Khảo sát các đột biến trên gen meca và meci ở một số chủng staphylococcus aureus đề kháng methicillin

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> KHẢO SÁT CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN MECA VÀ MECI Ở MỘT SỐ<br /> CHỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐỀ KHÁNG METHICILLIN<br /> Bùi Minh Giao Long*, Mạnh Trường Lâm**, Vũ Thanh Thảo***, Trần Cát Đông***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Không phải tất cả các chủng Staphylococcus aureus mang gen mecA đều có kiểu hình đề kháng<br /> methicillin. Sự hiện diện của gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA đã được tìm thấy ở một số chủng.<br /> Các đột biến trên hai gen này có thể ảnh hưởng kiểu hình đề kháng, do đó cần phải được xác định để giải thích rõ<br /> hơn về cơ chế đề kháng của vi khuẩn.<br /> Mục tiêu: Giải trình tự và xác định đột biến trên gen mecA, mecI của một số chủng MRSA phân lập trên<br /> bệnh nhân tại bệnh viện đa khoa Sóc Trăng.<br /> Phương pháp: Phân lập và định danh các chủng S.aureus bằng phương pháp thường quy tại bệnh viện.<br /> Thử nghiệm kháng sinh đồ với oxacillin để xác định kiểu hình đề kháng. Chiết tách ADN, thực hiện PCR với các<br /> cặp mồi mecA và mecI. Giải trình tự sản phẩm PCR. Dùng phần mềm ClusterX 2.0.1. để phát hiện các đột biến<br /> bằng cách so sánh với trình tự chủng chuẩn.<br /> Kết quả: Phân lập được 33 chủng S. aureus trong đó có 10 chủng có kiểu hình đề kháng và PCR dương tính<br /> với mecA, 23 chủng còn lại nhạy cảm với oxacillin và PCR âm tính với mecA. Trong số 10 chủng mang gen<br /> mecA, xác định được 4 chủng mang gen mecI. Xác định được đột biến trên gen mecA ở 4 chủng (7, 16, 28 và 30).<br /> Chỉ xác định đột biến trên gen mecI ở 1 chủng (28). Các dạng đột biến này đều là đột biến điểm và chưa thấy<br /> được công bố trước đây ngoại trừ dạng đột biến trên gen mecI.<br /> Kết luận: Tất cả chủng MRSA có kiểu hình đề kháng đều mang gen mecA. Các đột biến xác định được trên<br /> gen mecA và mecI không làm thay đổi kiểu hình.<br /> Từ khóa: MRSA, mecA, mecI, đột biến, đề kháng kháng sinh.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> MUTATIONS IN mecA AND mecI GENES OF SOME MRSA STRAINS<br /> (METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS)<br /> Bui Minh Giao Long, Manh Truong Lam, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 170 - 174<br /> Background: Not all mecA-positive Staphylococcus aureus strains have phenotypic resistance to methicillin. The<br /> presence of mecI coding for mecA repressor was found in some strains. Mutations in both genes may affect phenotypes,<br /> therefore to understand more thoroughly about the resistance mechanism these mutations need to be identified.<br /> Objectives: Sequencing and identifying mutations in mecA and mecI genes of some MRSA strains isolated<br /> from patients in Hospital of Soctrang Province.<br /> Methods: S. aureus strains were isolated and identified by using the routine methods of hospital. Oxacillin<br /> disk agar diffusion was used to screen for strains having the resistance phenotype. DNA of theses strains was<br /> extracted and used as templates for PCR. The PCR products were sequenced. The ClusterX 2.0.1.1 software was<br /> used to detect genetic mutation by aligning the sequences of examined genes with those of the control strain.<br /> Bộ môn Dược Lâm Sàng, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Khoa Dược, Bệnh viện Đa khoa Sóc Trăng<br /> *** Phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông<br /> ĐT: 08. 38295641 – 127<br /> Email: trancdong@gmail.com<br /> *<br /> <br /> **<br /> <br /> 170<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Results: 33 strains of S. aureus were isolated and identified, among them, there were 10 strains having both<br /> phenotypic and genotypic resistance. The 23 others were sensitive to oxacillin and mecA negative as well. Mutations in<br /> mecA were found in 4 strains (7, 16, 28 and 30) only one mecI mutation was identified in one strain (28). These<br /> mutations are point mutations and have not been reported in previously except the mecI mutation.<br /> Conclusion: In this study, all MRSA phenotypic strains possessed mecA gene. Mutations in mecA and<br /> mecI genes detected did not change the phenotype.<br /> Keywords: MRSA, mecA , mecI, mutation, antibiotic resistant.<br /> Taq polymerase (BioLabs), kit tinh chế sản phẩm<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> PCR (Wizard SV gel & PCR clean-up system)<br /> Hiện nay, Staphylococcus aureus đề kháng<br /> (Promega).<br /> methicillin (MRSA) là nguyên nhân phổ biến<br /> Trang thiết bị: máy UV-vis Genquant 1300,<br /> trong nhiễm trùng bệnh viện làm gia tăng tỉ lệ<br /> tủ ấm Shellab, máy li tâm Sigma 3 – 18, máy luân<br /> tử vong vì chúng đề kháng với hầu hết kháng<br /> nhiệt Techne TC - 3000 G, bộ điện di ngang Biosinh họ β-lactam(11). Cơ chế đề kháng kháng<br /> rad Mini-sub cell GT.<br /> sinh nhóm β-lactam gồm khả năng sản xuất βPhân lập và định danh<br /> lactamase của vi khuẩn và sự hiện diện của<br /> Các chủng Staphylococcus aureus được phân<br /> gen mecA trong đó cơ chế đề kháng do gen<br /> lập<br /> từ mẫu bệnh phẩm trong thời gian từ tháng<br /> được xem là quan trọng hơn và được nghiên<br /> 06/2010 đến tháng 08/2010 tại Bệnh viện Sóc<br /> cứu bởi một số tác giả(7,10). Gen mecA mã hóa<br /> Trăng và định danh bằng phương pháp thường<br /> protein gắn kết penicillin 2a (PPB2a) có ái lực<br /> (4,8,9)<br /> quy<br /> theo quy trình của bệnh viện như cấy lên<br /> giảm với kháng sinh nhóm β-lactam<br /> . Gen<br /> các môi trường phân biệt và chọn lọc như BA<br /> này nằm trên nhiễm sắc thể nhưng được<br /> (Blood Agar), MSA (Mannitol Salt Agar) và thực<br /> điều hòa bởi các gen trên plasmid và thuộc<br /> hiện phản ứng coagulase.<br /> transposon Tn-4291 nên gen này có thể được<br /> truyền dễ dàng từ vi khuẩn này sang vi<br /> khuẩn khác. Điều này giải thích sự lan truyền<br /> nhanh chóng của các chủng MRSA(10).<br /> Phương pháp xác định MRSA dựa trên sự<br /> hiện diện của gen mecA hiện được xem chính xác<br /> hơn các phương pháp xác định kiểu hình khác(3).<br /> Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy<br /> một số chủng mang gen mecA nhưng không có<br /> kiểu hình đề kháng methicillin. Sự hiện diện của<br /> gen mecI với vai trò ức chế hoạt động gen mecA<br /> đã được tìm thấy ở một số chủng(5,6,10,12). Các đột<br /> biến trên hai gen này có thể làm thay đổi hoặc<br /> không thay đổi kiểu hình đề kháng do đó cần<br /> phải được xác định để giải thích rõ hơn về cơ chế<br /> đề kháng của vi khuẩn.<br /> <br /> VẬTLIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Vật liệu<br /> Hóa chất: đĩa kháng sinh (Nam Khoa), TSA,<br /> MHA, MSA, BA, agarose, ethidium bromide<br /> (Merck), PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs),<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Kháng sinh đồ: Thử nghiệm kháng sinh đồ<br /> bằng phương pháp Kirby – Bauer(9), với đĩa giấy<br /> kháng sinh của Công ty Nam Khoa. Hiện nay,<br /> methicillin ít được sử dụng do độc tính cao nên<br /> một kháng sinh cùng nhóm là oxacillin được<br /> thay thế để điều trị và dùng cho kháng sinh đồ(1).<br /> Hai chủng dùng làm chứng gồm S. aureus ATCC<br /> 29213 (nhạy methicillin) và S. aureus ATCC 4330<br /> (MRSA). Đo đường kính vùng ức chế bằng<br /> thước kẹp. Bất cứ sự tăng trưởng nào quan sát<br /> được bên trong vùng ức chế đều chứng tỏ rằng<br /> vi khuẩn kháng kháng sinh. Kết quả được biện<br /> giải theo M100-S18 của CLSI. (1).<br /> <br /> Chiết tách ADN và thực hiện PCR<br /> Chiết tách ADN theo qui trình chiết tách<br /> chung cho vi khuẩn Gram dương của Cutting<br /> S. và cs(2). Sau đó, thực hiện PCR khuếch đại<br /> đoạn gen với mồi đặc hiệu được trình bày<br /> trong Bảng 1.<br /> <br /> 171<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 1. Các cặp mồi của phản ứng PCR gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R)<br /> Tên mồi<br /> MecA-F2<br /> MecA-R2<br /> mecI-F<br /> mecI-R<br /> <br /> Trình tự mồi tự thiết kế ( 5’ đến 3’)<br /> AGT TGT AGT TGT GGG GTT TGG<br /> CGT ATT TTT TAT TAC CGT TTCTC<br /> AAT GGC GAA AAA GCA CAA CA<br /> GAC TTG ATT GTT TCC TCT GTT<br /> <br /> Kích thước sản phẩm khuếch đại<br /> 2000 bp<br /> 481 bp<br /> <br /> và mecI với các gen tương ứng của chủng<br /> S.aureus N315 bằng phần mềm ClustalX 2.0.11.<br /> <br /> Phản ứng PCR thể tích 25 µl có thành phần<br /> gồm 0,5 µl ADN trộn với 2,5 µl đệm PCR 10 X,<br /> 0,25 µl dNTP 25 mM, 0,25 µl mồi xuôi và mồi<br /> ngược với nồng độ 100 µM và 0,2 µl Taq ADN<br /> polymerase 5 U/ µl và nước khử khoáng vừa đủ.<br /> Thực hiện chương trình PCR gồm 95°C trong 1<br /> phút, 45°C trong 45 giây, 72 °C trong 2,5 phút,<br /> lập lại 35 chu kì. Sản phẩm khuếch đại được<br /> chạy điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 100V<br /> trong 15 phút, đọc kết quả bằng phương pháp<br /> nhuộm ethidium bromide và xem dưới ánh sáng<br /> tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Sau đó, tinh chế<br /> sản phẩm PCR bằng cột Promega Wizard® SV<br /> Gel and PCR Clean-Up System theo hướng dẫn<br /> của nhà sản xuất.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Có 10 chủng trong số 33 chủng S. aureus có<br /> mang gen đề kháng mecA gồm chủng 7, 9, 10, 16,<br /> 19, 20, 25, 28, 30 và 32. Các chủng này được tiếp<br /> tục thực hiện PCR để xác định gen mecI. Kết quả<br /> cho thấy chỉ có 4/10 chủng mang gen mecI.<br /> Nghiên cứu của Timothy M.A Weller cho thấy tỉ<br /> lệ mang gen mecI cao hơn với 48% (12). Chủng đối<br /> chứng là S. aureus ATCC 43300 (MRSA) cho kết<br /> quả dương tính với gen mecA và âm tính với gen<br /> mecI. Kết quả được trình bày trong Bảng 2.<br /> Bảng2. Kết quả xác định các gen mecA và mecI<br /> Chủng<br /> 7<br /> 9<br /> 10<br /> 16<br /> 19<br /> 20<br /> 25<br /> 28<br /> 30<br /> 32<br /> MRSA 43300<br /> <br /> Giải trình tự và phân tích kết quả<br /> Sản phẩm PCR của các gen mecA, mecI hiện<br /> diện ở các chủng S. aureus khảo sát được giải<br /> trình tự bởi dịch vụ của công ty Macrogen (Hàn<br /> Quốc) với các mồi tương ứng (xem Bảng 1). Các<br /> kết quả gửi về được lắp ráp thành đoạn gen<br /> hoàn chỉnh bằng chương trình SeqMan trong bộ<br /> phần mềm Lasergene v 7.1. Đột biến được xác<br /> định thực hiện bằng cách so sánh đoạn gen mecA<br /> <br /> mecA<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> <br /> Mẫu<br /> T<br /> <br /> 7<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 16<br /> <br /> 19<br /> <br /> 20<br /> <br /> mecI<br /> +<br /> +<br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> Mẫu<br /> 25<br /> <br /> 28<br /> <br /> 30<br /> <br /> T<br /> <br /> 32<br /> <br /> C<br /> <br /> 7<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 16<br /> <br /> 19<br /> <br /> 20<br /> <br /> 25<br /> <br /> 28<br /> <br /> 30<br /> <br /> 32<br /> <br /> 481bp<br /> <br /> 2kb<br /> <br /> b<br /> <br /> a<br /> <br /> Hình 1. Kết quả PCR của gen mecA (a) và gen mecI (b) trên các chủng S. aureus khảo sát<br /> T: thang 1kb, C: chứng MRSA.<br /> <br /> 172<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> Giải trình tự và phân tích kết quả<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> bằng cách sử dụng phần mềm ClustalX 2.0.11.<br /> Kết quả được trình bày trong Bảng 3.<br /> <br /> Các trình tự hoàn chỉnh được so sánh với các<br /> trình tự gen mecI, mecA của chủng S. aureus N315<br /> Bảng 3. Kết quả xác định đột biến trên các chủng S. aureus khảo sát<br /> Chủng<br /> 28<br /> 7, 16, 28 và 30<br /> 30<br /> <br /> Gen<br /> mecI<br /> mecA<br /> mecA<br /> <br /> Loại đột biến<br /> Đột biến thay thế C Æ T ở nucleotid 202<br /> Đột biến thay thế C Æ A ở nucleotid 75<br /> Đột biến thay thế T Æ G ở nucleotid 150<br /> Đột biến thay thế A Æ G ở nucleotid 242<br /> <br /> Hậu quả<br /> Tạo ra bộ ba kết thúc TAA<br /> Làm TCC Æ TCA cùng mã hóa cho serin<br /> Làm ATA Æ AGA chuyển isoleucin thành asparagin.<br /> CAG Æ CGG chuyển glycin thành asparagin.<br /> <br /> A. Đột biến thay thế C Æ T ở nucleotid 202 trên gen mecI của chủng 28<br /> <br /> B. Đột biến thay thế C Æ A ở nucleotid 75 trên gen mecA của chủng 7, 16, 28 và 30<br /> <br /> C. Đột biến thay thế T Æ G ở nucleotid 150, A Æ G ở nucleotid 242 trên mecA của chủng 30<br /> <br /> Hình 2. Kết quả xác định đột biến trên các chủng S. aureus khảo sát bằng phần mềm ClustalX 2.0.11<br /> Trong 4 chủng mang gen mecI chỉ có một<br /> Theo kết quả trên, các chủng 7, 16 và 28 chỉ<br /> chủng (28) có đột biến được xác định. Trên lý<br /> có một đột biến điểm và dạng này không làm<br /> thuyết cả 4 chủng mang gen mecI sẽ không có<br /> thay đổi acid amin được dịch mã. Chủng 30 có<br /> kiểu hình đề kháng vì mecI mã hóa cho chất chế<br /> đến 3 đột biến điểm gồm 1 dạng giống 3 chủng<br /> ức chế hoạt động của mecA nên sẽ không biểu<br /> trên và 2 dạng khác làm thay đổi acid amin được<br /> hiện được thành PBP2a. Tuy nhiên, cả 4 chủng<br /> dịch mã. Như vậy, 4 chủng có đột biến trên mecA<br /> này theo thử nghiệm kháng sinh đồ đều thể hiện<br /> dù làm thay đổi hay không làm thay đổi acid<br /> amin được dịch mã đều vẫn biểu hiện thành<br /> kiểu hình đề kháng. Ở chủng 28, đột biến trên<br /> mecI dẫn đến việc tạo bộ ba kết thúc làm cho<br /> kiểu hình đề kháng. Nói cách khác, các đột biến<br /> mecI không còn khả năng tác động ức chế hoạt<br /> này không ảnh hưởng đến sự đề kháng của các<br /> động của mecA. Do đó, chủng này vẫn biểu hiện<br /> chủng này. Một số nghiên cứu của Nobumichi<br /> kiểu hình đề kháng. Đột biến này cũng đã được<br /> và cs.(5) về các đột biến trên mecA nhưng không<br /> xác định trong một nghiên cứu trước đây của<br /> tìm thấy dạng nào tương tự như dạng đã xác<br /> Nobumichi và cs.(5)<br /> định trong nghiên cứu này.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 173<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Tuy nhiên, đối với 3 chủng mang gen mecI<br /> còn lại là chủng số 7, 30 và 32 lại không xác định<br /> được đột biến nào trên mecI. Trong đó, chủng 30<br /> được xác định mang đột biến trên gen mecA làm<br /> thay đổi acid amin, chủng 7 mang đột biến<br /> không làm thay đổi acid amin và chủng 32<br /> không có đột biến (xem Bảng 3). Có nhiều giả<br /> thuyết về kết quả này, đối với chủng 30, có thể<br /> đột biến trên gen mecA đã giúp cho gen này<br /> tránh sự ức chế của mecI. Đối với chủng 7 và<br /> chủng 32, một giả thuyết khác có thể dùng để lý<br /> giải là sự hoạt động của một gen điều hòa khác<br /> là gen mecR1 với vai trò cảm ứng hoạt động của<br /> gen mecA, trái ngược với mecI. Hầu như các<br /> chủng MRSA mang gen mecA đều có mang gen<br /> mecR1 (95%)(12). Trong trường hợp này, gen<br /> mecR1 có thể làm gia tăng hoạt động cảm ứng<br /> của gen mecA để bù lại sự ức chế của gen mecI.<br /> Cần nghiên cứu thêm các đột biến trên gen này<br /> để có kết luận chính xác hơn.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Trong nghiên cứu này, tất cả chủng có kiểu<br /> hình đề kháng đều mang gen mecA, cho thấy có<br /> sự liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình đề kháng<br /> rất rõ ràng. Những đột biến xác định được trên<br /> gen mecA và mecI không làm thay đổi kiểu hình.<br /> Cần tiếp tục nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn<br /> hơn để xác định sự liên quan giữa kiểu hình và<br /> kiểu gen đề kháng và các đột biến trên các gen<br /> mecA , mecI và mecR1 để hiểu rõ hơn về cơ chế đề<br /> kháng methicillin của vi khuẩn.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> <br /> 174<br /> <br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> 10.<br /> <br /> 11.<br /> <br /> 12.<br /> <br /> Cutting S. M. and Horn P. B. V. (1990). Genetic Analysis.<br /> Molecular Biological Methods for Bacillus. C. R. Harwood<br /> and S. M. Cutting. Chichester, England, John Wiley & Sons<br /> Ltd: 27-74.<br /> Dominguez MA, Linares J, Martin R (1997). Molecular<br /> mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus.<br /> Microbiologia; 13: 301-8.<br /> Gerberding JL, Miick C, Liu HH, Chambers HF (1991).<br /> Comparison of conventional susceptibility tests with direct<br /> detection of penicillin-binding protein 2a in borderline<br /> oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrob<br /> Agents Chemother; 35: 2574-79.<br /> Kobayashi N., Taniguchi K., and Urasawa S. (1998), Analysis<br /> of diversity of mutations in the mecI gene and mecA<br /> promoter/operator<br /> region<br /> of<br /> methicillin-resistant<br /> Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis,<br /> Antimicrobial Agents And Chemotherapy, p 717–720, Vol. 42,<br /> No.3<br /> Lewis RA. and Dyke KGH, MecI represses synthesis from the<br /> β-lactamase operon of Staphylococcus aureus J. Antimicrob.<br /> Chemother. (2000) 45(2): 139-144<br /> McCallum N. et al. (2010). Regulation of antibiotic resistance<br /> in Staphylococcus aureus International Journal of Medical<br /> Microbiology 300: 118–129 121<br /> Murakami, K., Minadime W., Wanda K., Nakamura E.,<br /> Teraoka H., and Watanabee S. (1991). Identification of<br /> methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase<br /> chain reaction. J. Clin. Microbiol. 29:2240-2244.<br /> Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Ellen Jo Baron, et al.<br /> (1999), "Manual of clinical microbiology", American Society<br /> Microbiology Publisher:pp.172, 292-293.<br /> Sharma VK, Hackbarth CJ, Dickinson TM, Archer GL., (1998 )<br /> Interaction of native and mutant MecI repressors with<br /> sequences that regulate mecA, the gene encoding penicillin<br /> binding protein 2a in methicillin-resistant staphylococci. J<br /> Bacteriol. Apr;180(8):2160-6.<br /> Voss A., Doebbeling N.B. (1995). The worldwide prevalence<br /> of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. International<br /> Journal of Antimicrobial Agents 5:101-106.<br /> Weller M.A.T. (1999). The distribution of mecA, mecR1 and<br /> mecI and sequence analysis of mecI and the mec promoter<br /> region in staphylococci expressing resistance to methicillin.<br /> Journal<br /> of<br /> Antimicrobial<br /> Chemotherapy<br /> 43:<br /> 15–22.<br /> <br /> CLSI (2008). Performance Standards for Antimicrobial Disk<br /> Susceptibility Tests; 18th Informational Supplement. M100S18. 28 (1): 46-53.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />