Khả năng thủy phân Phytate và Cellulose trong bã sắn của chủng Bacillus subtilis C7

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2014<br /> <br /> KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br /> <br /> KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PHYTATE VÀ CELLULOSE TRONG BÃ SẮN<br /> CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS C7<br /> THE HYDROLYSIS ABILITY OF BACILLUS SUBTILIS C7 ON CELLULOSE<br /> AND PHYTATE IN CASSAVA RESIDUE<br /> <br /> Mạch Trần Phương Thảo1, Phạm Hồng Ngọc Thùy2, Nguyễn Minh Trí3<br /> Ngày nhận bài: 21/11/2013; Ngày phản biện thông qua: 21/02/2014; Ngày duyệt đăng: 13/8/2014<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Bacillus subtilis C7 có khả năng sinh các enzyme cellulase, phytase để thủy phân cellulose và phytate trong bã sắn.<br /> Nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân cellullose và phytate khi ủ bã sắn với chủng vi<br /> khuẩn Bacillus subtilis C7, từ đó xác định các thông số thích hợp cho quá trình ủ. Kết quả cho thấy thời gian ủ thích hợp là<br /> 48 giờ, nhiệt độ ủ 36 ± 10C, tỷ lệ nước: hỗn hợp là 2:1, tỷ lệ đậu nành bổ sung 10%. Hiệu suất thủy phân cellulose, phytate<br /> sau khi ủ lần lượt là 35,27 ± 2,81% và 39,48 ± 0,05%.<br /> Từ khóa: Bacillus subtilis C7, cellulose, phytate, bã sắn<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Bacillus subtilis C7 has ability to synthesize cellulase and phytase to hydrolyze cellulose and phytate in cassava<br /> residue. This research studied factors that were influential in the productivity of cellulose and phytate hydrolysis in<br /> cassava residue with Bacillus subtilis C7 to choose suitable factors for fermentation. Research results showed that suitable<br /> fermenting time was 48 hours, fermenting temperature was 36 ± 10C , the ratio of water and mixture was 2:1, the content<br /> of added soybean was 10%. The hydrolysis productivity of cellulose and phytate after the fermentation was 35,27 ± 2,81%<br /> and 39,48 ± 0,05%, respectively.<br /> Keywords: Bacillus subtilis C7, cellulose, phytate, cassava residue<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Sắn là cây lương thực quan trọng, được trồng<br /> ở rất nhiều nước trên thế giới. Tổ chức Nông Lương<br /> Liên hiệp quốc (FAO) xếp sắn là cây lương thực quan<br /> trọng ở các nước đang phát triển sau lúa gạo, ngô<br /> và lúa mì. Ở Việt Nam, cây sắn đã chuyển đổi vai<br /> trò từ cây lương thực thành cây công nghiệp với tốc<br /> độ cao, năng suất và sản lượng sắn đã tăng nhanh<br /> ở thập kỷ đầu của thế kỷ XXI. Hiện nay, sắn được<br /> sử dụng chính trong chế biến tinh bột sắn, sản xuất<br /> ethanol, thức ăn chăn nuôi và ăn tươi. Phần bã sắn<br /> còn lại từ quá trình sản xuất tinh bột là nguồn thức ăn<br /> tiềm năng cho gia súc, nhất là trong tình trạng hiện<br /> nay, nguồn thức ăn gia súc trong nước không cung<br /> ứng đủ, thường phải nhập từ nước ngoài, chi phí<br /> thức ăn ảnh hưởng lớn đến thu nhập các hộ gia đình,<br /> cơ sở chăn nuôi và ảnh hưởng đến sự phát triển<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> của ngành chăn nuôi. Tuy nhiên, trong bã sắn còn<br /> chứa thành phần khó hấp thu được là cellulose.<br /> Ngoài ra, trong bã sắn chứa axit phytic - yếu tố kháng<br /> dinh dưỡng - là chất có khả năng tạo phức chặt chẽ<br /> với các ion kim loại tạo nên các muối phytate (muối<br /> của axit phytic với Na+), phytin (muối của axit phytic<br /> với Ca2+, Mg2+) và các hợp chất khác như axit amin,<br /> protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản<br /> sự hấp thu các chất này vào cơ thể sống [8].<br /> Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra Bacillus spp. có khả<br /> năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, phytase [1],<br /> [2], [3], [10] để thủy phân cellulose và phytate. Do<br /> đó, việc nghiên cứu khả năng thủy phân cellulose<br /> và phytate trong bã sắn từ chủng Bacillus subtilis C7<br /> là cần thiết, góp phần nâng cao giá trị sử dụng, giá<br /> trị kinh tế cho bã sắn và hạn chế ô nhiễm môi trường<br /> do quá trình sản xuất tinh bột sắn gây ra.<br /> <br /> Mạch Trần Phương Thảo: Cao học Công nghệ sau thu hoạch 2011 - Trường Đại học Nha Trang<br /> ThS. Phạm Hồng Ngọc Thùy, 3 TS. Nguyễn Minh Trí: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> 180 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu<br /> Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 được lấy từ<br /> Phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Công nghệ thực<br /> phẩm, Trường Đại học Nha Trang.<br /> 2. Vật liệu nghiên cứu<br /> Bã sắn: Sau quá trình chế biến tinh bột sắn, bã<br /> sắn được thu nhận và sấy khô đến hàm lượng ẩm<br /> từ 5 - 6% để tiến hành nghiên cứu. Bã sắn mua từ<br /> Công ty Trách nhiệm hữu hạn Ánh Tuyết, Cam Hải<br /> Tây, Cam Lâm, Khánh Hòa.<br /> Đậu nành: Đậu nành được được tiến hành phân<br /> loại để loại bỏ các hạt bị hư hỏng, sâu mọt, sau đó<br /> tiến hành sấy khô đến hàm lượng ẩm khoảng 5 - 6%,<br /> xay nhỏ để sử dụng cho nghiên cứu. Đậu nành<br /> được mua tại chợ Đầm (Nha Trang, Khánh Hòa).<br /> Cám gạo: Sử dụng cám mới, không có dư vị<br /> chua hay đắng, không có mùi hôi. Độ ẩm của cám<br /> không quá 15%.<br /> Rỉ đường: Rỉ đường được mua ở Công ty Cổ<br /> phần Đường Ninh Hòa có độ ẩm 48%, bảo quản nơi<br /> khô ráo để sử dụng cho nghiên cứu.<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu<br /> 3.1. Phương pháp phân tích<br /> 3.1.1. Xác định hàm lượng cellulose theo TCVN<br /> 4329-93 [9]<br /> Nguyên tắc: Dùng dung dịch axit và kiềm với<br /> nồng độ nhất định thủy phân và tách khỏi mẫu thử<br /> các chất bột đường, protein, dầu mỡ, một phần<br /> hemicelulose và lignin còn lại là cellulose thô.<br /> 3.1.2. Xác định hàm lượng phytate theo phương<br /> pháp Wade [4]<br /> Nguyên tắc: Sử dụng dung dịch HCl 2,4% để<br /> chiết axit phytic ra khỏi mẫu, sau đó bổ sung dung<br /> dịch Wade (0,03% FeCl3 và 0,3% axit sulfosalisylic) để<br /> phản ứng với axit phytic, lượng dung dịch Wade không<br /> tác dụng với axit phytic được xác định bằng cách so<br /> màu ở bước sóng 500 nm, từ đó tính được hàm lượng<br /> axit phytic đã tác dụng với dung dịch Wade.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Số 3/2014<br /> 3.1.3. Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp<br /> đo đường kính vòng thủy phân [5], [6]<br /> Nguyên tắc: Cho enzyme tác dụng lên cơ chất<br /> đặc hiệu cho từng enzyme (carboxy metyl cellulose<br /> (CMC) đối với cellulase, phytate đối với phytase)<br /> trong môi trường thạch, cơ chất bị phân giải, độ đục<br /> của môi trường bị giảm, môi trường trở nên trong<br /> suốt. Độ lớn của vòng phân giải phản ánh mức độ<br /> hoạt động của enzyme.<br /> 3.2. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ<br /> đậu nành, nhiệt độ ủ, tỷ lệ nước bổ sung, thời gian<br /> và thành phần môi trường đến khả năng thủy phân<br /> cellulose và phytate<br /> Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ<br /> đậu nành, nhiệt độ ủ, tỷ lệ nước bổ sung, thời gian<br /> và thành phần môi trường đến quá trình thủy phân<br /> cellulose và phytate với khoảng biến thiên của các<br /> yếu tố như sau:<br /> - Tỷ lệ đậu nành: từ 0 đến 20% với bước nhảy<br /> là 5%.<br /> - Nhiệt độ ủ: khảo sát ở ba mức nhiệt độ là<br /> 24 ± 10C, 31 ± 10C, 36 ± 10C.<br /> - Tỷ lệ hỗn hợp (bã sắn + đậu nành): nước:<br /> 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5.<br /> - Thời gian: khảo sát thời gian ủ từ 0 giờ đến<br /> 72 giờ với bước nhảy là 12 giờ.<br /> - Thành phần môi trường: khảo sát bốn công<br /> thức môi trường:<br /> Công thức 1 (CT1): 5% Đậu nành + 5% cám<br /> gạo + 90% bã sắn;<br /> Công thức 2 (CT2): 5% Đậu nành + 5% rỉ<br /> đường + 90% bã sắn;<br /> Công thức 3 (CT3): 5% Đậu nành + 5% cám<br /> gạo + 5% rỉ đường + 85% bã sắn;<br /> Công thức 4 (CT4): 10% Đậu nành + 90% bã sắn.<br /> Cố định mật độ vi khuẩn là 106 CFU/g.<br /> 3.3. Phân tích số liệu<br /> Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần, kết quả<br /> trình bày là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm ±<br /> độ tin cậy 95%. Số liệu được phân tích phương sai<br /> (ANOVA), sự khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05.<br /> <br /> 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 181<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Từ đồ thị hình 1 cho thấy, khi tỷ lệ đậu nành<br /> bổ sung là 10%, đường kính vòng phân giải CMC<br /> và phytate đạt cực đại, lần lượt là 9,08 ± 0,95 mm<br /> và 7,08 ± 0,96 mm. Hiệu suất thủy phân phytate và<br /> cellulose cũng tăng dần khi tăng tỷ lệ đậu nành từ<br /> 0% đến 10%, cụ thể khi không bổ sung đậu nành<br /> thì hiệu suất thủy phân phytate và cellulose là<br /> 9,36 ± 0,35% và 25,6 ± 2,90%, khi tỷ lệ đậu nành là<br /> 10% thì hiệu suất thủy phân phytate và cellulose đạt<br /> <br /> Số 3/2014<br /> cao nhất, lần lượt là 39,48 ± 0,05% và 35,27 ± 2,81%.<br /> Nếu tiếp tục tăng tỷ lệ đậu nành lên 15% và 20% thì<br /> hiệu suất thủy phân phytate và cellulose giảm dần.<br /> Do đó, chọn tỷ lệ đậu nành bổ sung là 10%,<br /> kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của<br /> L. Noubi và cs (1995) [7].<br /> 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến khả năng thủy<br /> phân cellulose và phytate<br /> <br /> Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Nghiên cứu lựa chọn 3 mức nhiệt độ 24 - 30<br /> - 36 C nhằm theo thang nhiệt độ thực tế ở các địa<br /> phương những vùng hay trồng và chế biến tinh bột<br /> sắn như Quảng Trị, Quảng Bình, Khánh Hòa… Khi<br /> tăng nhiệt độ ủ từ 24 ± 10C lên 36 ± 10C thì đường<br /> kính thủy phân CMC và phytate tăng; hiệu suất thủy<br /> phân cellulose và phytate cũng tăng tương ứng. Ở<br /> nhiệt độ ủ là 36 ± 1oC thì đường kính thủy phân<br /> CMC và phytate là 9,17± 0,72 mm và 7,75 ± 0,5 mm;<br /> 0<br /> <br /> hiệu suất thủy phân cellulose đạt 33,30 ± 0,57% và<br /> phytate đạt 39,66 ± 0,02%; tăng 19% và 21% so với<br /> khi ủ ở nhiệt độ 24 ± 10C. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ<br /> lên 400C vẫn là điều kiện vi khuẩn Bacillus subtilis C7<br /> thích nghi và sinh enzyme phản ứng tiếp tục thủy<br /> phân tuy nhiên mức nhiệt độ này không thể duy<br /> trì một cách tự nhiên mà chỉ rơi vào trong khoảng<br /> 24 - 360C. Vì vậy, nhiệt độ 36 ± 10C thích hợp cho<br /> quá trình thủy phân cellulose và phytate.<br /> <br /> 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Từ hình 3 cho thấy, khi tỷ lệ hỗn hợp: nước tăng dần từ 1:1 lên 1: 2 thì đường kính thủy phân CMC và<br /> phytate tăng từ đó hiệu suất thủy phân cellulose và phytate cũng tăng dần. Ở mức tỷ lệ hỗn hợp: nước là<br /> 1 : 2, hiệu suất thủy phân cellulose là 31,54 ± 1,32% và hiệu suất thủy phân phytate là 37,01 ± 0,67%. Tuy<br /> nhiên khi tiếp tục tăng tỷ lệ hỗn hợp:nước lên 1:2,5 thì hiệu suất thủy phân cellulose và phytate không khác biệt<br /> (p > 0,05). Vì thế chọn tỷ lệ hỗn hợp: nước là 1 : 2 (độ ẩm tương ứng là 70%) cho quá trình ủ.<br /> <br /> 182 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2014<br /> <br /> 4. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Từ hình 4 cho thấy, khi tăng thời gian ủ từ 12 giờ<br /> đến 48 - 60 giờ thì đường kính CMC và phytate tăng<br /> từ đó hiệu suất thủy phân cellulose và phytate cũng<br /> tăng. Hiệu suất thủy phân cellulose sau khi ủ 48 giờ,<br /> đạt 31,54 ± 0,82%; nếu tiếp tục tăng thời gian ủ lên<br /> 60 giờ và 72 giờ thì hiệu suất thủy phân cellulose<br /> <br /> không có sự khác biệt (p > 0,05). Thời gian ủ là<br /> 48 giờ và 60 giờ thì hiệu suất thủy phân phytate lần<br /> lượt là 36,98 ± 0,47% và 40,06 ± 1,71%. Sau 48 giờ<br /> ủ thì hiệu suất thủy phân cellulose và phytate đều<br /> cao hơn 30%, do đó chọn thời gian ủ bã sắn với<br /> chủng vi khuẩn Bacillus subtilis C7 là 48 giờ.<br /> <br /> 5. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Hình 5. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose và phytate<br /> <br /> Công thức 1 (CT1): 5% đậu nành + 5% cám gạo<br /> + 90% bã sắn;<br /> Công thức 2 (CT2): 5% đậu nành + 5% rỉ đường<br /> + 90% bã sắn;<br /> Công thức 3 (CT3): 5% đậu nành + 5% cám gạo<br /> + 5% rỉ đường + 85% bã sắn;<br /> Công thức 4 (CT4): 10% đậu nành + 90% bã sắn.<br /> Kết quả trong hình 5 cho thấy, đường kính CMC<br /> và hiệu suất thủy phân cellulose ở CT1, CT2, CT3<br /> <br /> không có sự khác biệt (p > 0,05), trong khi ở CT4<br /> đường kính CMC đạt cao nhất 8,58 ± 0,36 mm hiệu<br /> suất thủy phân cellulose cao nhất ở 31,54 ± 0,82.<br /> Hiệu suất thủy phân phytate ở CT3, CT4 cũng cao<br /> hơn ở CT1 và CT2 (p < 0,05); đường kính thủy<br /> phytate đạt cao nhất ở CT4 là 6,08 ± 0,15 mm và<br /> hiệu suất đạt 36,74 ± 1,49. Vì vậy có thể bổ sung<br /> đậu nành nhằm tăng hàm lượng chất dinh dưỡng và<br /> tăng hiệu suất thủy phân cellulose và phytate.<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 183<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> 1. Kết luận<br /> Xác định được các thông số của quá trình ủ<br /> bã sắn với chủng Bacillus subtilis C7 để quá trình<br /> thủy phân cellulose và phytate đạt hiệu quả cao.<br /> Kết quả cho thấy thời gian ủ thích hợp là 48 giờ,<br /> nhiệt độ ủ 36 ± 10C, tỷ lệ nước: hỗn hợp là 2:1, tỷ lệ<br /> đậu nành bổ sung 10%. Hiệu suất thủy phân<br /> <br /> Số 3/2014<br /> cellulose, phytate sau khi ủ lần lượt là 35,27 ± 2,81%<br /> và 39,48 ± 0,05%.<br /> 2. Kiến nghị<br /> Nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa chủng<br /> Bacillus subtilis C7 và các chủng vi sinh vật khác để<br /> tăng hiệu quả thủy phân cellulose và phytate, giảm<br /> hàm lượng độc tố cyanua để ứng dụng trong sản<br /> xuất thức ăn chăn nuôi.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> 1.<br /> <br /> Nguyễn Minh Trí, Mạch Trần Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh Hải, Phạm Hồng Ngọc Thùy, 2013. Tuyển chọn chủng Bacillus<br /> spp. sinh enzyme và nhân sinh khối trên môi trường bã sắn. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 223: 84-88.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> TCVN 4329-93. Xác định chất xơ thô.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Crispen Mawadza, Rajni Hatti-Kaul, Remigio Zvauya, Bo Mattiasson, 2000. Purification and characterization of cellulases<br /> produced by two Bacillus strains. Journal of Biotechnology, 83: 177 – 187.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Deepmoni Deka, P.Bhargavi, Ashish Sharma, Dinesh Goyal, and M. Jawed, and Arun Goyal, 2011. Enhancement of Cellulase<br /> Activity from a New Strain of Bacillus subtilis by Medium Optimization and Analysis with Various Cellulosic Substrates.<br /> Enzyme Research.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Frühbeck G, Alonso R, Marzo F, Santidrián S., 1995. A modified method for the indirect quantitative analysis of phytate in<br /> foodstuffs. Anal biochem.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Jacob, M.B. and Gerstein, M.J., 1960. Hand book of Microbiology. D. Van Nostrand Co. Inc. Princeton. New Jersey, USA, 61.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> Ji Hwan Yoon, Ji Eun Park, Dong Yeon Suk, 2007. Comparision of Dyes for easy detection of Extracellular Cellulase in<br /> Fungi. Mycobiology, 35.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> Noubi, Festus A. Numfor and L., 1995. Effect of full-fat soya bean flour on the quality and acceptabiIity of fermented cassava<br /> flour. The United Nations University Press, Food and Nutrition Bulletin, 16.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Oboh, Ganiyu, 2006. Nutrient enrichment of cassava peels using a mixed culture of Saccharomyces cerevisae and Lactobacillus spp.<br /> solid media fermentation techniques. Electronic Journal of Biotechnology: 46-49.<br /> <br /> Tiếng Anh<br /> <br /> 10. Thuy Thi Tran, Suhaila Omar Hashim, Yasser Gaber, Gashaw Mamo, Bo Mattiasson, Rajni Hatti-Kaul, 2011. Thermostable<br /> alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: Effect of divalent metals on activity and stability. Journal of Inorganic Biochemistry,<br /> 105: 1000-1007.<br /> <br /> 184 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br />