Hoạt tính probiotic, đặc điểm phân loại và điều kiện nuôi thích hợp của chủng Bacillus pumilus B3.10.2 phân lập từ tôm hùm bông

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br /> <br /> HOẠT TÍNH PROBIOTIC, ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI VÀ ĐIỀU KIỆN<br /> NUÔI THÍCH HỢP CỦA CHỦNG BACILLUS PUMILUS B3.10.2<br /> PHÂN LẬP TỪ TÔM HÙM BÔNG<br /> THE PROBIOTIC ACTIVITY, IDENTIFICATION AND APPROPRIATE CULTURE<br /> CONDITIONS OF BACILLUS PUMILUS B3.10.2 ISOLATED<br /> FROM THE ORNATE SPINY LOBSTER<br /> Trần Vũ Đình Nguyên1, Nguyễn Văn Duy2, Vũ Ngọc Bội3<br /> Ngày nhận bài: 30/11/2012; Ngày phản biện thông qua: 15/7/2013; Ngày duyệt đăng: 10/3/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Vấn đề dịch bệnh do vi sinh vật gây ra trong những năm gần đây gây thiệt hại nặng nề đến nghề nuôi trồng thủy sản.<br /> Việc sử dụng các chế phẩm probiotic để kiểm soát tác nhân gây bệnh được xem là một hướng thay thế cho điều trị kháng<br /> sinh truyền thống. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định hoạt tính probiotic, định danh và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy<br /> thích hợp của chủng probiotic tiềm năng trong số 4 chủng Bacillus (B3.7.1, B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) phân lập từ tôm hùm<br /> bông (Panulirus ornatus). Kết quả cho thấy cả 4 chủng đều có hoạt tính kháng khuẩn và 3 chủng trong đó (B3.7.4, B3.10.1,<br /> B3.10.2) có khả năng sinh protease ngoại bào. Chủng B3.10.2 đã được định danh là Bacillus pumilus có khả năng kháng<br /> khuẩn mạnh nhất với chủng Vibrio owensii DY05 mới được chứng minh gây bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông. Điều kiện<br /> nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng này là môi trường TSB cải tiến chứa rỉ đường là nguồn cacbon, pepton là<br /> nguồn nitơ, nồng độ muối 1-3%, pH 8, và ở nhiệt độ 34-37oC. Kết quả này đóng góp cơ sở khoa học trong xây dựng quy<br /> trình sản xuất chế phẩm probiotic ở mức độ công nghiệp và mở ra tiềm năng ứng dụng của chủng này trong nuôi trồng hải<br /> sản nói chung và nuôi tôm hùm nói riêng.<br /> Từ khóa: Bacillus, Bacillus pumilus, Panulirus ornatus, Probiotic, Protease<br /> <br /> ABSTRACT<br /> The disease problems due to microbial infection in recent years caused a heavy loss in aquaculture. The use of<br /> probiotics to control pathogens is suggested to replace of traditional antibiotic treatment. The aim of the study is to<br /> assess the probiotic activity, identification and the appropriate culture conditions of the potential probiotic strain out of four<br /> Bacillus isolates from the ornate spiny lobster (Panulirus ornatus). The results showed that all these four strains were found<br /> to have their antibacterial activity and three of them (B3.7.4, B3.10.1, B3.10.2) expressed extracellular protease activity.<br /> The strain B3.10.2 was identified as Bacillus pumilus with the strongest inhibitory effect against Vibrio owensii DY05, a<br /> serious pathogen causing epizootics in the ornate spiny lobster. The appropriate culture conditions for the growth of this<br /> strain include the modified TSB medium with molasses as a carbon source, peptone as a nitrogen source, salinity from 1<br /> to 3%, pH at 8, and the temperature of 34-37oC. The research contributes into the development of the protocol for probiotic<br /> production in industry scale and opens the potential applications of this probiotic strain for marine aquaculture in general<br /> and lobster culture in particular.<br /> Keywords: Bacillus, Bacillus pumilus, Panulirus ornatus, Probiotics, Protease<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Nghề nuôi tôm hùm lồng ở Việt Nam được bắt<br /> đầu từ năm 1992, và phát triển nhanh đến năm 2000<br /> với đối tượng nuôi chính, quan trọng là tôm hùm bông<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> (Panulirus ornatus). Tuy nhiên, nghề nuôi tôm hùm<br /> lồng đã chịu tổn thất kinh tế nặng nề khi dịch bệnh<br /> xuất hiện và có xu hướng giảm sút cả về năng suất và<br /> sản lượng trong những năm gần đây (Lại Văn Hùng,<br /> <br /> Trần Vũ Đình Nguyên: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 – Trường Đại học Nha Trang<br /> TS. Nguyễn Văn Duy, 3 TS. Vũ Ngọc Bội: Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 177<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Lê Anh Tuấn, 2009). Các nghiên cứu về bệnh trên<br /> giáp xác nói chung và trên tôm hùm nói riêng, cho<br /> thấy một trong những tác nhân gây bệnh chính<br /> và nguy hiểm nhất là các vi khuẩn Vibrio bao gồm<br /> V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. anguillarum,<br /> V. alginolyticus,… (Webster et al., 2006; Raissy et al.,<br /> 2011). Chúng thường là những tác nhân gây bệnh cơ<br /> hội, có thể gây chết từ rải rác đến hàng loạt (Shields,<br /> 2011). Chủng vi khuẩn Vibrio owensii DY05 mới<br /> đây đã được phân lập từ một số động vật giáp xác<br /> (Cano-Gómez et al., 2010) và được chứng minh là<br /> tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông<br /> (Panulirus ornatus) giai đoạn ấu trùng nuôi tại<br /> Australia (Goulden et al., 2012) và giai đoạn con non<br /> ở Việt Nam (Nguyễn Thị Thanh Xuân và cs, 2013).<br /> Võ Văn Nha (2004) khi nghiên cứu một số<br /> bệnh thường gặp trên tôm hùm bông tại vùng biển<br /> Khánh Hòa và Phú Yên đã phát hiện trên tôm hùm<br /> bị bệnh đỏ thân có mặt của nhiều vi khuẩn thuộc chi<br /> Vibrio mà trong đó chủ yếu là V. parahaemolyticus.<br /> Trên tôm nước lợ, hội chứng hoại tử gan tụy cấp<br /> đã xuất hiện tại các vùng nuôi tôm ở đồng bằng<br /> sông Cửu Long từ năm 2010, sau đó lan ra miền<br /> Trung và một số tỉnh ven biển phía Bắc. Theo báo<br /> cáo của Vụ Nuôi trồng thủy sản (2012), sự hiện diện<br /> của vi khuẩn Vibrio và phage dẫn đến chết sớm và<br /> hội chứng hoại tử gan tụy ở tôm nuôi. Trong đó,<br /> 53,8% mẫu tôm giống thu ở các trại giống khu<br /> vực miền Trung nhiễm Vibrio, phổ biến là các loài<br /> V. parahaemolyticus, V. harveyi và V. vulnificus.<br /> Để phòng trừ dịch bệnh do vi khuẩn gây ra, sử<br /> dụng kháng sinh vẫn là biện pháp chính. Tuy nhiên,<br /> việc sử dụng kháng sinh quá liều đã làm giảm hiệu<br /> quả chữa bệnh trong nuôi trồng thủy sản, làm ô nhiễm<br /> môi trường nuôi và gây ảnh hưởng lớn đến chất<br /> lượng sản phẩm do việc tồn dư kháng sinh, hay tạo<br /> ra các chủng kháng kháng sinh (Zhou et al., 2009).<br /> Các plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh<br /> cũng có thể truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản<br /> sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người<br /> (Sahu et al., 2008). Chẳng hạn, vụ dịch tiêu chảy lớn<br /> do vi khuẩn Vibrio cholera gây ra ở Ecuador từ năm<br /> 1991-1994 đã bắt đầu từ các ngư dân nuôi tôm. Ban<br /> đầu các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm và<br /> không gây bệnh ở người nhưng sau đó do cơ chế<br /> chuyển gen ngang của các gen kháng kháng sinh<br /> trên plasmid mà các chủng này đã gây ra dịch bệnh<br /> lớn trên người (Weber et al., 1994).<br /> Do đó việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc<br /> vi khuẩn có lợi nhằm kiểm soát mầm bệnh đang ngày<br /> càng được xem như là một giải pháp thay thế cho<br /> điều trị kháng sinh (Sahu et al., 2008). Chế phẩm<br /> probiotic là tập hợp một hoặc nhiều chủng vi khuẩn<br /> sống, được bổ sung vào thức ăn nhằm tác động<br /> <br /> 178 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 1/2014<br /> tích cực đến sức khỏe vật nuôi, bao gồm khả năng<br /> ức chế các vi khuẩn gây hại, kích thích hệ tiêu hóa<br /> đường ruột thông qua hoạt động của các enzyme<br /> thủy phân (protease, amylase,…), hoặc tăng cường<br /> đáp ứng miễn dịch (Zhou et al., 2009). Các chế phẩm<br /> sinh học hiện nay thường chứa các chủng có lợi như:<br /> Lactobacilus spp., Bacillus spp., nấm men,… Trong<br /> đó sử dụng chủng Bacillus trong nuôi trồng thủy<br /> sản hiện là một hướng rất được quan tâm nghiên<br /> cứu (Ravi el al., 2007). Tất cả các loài Bacillus đều<br /> có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ<br /> (như protein) khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại<br /> bào. Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có<br /> khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng khuẩn<br /> như insulin và subtilin từ B. subtilis, bacteriocin từ<br /> B. licheniformis,… (Hill et al., 2009).<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 4<br /> chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm hùm bông (đã<br /> khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn) để xác định<br /> hoạt tính probiotic in vitro và điều kiện nuôi cấy thích<br /> hợp của chúng nhằm sản xuất chế phẩm vi sinh<br /> phục vụ nuôi tôm hùm và các đối tượng nuôi hải<br /> sản khác.<br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Chủng vi sinh vật<br /> Các chủng vi khuẩn probiotic tiềm năng<br /> Bacillus spp. (B3.10.1, B3.10.2, B3.7.1, B3.7.4)<br /> phân lập từ ruột tôm hùm bông, chủng chuẩn sinh<br /> protease Bacillus sp. L5’, và các chủng vi sinh vật<br /> chỉ thị Vibrio spp. (V1.1 và V3.3) được lấy từ bộ<br /> sưu tập vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học<br /> và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang. Chủng<br /> Vibrio owensii DY05 là chủng vi khuẩn đã được<br /> chứng minh gây bệnh trên ấu trùng tôm hùm bông<br /> (Goulden et al., 2012a), được cung cấp từ Viện Hải<br /> dương học Australia (AIMS). Các chủng probiotic<br /> tiềm năng và chủng chỉ thị được nuôi cấy trên môi<br /> trường TSB (Tryptic Soy Borth) (HiMedia, Ấn Độ), có<br /> bổ sung 1,5% NaCl và bảo quản trong 20% glycerol<br /> ở -800C theo mô tả của Trần Linh Thước (2007).<br /> 2. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào<br /> Hoạt tính sinh protease ngoại bào được xác định<br /> theo phương pháp đo đường kính phân giải casein.<br /> Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180 vòng/phút ở 300C<br /> trong môi trường dịch thể TSB, sau 24h tiến hành ly<br /> tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15<br /> phút, thu dịch và nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trên đĩa<br /> petri chứa môi trường cơ chất có casein; Để vào tủ<br /> ấm 300C trong 24 giờ; Đo đường kính vòng phân giải<br /> casein. Hoạt tính enzyme được xác định theo công<br /> thức: D-d, trong đó D là đường kính vòng phân giải<br /> + đường kính lỗ khoan, và d là đường kính lỗ khoan.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> 3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn<br /> Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng<br /> phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa. Các chủng<br /> vi khuẩn đã phân lập được nuôi cấy trong môi trường<br /> TSB, bổ sung 1,5% NaCl, trong 14-16 giờ. Sau đó dịch<br /> nuôi cấy ở mật độ tế bào khoảng 105 CFU/ml được ly<br /> tâm ở 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C, thu dịch<br /> nổi. Lấy 80 μl dung dịch này nhỏ vào mỗi giếng của<br /> đĩa thạch đã trang đều vi khuẩn chỉ thị (Vibrio sp. V1.1<br /> hoặc Vibrio sp. V3.3) sau khi nuôi trên môi trường TSB<br /> tới mật độ 104 CFU/ml. Sử dụng methylene blue 0,4%<br /> làm chất chỉ thị màu trước khi đổ đĩa để tăng độ tương<br /> phản của vòng kháng khuẩn. Sau đó, đĩa được ủ ở<br /> 370C trong 24-48 giờ và xác định đường kính vòng<br /> kháng khuẩn (Ravi et al., 2007).<br /> 4. Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho<br /> sinh trưởng<br /> Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi<br /> trên môi trường TSB tại pH 7,3 ở nhiệt độ 37oC. Để<br /> xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp, lần lượt các<br /> thông số: nguồn cacbon (glucose, rỉ đường, tinh bột<br /> bắp, tinh bột sắn), nguồn nitơ (bột mì, amoni sulfat,<br /> pepton), nồng độ muối (0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%),<br /> pH môi trường (pH 5, 6, 7, 8, 9) và nhiệt độ (28, 31,<br /> 34, 37, 40 (oC)) được thay đổi trong khi các thông số<br /> còn lại được cố định và cải tiến dần. Sau 3 giờ nuôi,<br /> khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định<br /> bằng phép đo mật độ quang của dịch nuôi tại bước<br /> sóng 540 nm (OD540) trên máy đo quang phổ Cary<br /> 100 Bio (Varian, Mỹ).<br /> 5. Định danh vi khuẩn Bacillus<br /> Vi khuẩn Bacillus được định danh bằng cách<br /> kết hợp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và sử dụng<br /> bộ kít hóa sinh API 50CHB (BioMérieux, Pháp) dựa<br /> trên 49 phản ứng lên men đường và 12 thử nghiệm<br /> hoạt tính enzyme theo hướng dẫn của nhà sản xuất.<br /> Kết quả thử nghiệm hóa sinh được phân tích bằng<br /> phần mềm ApiWeb (BioMérieux, Pháp).<br /> Nhằm tách chiết DNA, dịch nuôi cấy vi khuẩn<br /> được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở<br /> 40C để thu tế bào (Luan et al., 2007). DNA tổng số<br /> được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic<br /> DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà<br /> sản xuất và sau đó bảo quản ở -200C. Đoạn gen<br /> 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ<br /> thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng<br /> hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau: 16S-27F<br /> 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ và<br /> 16S-1492R 5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3’<br /> (Luan et al., 2007). Phản ứng PCR được tiến hành<br /> trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng<br /> độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi<br /> (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM),<br /> <br /> Số 1/2014<br /> Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì<br /> nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở<br /> 940C trong 3 phút; 35 chu kì của 940C trong 1 phút,<br /> 500C trong 1 phút và 720C trong 1 phút; và cuối cùng<br /> kết thúc ở 720C trong 7 phút. Sản phẩm PCR được<br /> điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE<br /> 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và<br /> đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad).<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit<br /> PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn<br /> của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp<br /> cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc<br /> dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator<br /> v.3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi<br /> 16S-27F/16S-1492R theo chương trình nhiệt như<br /> sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây và 600C<br /> trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích<br /> trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700<br /> DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự<br /> được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit<br /> 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với<br /> các trình tự tương đồng trên Genbank bằng chương<br /> trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).<br /> 6. Xử lý thống kê<br /> Các thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích<br /> hợp được lặp lại ít nhất 3 lần. Các số liệu được xử<br /> lý thống kê bằng phân tích ANOVA trên phần mềm<br /> Microsoft EXCEL 2007.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Xác định hoạt tính probiotic của các chủng<br /> nghiên cứu<br /> 1.1. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào<br /> Kết quả từ bảng 1 và hình 1 cho thấy có 3/4<br /> chủng probiotic nghiên cứu (B3.7.4, B3.10.1,<br /> B3.10.2) có khả năng sinh protease ngoại bào.<br /> Trong đó chủng B3.7.4 sinh protease mạnh nhất<br /> (đường kính vòng phân giải casein > 20 mm) và<br /> mạnh hơn so với chủng L5’ là chủng chuẩn có khả<br /> năng sinh protease mạnh đã được nghiên cứu tại<br /> Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường<br /> Đại học Nha Trang.<br /> Kết quả nghiên cứu này tương tự với một nghiên<br /> cứu gần đây của Liu và cộng sự (2009) về chủng vi<br /> khuẩn Bacillus subtilis E20 có khả năng sinh protease<br /> mạnh. Chủng này đã được thử nghiệm bổ sung<br /> vào thức ăn của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus<br /> vannamei). Kết quả cho thấy tôm có bổ sung<br /> probiotic tiết ra enzyme tiêu hóa nhiều hơn do<br /> được hỗ trợ bởi hoạt động sinh protease của chủng<br /> probiotic so với tôm không được bổ sung probiotic,<br /> do vậy tôm có bổ sung probiotic đã tăng trưởng<br /> nhanh hơn (Liu et al., 2009).<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 179<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> Hình 1. Vòng phân giải casein từ dịch nuôi sau ly tâm của các chủng nghiên cứu<br /> <br /> Bảng 1. Hoạt tính sinh protease ngoại bào<br /> của các chủng nghiên cứu<br /> STT<br /> <br /> Chủng probiotic<br /> <br /> Đường kính vòng phân giải casein<br /> (D-d, mm)<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> <br /> B3.10.1<br /> B3.10.2<br /> B3.7.1<br /> B3.7.4<br /> L5’<br /> <br /> 16<br /> 16<br /> 21<br /> 18<br /> <br /> 1.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn<br /> Kết quả từ bảng 2 và hình 2 cho thấy các chủng<br /> probiotic nghiên cứu sau khi nuôi trên môi trường<br /> TSB đều có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng<br /> V1.1, V3.3 và DY05. Trong đó chủng probiotic<br /> B3.7.4 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với cả<br /> hai chủng V1.1 và V3.3 còn chủng B3.10.2 có hoạt<br /> tính kháng khuẩn mạnh nhất với chủng DY05.<br /> <br /> Vibrio owensii là loài vi khuẩn mới được công<br /> bố gần đây (Cano-Gómez et al., 2010) và chủng<br /> V. owensii DY05 đã được chỉ ra là tác nhân gây<br /> bệnh nguy hiểm trên tôm hùm bông trong giai đoạn<br /> ấu trùng ở Australia (Goulden et al., 2012a) và con<br /> non ở Việt Nam (Nguyễn Thị Thanh Xuân và cs,<br /> 2013). Trong một nghiên cứu mới đây, Goulden và<br /> cs (2012b) đã tuyển chọn được các chủng probiotic<br /> (Vibrio sp. PP05 và Pseudoalteromonas sp. PP107)<br /> có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng DY05 và<br /> cho thấy chúng có khả năng bảo vệ ấu trùng tôm<br /> hùm bông sau khi lây nhiễm với DY05. Trong nghiên<br /> cứu này, các chủng probiotic, nhất là chủng B3.10.2,<br /> cũng có khả năng kháng mạnh với DY05 trong điều<br /> kiện in vitro. Do vậy, cần tiếp tục có những thử<br /> nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả của các chủng<br /> probiotic tiềm năng này trên tôm hùm bông.<br /> <br /> Hình 2. Vòng kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V3.3<br /> <br /> Bảng 2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng<br /> probiotic nghiên cứu<br /> STT<br /> <br /> Chủng<br /> probiotic<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> B3.7.4<br /> B3.7.1<br /> B3.10.1<br /> B3.10.2<br /> <br /> Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm)<br /> Vibrio sp. V1.1 Vibrio sp. V3.3<br /> <br /> 10<br /> 10<br /> 8<br /> 9<br /> <br /> Vibrio owensii<br /> DY05<br /> <br /> 15<br /> 7<br /> 10<br /> 13<br /> <br /> 10<br /> 15<br /> 15<br /> 29<br /> <br /> 2. Định danh chủng B3.10.2<br /> Chủng B3.10.2 có khả năng kháng khuẩn mạnh<br /> nhất với chủng DY05, đồng thời có khả năng sinh<br /> protease ngoại bào tốt, nên đã được lựa chọn trước<br /> tiên để định danh nhằm kiểm tra tính an toàn của<br /> chủng. Việc định danh chủng B3.10.2 bằng cách<br /> <br /> 180 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> sử dụng kết hợp cả hai phương pháp: dựa trên đặc<br /> điểm kiểu gen (trình tự đoạn gen 16S rDNA) và kiểu<br /> hình (khả năng lên men đường và hoạt tính sinh<br /> enzyme).<br /> Kết quả giải trình tự 2 chiều đoạn gen 16S<br /> rDNA của chủng B3.10.2 đã thu được đoạn trình tự<br /> dài 1066 bp. Trình tự này đã được gửi lưu trữ trên<br /> Ngân hàng gen thế giới (GenBank) với mã số gen<br /> là KC894663. Kết quả phân tích BLAST từ bảng 3<br /> cho thấy, trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng<br /> B3.10.2 tương đồng 100% với một số chủng của<br /> loài Bacillus pumilus (các chủng T246, Nsic-2, V1,<br /> B12), B. altitudinis chủng T86, 100% với các chủng<br /> chuẩn (type strain) của các loài B. stratosphericus,<br /> B. aerophilus, B. altitudinis, và 99,6% với các chủng<br /> chuẩn của các loài B. pumilus và B. safensis.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 1/2014<br /> <br /> Bảng 3. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.10.2 với các trình tự tương đồng<br /> cao nhất trên GenBank bằng phương pháp BLAST<br /> Mã số gen<br /> <br /> Chủng vi khuẩn<br /> <br /> Tỉ lệ che phủ<br /> <br /> Mức ý nghĩa<br /> <br /> Độ tương đồng<br /> <br /> KC764989<br /> KC764971<br /> KC568200<br /> KC492092<br /> KC596004<br /> NR042336<br /> NR042339<br /> NR042337<br /> NR041794<br /> NR043242<br /> <br /> Bacillus pumilus T246<br /> Bacillus altitudinis T86<br /> Bacillus pumilus Nsic-2<br /> Bacillus pumilus V1<br /> Bacillus pumilus B12<br /> Bacillus stratosphericus 41KFT<br /> Bacillus aerophilus 28KT<br /> Bacillus altitudinis 41KF2bT<br /> Bacillus safensis FO-036bT<br /> Bacillus pumilus ATCC 7061T<br /> <br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> <br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> 0,0<br /> <br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 100%<br /> 99,6%<br /> 99,6%<br /> <br /> T: kí hiệu chủng chuẩn của loài (type strain)<br /> <br /> Kết quả phân tích kiểu hình dựa trên 49 phản<br /> ứng lên men đường và 12 thử nghiệm hoạt tính<br /> enzyme của chủng B3.10.2 đã xác nhận kết quả phân<br /> tích kiểu gen nói trên, trong đó những đặc điểm khác<br /> biệt về đặc điểm hóa sinh của chủng này so với 5 loài<br /> gần gũi về trình tự gen 16S rDNA đã được chỉ ra trong<br /> bảng 4. Phân tích trên phần mềm Apiweb (BioMérieux,<br /> Pháp) cho thấy chủng B3.10.2 được định danh là<br /> Bacillus pumilus với %ID = 99,9 và T = 0,49. Loài<br /> <br /> vi khuẩn này được coi là an toàn cho người và động<br /> vật. Chẳng hạn, chủng Bacillus pumilus GB34 đã<br /> được cấp phép sử dụng trong chế phẩm kháng nấm<br /> Rhizoctonia và Fusarium hại cây trồng, trong khi<br /> đó một chủng B. pumilus khác phân lập từ tôm sú<br /> (Penaeus monodon) đã cho thấy có tính chịu mặn<br /> tốt và khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của một<br /> số vi khuẩn biển gây bệnh như Vibrio alginolyticus,<br /> V. mimicus và V. harveyi (Hill et al., 2009).<br /> <br /> Bảng 4. Đặc điểm hóa sinh khác biệt của chủng B3.10.2 so với các loài Bacillus gần gũi nhất<br /> TT<br /> <br /> Phản<br /> ứng<br /> Tài liệu<br /> <br /> Cơ chất<br /> <br /> Chủng B3.10.2<br /> <br /> Bacillus<br /> pumilus<br /> <br /> B. safensis<br /> <br /> B.<br /> altitudinis<br /> <br /> B.<br /> aerophilus<br /> <br /> B. stratosphericus<br /> <br /> Nghiên cứu này<br /> <br /> Dữ liệu API<br /> <br /> Satomi et al.,<br /> 2006<br /> <br /> Shivaji et al.,<br /> 2006<br /> <br /> Shivaji et al.,<br /> 2006<br /> <br /> Shivaji et al.,<br /> 2006<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> +<br /> <br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> -<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> +<br /> <br /> +<br /> <br /> +<br /> <br /> A. Các phản ứng lên men đường<br /> GLY<br /> Glycerol<br /> DARA D-arabinose<br /> SBE<br /> L-sorbose<br /> RHA L-rhamnose<br /> DUL<br /> Dulcitol<br /> INO<br /> Inositol<br /> SOR D-sorbitol<br /> MDG Methyl-b-D-glucopyranoside<br /> NAG N-acetyl glucosamine<br /> CEL<br /> D-cellobiose<br /> MAL<br /> D-maltose<br /> MEL<br /> D-melibiose<br /> TRE<br /> D-trehalose<br /> INU<br /> Inulin<br /> RAF<br /> D-raffinose<br /> XLT<br /> Xylitol<br /> TUR<br /> D-turanose<br /> B. Các hoạt tính enzyme<br /> ADH L-arginine<br /> CIT<br /> Trisodium citrate<br /> URE Urea<br /> VP<br /> Sodium pyruvate<br /> GEL<br /> Gelatin<br /> <br /> w<br /> -<br /> <br /> +/+/-<br /> <br /> w<br /> <br /> +/-<br /> <br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> +<br /> +/+<br /> +/-<br /> <br /> w<br /> w<br /> <br /> +/+<br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> <br /> +<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 181<br /> <br />