6 x 106 CFU/ml được suy ra từ dịch chiết củ riềng ngoài tác dụng ức chế vi phương trình hồi qui tuyến tính (Y = 52,21*X + khuẩn còn có tác dụng kích thích hệ miễn dịch 1,82 có hệ số xác định R2 = 99,4% ) được xây của tôm. Trong khi dịch chiết Khổ sâm và Đơn dựng dựa vào kết quả của thí nghiệm thăm dò đã chấu chấu chưa có báo cáo nào được thực hiện được thực hiện trước đó. Liều gây nhiễm phòng để đánh giá tác dụng trên đối tượng thuỷ sản. bệnh của nghiên cứu này gần tương đương với Đối với phòng bệnh qua nước nuôi, tôm được liều gây nhiễm của một số nghiên cứu khác đã ngâm với hai loại dịch chiết Khổ sâm và Đơn báo cáo như là liều cảm nhiễm ngâm trực tiếp 1 châu chấu trước gây nhiễm 1 giờ và sau gây x 106 CFU/ml trong phòng bệnh AHPND ở tôm nhiễm 24 giờ với nồng độ 15 ppm (0,45 g/30 giống (P15) bằng dịch chiết tảo đỏ (Boonsri & lít nước) và 20 ppm (0,6 g/30 lít nước). Việc ctv., 2016) hoặc là liều cảm nhiễm ngâm trực ngâm lặp lại dịch chiết nhằm mục đích là tăng tiếp 2,2 x 106 CFU/ml cho phòng bệnh AHPND hiệu quả ức chế đối với vi khuẩn. Tỷ lệ sống ở tôm thẻ 1,3 g bằng Progen-S (Jintasatapor & trung bình sau 9 ngày thí nghiệm phòng bệnh ctv., 2017). bằng dịch chiết Khổ sâm lần lượt là 51,7% Thí nghiệm phòng bệnh được thực hiện để ± 2,9% và 61,7% ± 2,9%, còn tỷ lệ sống của đánh giá khả năng của hai dịch chiết Khổ sâm và phòng bệnh bằng dịch chiết Đơn châu chấu lần Đơn châu chấu bằng cách trộn vào thức ăn hoặc lượt là 51,7% ± 2,9% và 61,7% ± 2,9%. Ở thí ngâm trực tiếp vào nước. Tôm được cho ăn hai nghiệm phòng bệnh bằng dịch chiết qua đường loại dịch chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu trước nước nuôi có thời gian kết thúc lâu so với và sau gây nhiễm bảy ngày với nồng độ 2% (20 phòng bệnh qua đường thức ăn là do thời gian 36 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II chết của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm kéo ở giáp xác mười chân (Lyon & Simkiss, 1984; dài hơn. Al-Mohanna & Nott, 1986; Vogt, 1993). Ngoài Cơ quan gan tuỵ cơ bản bao gồm các ống ra, tế bào B còn là nguồn enzyme giúp cho quá được phân nhánh và có các loại tế bào biểu trình tiêu hoá ngoại bào (Loizzi, 1971; Gibson mô như là tế bào mầm (E), tế bào sợi (F), tế & Barker, 1979; Caceci & ctv., 1988). Sự gia bào dự trữ (R), và tế bào tiết (B) xếp thành tăng của tế bào B giúp thuận lợi trong việc ống gan. Vì vậy, nó dễ dàng bị thay đổi cấu tổng hợp và bài tiếtcác enzyme tiêu hoá. Điều trúc của ống gan và các tế bào biểu mô khi này cũng giúp cho tôm thẻ chân trắng hấp thụ tiếp xúc các chất độc hoá học hay chất độc nhiều năng lượng từ thực phẩm ăn vào và làm sinh học (Bhavan & Geraldin, 2000). Một số tăng mức độ trao đổi chất để giữ chức năng cơ nghiên cứu báo cáo rằng cơ quan gan tuỵ được thể trở nên bình thường (Li E. & ctv., 2008). biết là rất nhạy với các loại thức ăn khác nhau, AHPND bị gây ra bởi Vibrio các chất gây ô nhiễm nước, và các chất có tính parahaemolyticus (Tran & ctv., 2013). Ở mức độ độc. Nó thường được dùng để kiểm tra ảnh mô học, đặc tính chẩn đoán chính của AHPND hưởng của các chất độc khác nhau (Bautista là sự bong tróc ồ ạt của các tế bào biểu mô của & ctv., 1994; Wu J. P. & ctv., 2008). Dựa vào ống gan, mà được bắt đầu từ trung tâm của cơ yếu tố trên, trước khi thực hiện các thí nghiệm quan gan tuỵ sau đó lan ra ngoài đến vùng tế phòng bệnh bằng dịch chiết, nghiên cứu này bào E. Sự bong tróc này làm giảm sự biệt hoá đã tiến hành thử nghiệm độc tính đối với tôm các tế bào biểu mô có chứ năng như tế bào B, F và gan tuỵ được thu mẫu và kiểm tra mô học. và R (Thitamadee & ctv., 2016). Kết quả kiểm Đối với tôm thí nghiệm phòng bệnh được cho tra mô bệnh học ở thí nghiệm gây nhiễm với ăn dịch chiết với liều 20 g/kg thức ăn và 40 g/ Vibrio parahaemolyticus chủng ST8T và phòng kg thức ăn trong suốt 7 ngày, kết quả ghi nhận bệnh bằng dịch chiết trộn vào thức ăn cho thấy cho thấy không tôm nào bị chết sau khi ăn dịch gan tuỵ của tôm ở đối chứng dương có biểu hiện chiết. Đối với tôm được ngâm với các dịch bong tróc các tế bào biểu mô phù hợp với đặc chiết Khổ sâm hoặc Đơn châu chấu ở nồng độ tính của bệnh AHPND (Tran & ctv., 2013; Joshi 20 ppm và 40 ppm cũng không phát hiện tôm & ctv., 2014; Thitamadee & ctv., 2016). Trong chết sau 9 ngày. Phân tích mẫu mô học cho khi gan tuỵ của tôm được cho ăn thức ăn có trộn thấy, gan tuỵ của tôm ở tất cả các nghiệm thức dịch chiết Khổ sâm hoặc Đơn châu chấu với liều thí nghiệm có biểu hiện cấu trúc mô học bình 4% xuất hiện nhiều tế bào B. Kết quả này phù thường như được thấy ở các loài tôm (Bell & hợp với kết quả mô học của nghiên cứu phòng Lightner, 1988; Caceci & ctv., 1988; Lightner AHPND bằng dịch chiết Protein thô từ tảo đỏ & ctv., 1996; Bhavan & Geraldine, 2000). Ở với kết quả tế bào B xuất hiện nhiều ở gan tôm hai nhóm ngâm dịch chiết Khổ sâm hoặc Đơn của các nghiệm thức được cho ăn dịch chiết châu chấu với nồng độ 40 ppm, các tế bào biểu (Boonsri & ctv., 2016). mô của ống gan tuỵ được biệt hoá thành nhiều V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT tế bào B và một số ít tế bào R. Trong khi đó, ở nhóm đối chứng, gan tuỵ có nhiều cả tế bào B 5.1. Kết luận và tế bào R. Điều này có thể nói rằng các dịch Dựa vào các kết quả trên, hai dịch chiết chiết Khổ sâm và Đơn châu chấu không gây này đã được chứng minh là có hiệu quả phòng độc đối với tôm ngay cả ở nồng độ 40 ppm, các bệnh qua đường thức ăn với liều 2% (20 g dịch dịch chiết này còn kích thích miễn dịch cho các chiết/kg thức ăn) và hiệu quả phòng bệnh qua tế bào biểu mô của ống gan tuỵ của tôm biệt đường nước nuôi với nồng độ 20 ppm. Vì vậy, hoá nhiều tế bào B. Tế bào B có liên quan đến hai loại dịch chiết này có thể được dùng như sự hấp thu chất lỏng và các phân tử nhỏ bên là biện pháp thay thế kháng sinh cho phòng trong ống gan, đây là một đặc tính của tế bào B AHPND gây ra bởi V. parahaemolyticus trên TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 37
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei trong chống-dịch-bệnh/doc-tin/008389/2017-07-11/ điều kiện phòng thí nghiệm. chu-dong-phong-tri-dich-benh-tren-tom-nuoi. Thời gian truy cập 11/7/2017. 5.2. Đề xuất Trương Hồng Việt, Ajaree Nilawongse, Kallaya Mặc dù kết quả cho thấy hai dịch chiết Sritunyalucksana, Timothy W. Flegel, Siripong Khổ sâm và Đơn châu chấu có hiệu quả tốt Thitamadee, 2017. Nghiên cứu vi khuẩn không trong phòng AHPND qua đường ăn và nước thuộc nhóm Vibrio có khả năng kết hợp với nuôi, chúng tôi đề nghị cần thử nghiệm hiệu quả Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan của nó ở qui mô nông hộ. tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan. ISSN 1859-1159. Tạp chí Nghề cá Sông cửu long. Số 9-Tháng 2/2017. 26-42. LỜI CẢM ƠN Tài liệu tiếng Anh Đề tài này được thực hiện từ kinh phí của Al-Mohanna, S.Y., Nott, J.A., (1986). B-cells hợp đồng đề tài nhánh số 02/HĐ-TS với Viện and digestion in the hepatopancreas of Hoá học và các Hợp chất thiên nhiên. Penaeussemisulcatus (Crustacea, Decapoda). J. Mar. Biol. Assoc. U. K, 66, 403–414. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bautista, M.N., Lavilla-Pitogo, C., Subosa, P.F., Tài liệu tiếng Việt Begino, E.T. (1994). Aflatoxin B1 contamination of shrimp feeds and its effect on growth and Hà Ký, 1995. Phòng và trị bệnh cho tôm cá. Bệnh hepatopancreas of preadult Penaeus monodon. học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. J. Sci. Food Agricult. 65, 5–11. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những Cây thuốc và Vị thuốc Bell, T.A., Lightner, D.V. (1988). A Handbook Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. of Normal Penaeid Shrimp Histology. World Nguyễn Ngọc Phước, Phạm Thị Phương Lan, Aquaculture Society, Baton Rouge, LA. Nguyễn Quang Linh, Kishio Hatai, 2007. Bhavan, P.S., Geraldine, P. (2000). Histopathology Nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết of the hepatopancreas and gills of the prawn lá Trầu (Piper betle. L). Tạp chí Thủy Sản số Macrobrachium malcolmsonii exposed to 4/2007. endosulfan. Aquat. Toxicol. 50, 331–339. Bùi Quang Tề & Lê Xuân Thành, 2006. Kết quả Boonsri N., Rudtanatip T., Withyachumnarnkul B., nghiên cứu chế phẩm (VTS1-C) (VTS1 - T) & Wongprasert K. (2016). Protein extract from tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm red seaweed Gracilaria fisheri prevents acute sú và cá tra. hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) Tổng cục Thuỷ sản, 2015. https://tongcucthuysan. infection in shrimp.J Appl Phycol. DOI 10.1007/ gov.vn/vi-vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-phòng- s10811-016-0969-2. chống-dịch-bệnh/doc-tin/001048/2017-01-22/ Caceci, T., Neck, K.F., Lewis, D.H., Sis, R.F. hoi-nghi-tong-ket-cong-tac-phong-chong-dich- (1988). Ultrastructure of the hepatopancreas of benh-gia-suc-gia-cam-va-thuy-san-nam-2014. the Pacific white. shrimp, Penaeus vannamei Thời gian truy cập 22/1/2015. (Crustacea: Decapoda). J. Mar. Biol. Assoc. U. Tổng Cục Thuỷ sản, 2017. https://tongcucthuysan. K. 68, 323–327. gov.vn/vi-vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-phòng- Citarasu, T. (2010). Herbal biomedicines: a chống-dịch-bệnh/doc-tin/007053/2017-02-22/ new opportunity for aquaculture industry. tang-cuong-kiem-soat-dich-benh-tren-nuoi- Aquaculture International, 18, 403-414. tom-nuoc-lo. Thời gian truy cập (22/2/2017). Chaweepack, T., Muenthaisong, B., Chaweepack, Tổng Cục Thuỷ sản, 2017. https://tongcucthuysan. S.,and Kamei, K. (2015a). The Potential of gov.vn/vi-vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-phòng- Galangal (Alpinia galanga Linn) Extract chống-dịch-bệnh/doc-tin/007095/2017-02-28/ against the Pathogens that Cause White Feces tinh-hinh-dich-benh-tren-tom-tai-mot-so-tinh- Syndrome and Acute Hepatopancreatic Necrosis dong-bang-song-cuu-long-va-bien-phap-ngan- Disease (AHPND) in Pacific White Shrimp chan. Thời gian truy cập 28/02/2017. (Litopenaeus vannamei). International Journal Tổng Cục Thuỷ sản, 2017. https://tongcucthuysan. of Biology; Vol. 7, No. 3. gov.vn/vi-vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-phòng- 38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Chaweepack, T., Chaweepack, S., Muenthaisong, and Disease Challenge Against Vibrio B., Ruangpan, L., Nagata, K., & Kamei, K. parahaemolyticus. Aquafeed Nutrient and (2015b). Effect of galangal (Alpinia galanga Better Feeding Management in Aquaculture. Linn) extract on the expression of immune- 9th Regional Aquafeed Forum. 39-40. related genes and Vibrio harveyi resistance in Joshi, J., Srisala, J., Truong, V. H., Chen, I.- Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). T., Nuangsaeng, B., Suthienkul, O., … Aquacult Int., 23(1), 385-399. Thitamadee, S. (2014). Variation in Vibrio De La Peña L.D., Cabillon N.A., Catedral D.D., parahaemolyticus isolates from a single Thai Amar E.C., Usero R.C., Mono Tilla W.D., shrimp farm experiencing an outbreak of acute Calpe A.T., Fernandez D.D. & Saloma C.P. hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). (2015). Acute hepatopancreatic necrosis disease Aquaculture, 428-429, 297–302. (AHPND) outbreaks in Penaeus vannameiand Li E., Chen L., Zeng C., Yu N., Xiong Z., Chen P. monodon cultured in the Philippines. Dis. X., G. Qin J.G. (2008). Comparison of Aquat. Org., 116, 251–254. digestive and antioxidant enzymes activities, De Pooter, H. L., Omar, M. N., Coolaset, B. A., haemolymph oxyhemocyanin contents and & Schamp, N. M. (1985). The essential oil hepatopancreas histology of white shrimp, of greater galanga (Alpinia galanga) from Litopenaeusvannamei, at various salinities. Malaysia. Phytochemistry., 24, 93-96. http:// Aquaculture 274 (2008) 80–86. dx.doi.org/10.1016/S0031-9422 (00)80814-6. Lightner, D. V., Redman, R. M., Pantoja, C. R., De Schryver, P., Defoirdt, T., Sorgeloos, P. (2014). Tang, K. F. J., Noble, B. L., Schofield, P., Early mortality syndrome outbreaks: a microbial Mohney L. L., Nunan L. M., Navarro, S. A. management issue in shrimp farming? PLoS (2012). Historic emergence, impact and current Pathog. 10: e1003919. status of shrimp pathogens in the Americas. Despres J. P., Prudhomme D., Pouliot M. C., Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), Tremblay A., Bouchard C. (1991). Estimation 174–83. of deep abdominal fat in men. Am J Clin Nutr; Lightner, D.V., Hasson, K.W., White, B.L., 54-471-7. Printed in USA. © 1991 American Redman, R.M. (1996). Chronic toxicityand Society for Clinical Nutrition. histopathological studies with Benlate, Flegel, T. W. (2012). Historic emergence, impact a commercial grade of benomyl, in and current status of shrimp pathogens in Asia. Penaeusvannamei (Crustacea: Decapoda). Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), Aquat. Toxicol. 34, 105–118. 166–73. Loizzi, R. F. (1971). Interpretation of crayfish Gibson, R., and P. L. Barker. (1979). The decapod hepatopancreatic function based on fine hepatopancreas. Oceanography and Marine structural analysis of epithelial cell lines and Biology 17: 285-346. muscle network. Zeitschrift fuer Zellforschung und mikroscopische Anatomic 113: 420-440. Han, J.E., Tang, K.F.J., Tran, L.H., Lightner, D.V. (2015). Photorhabdus insect-related Mooney, A. (2012). An emerging shrimp disease (pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? parahaemolyticus, the causative agent of acute Available at: http:// aquatichealth.net/ hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of issues/38607 (accessed 24 Feb 2012). shrimp. Dis Aquat Org 113:33−40 NACA (2012). Final Report Asia Pacific Emergency Hong, X. P., Xu, D., Zhuo, Y., Liu, H. Q. and Lu, regional Consultation on the Emerging Shrimp L. Q. (2016). Identification and pathogenicity of Disease: Early Mortality Syndrome (EMS)/ Vibrio parahaemolyticus isolates and immune Acute Hepatopancreatic Necrosis syndrome responses of Penaeus (Litopenaeus) vannamei (AHPNS). Network of Aquaculture Centres in (Boone). Journal of fish Diseases. doi:10.1111/ Asia-Pacific. jfd.12441. Nunan L., Lightner D., Pantoja C. & Gomez- Jintasatapor O., Chumkam S., and Songsiritanaphat Jimenez S. (2014). Detection of acute P. (2017). Effect of Progen-S in Fishmeal hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Reduction Diet on White Shrimp, Litopeanaeus Mexico. Dis. Aquat. Org., 111, 81–86. vannamei, Growth performance, Immunity Oonmetta-aree, J., Suzuki, T., Gasaluck, P., TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017 39
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II & Eumkeb., G. (2006). Antimicrobial and Vogt G. (1993). Differentiation of B-cells in the action of galangal (Alpinia galanga Linn.) hepatopancreas of the prawn Penaeusmonodon. on Staphylococus aureus. Food Science and Acta Zool 74: 51-60. Technology., 39, 959-965. Vuddhakul, V., Bhoopong, P., Hayeebilan, F., & Pandey, G., Sharma, M., and Mandloi, A. K. Subhadhirasakul, S. (2007). Inhibitory activity (2012). Medicinal plants useful in fish diseases. of Thai condiments on pandemic strain of Plant Archives, 2(1), 1-4. Vibrio parahaemolyticus. Food Microbiology., Stephen C. E. (1977). ‘‘Methods for Calculating 24, 413-418. http://dx.doi.org/10.1016/j. an LC50’’ Aquatic Toxicology and Hazard fm.2006.04.010 Evaluation, ASTM STP 634, American Society Wu J.P.,Chen H.H., Huang D.J. (2008). of Testing and Materials, Philadelphia, pp 65– Histopathological and biochemical evidence 84. of hepatopancreatic toxicity caused by Sun H., Fang WS., Wang W.Z., and Hu C. (2006). cadmium and zinc in the white shrimp, Structure activity relationships of oleanane and Litopenaeusvannamei. Chemosphere 73. 1019– ursane type triterpenoids. Botanical Studies 47: 1026. 339-368. Yang Y. T., Chen I. T., Lee C. T., et al. (2014). Draft Syahidah, A. (2014). Status and potential of herbal genome sequences of four strains of Vibrio applications in aquaculture. Iranian Journal of parahaemolyticus, three of which cause early Fisheries Sciences, 14, 27-44. mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp in China and Thitamadee S, Prachumwat A, Srisala J, Jaroenlak Thailand. Genome Announc; 2:e00816–14. P, Salachan PV, Sritunyalucksana K. (2016). Review of current disease threats for cultivated Yin, G., L. Ardo, Z. Jeney, P. Xu and G. Jeney. (2008). Penaeid shrimp in Asia. Aquaculture.; 452: 69– Chineseherbs (Lonicera japonica and Ganoderma 87. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.10.028. lucidum) enhance nonspecific immune response of tilapia, Oreochromisniloticus and Tran, L., Nunan, L., Redman, R.M., Mohney, L.L., protection against Aeromonashydrophila. In: Pantoja, C.R., Fitzsimmons, K., Lightner, D.V. Diseases in Asian Aquaculture VI, FishHealth (2013). Determination of the infectious nature Section (Bondad-Reantaso, M.G., Mohan, of the agent of acute hepatopancreatic necrosis C.V.,CrumLish, M. and Subasinghe, R. P. eds.). syndrome affecting Penaeid shrimp. Dis Aquat Asian FisheriesSociety, Manila, Philippines, Org 105:45−55 269-282. 40 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 10 - THÁNG 12/2017
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II THE EFFECTS OF Croton tonkinensis AND Aralia armata EXTRACTS ON PREVENTION AND TREATMENT OF ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE IN WHITE-LEG SHRIMP Penaeus vannamei UNDER LABORATORY CONDITIONS Truong Hong Viet1*, Do Thi Cam Hong1, Vu Thien An1, Tran Bao Ngoc2, Nguyen Tran Gia Bao2, Tran Minh Trung1 ABSTRACT Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) was first emerged in China in 2009, and was spread to Vietnam in 2010. It has caused a negative impact on the aquaculture industry in Vietnam with an economic loss estimated at 7.2 million USD in 2012. The aim of this study is to evaluate the effects of Crotonton kinensis and Aralia armata extracts on prevention and treatment of AHPND disease caused by Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) in white-leg shrimp (Penaeus vannamei) by experimental challenge test. Two experiments were conducted: (1) The two extracts were individually mixed with shrimp diet at two concentrations including 2% (20g extracts/kg diet) and 4% (40g extracts/kg diet); shrimp were fed during 7 days before and after challenge test with VPAHPND. (2) The two extracts were separately soaked into culture water at two concentrations including 15 ppm (0.45g extracts/tank/30 litres of water) and 20 ppm (0.6g extracts/tank/30 litres of water); shrimps were immersed in these extracts in 1 hour before challenge test with VPAHPND, and were immersed one more time after 24 hours. The results of experiment 1 showed that shrimp survival rates on the last day (day 7) in all extract treated groups were greater than 60%, and it was significantly different (P