Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN<br /> CỦA BÁN CHI LIÊN (Scutelaria barbata D. Don)<br /> Nguyễn Thị Linh Ngân*, Ngô Thanh Diệp*, Đỗ Thị Hồng Tươi*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Cao toàn phần, các dịch chiết nước, alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập được từ Bán chi<br /> liên (Scutelaria barbata D. Don) được báo cáo có hoạt tính kháng ung thư trực tràng, u xơ tử cung, ung thư gan,<br /> tác dụng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn...<br /> Mục tiêu: khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don).<br /> Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Mẫu thử là cao cồn 50%, cao flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán<br /> chi liên. Đánh giá hoạt tính độc tế bào gan HepG2 bằng test MTT. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng<br /> phương pháp DPPH và định lượng MDA gan; độc tính cấp đường uống trên chuột đực và cái, theo dõi tỷ lệ chết<br /> trong 72 giờ. Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro được khảo sát trên chuột nhắt gây viêm gan bằng CCl4<br /> vào ngày 15 sau khi cho chuột uống cao hoặc thuốc đối chiếu silymarin trong 14 ngày liên tiếp. Ngày 16, xác định<br /> hoạt tính ALT, AST và hàm lượng MDA, GSH trong gan; quan sát đại thể và vi thể gan.<br /> Kết quả: Cao cồn 50%, cao flavonoid và luteonin không độc tế bào gan HepG2 trong khi apigenin ức chế sự<br /> tăng trưởng tế bào. Cao cồn 50%, cao flavonoid và luteonin có hoạt tính chống oxy hóa in vitro với IC50 lần lượt là<br /> 110,78; 29,82; 58,03 μg/ml trong phương pháp DPPH và 25,61; 19,88; 10,16 μg/ml trong phương pháp MDA.<br /> Liều tối đa của cao cồn 50% không gây chết chuột LD0 là 16 g cao/kg; cao flavonoid không có độc tính cấp đường<br /> uống ở liều tối đa Dmax là 2,24 g/kg. Các cao từ Bán chi liên giúp giảm tổn thương gan do CCl4 qua sự giảm hoạt<br /> tính AST, ALT và lượng MDA; tăng lượng GSH, cải thiện mức độ viêm gan khi phân tích mô bệnh học. Tác<br /> dụng của cao cồn tương tự silymarin trong khi cao flavonoid chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt hơn.<br /> Kết luận: Cao cồn 50% và cao flavonoid từ Bán chi liên có tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở cấp độ in<br /> vitro và in vivo. Tác dụng này có thể do hoạt tính chống oxy hóa của luteolin trong dược liệu.<br /> Từ khóa: Bán chi liên, tế bào HepG2, độc tính cấp, chống oxy hóa, bảo vệ gan<br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON ANTIOXIDANT AND HEPATOPROTECTIVE EFFECTS<br /> OF SCUTELARIA BARBATA D. DON<br /> Nguyen Thi Linh Ngan, Ngo Thi Thanh Diep, Do Thi Hong Tuoi<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 2 - 2016: 195 - 203<br /> <br /> Introduction - Objectives: Alcoholic, flavonoids, alkaloids extracts and some substances isolated from<br /> Scutelaria barbata D. Don have been reported about their activity against colorectal cancer, liver cancer as well as<br /> antioxidant, anti-inflammatory and antibacterial effects... The aim of this work was to study on antioxidant and<br /> hepatoprotective effects of S. barbata D. Don.<br /> Methods: 50% alcoholic and flavonoids extracts; apigenin, luteonin were assessed cytotoxicity in<br /> HepG2 cells by MTT test, in vitro antioxidant activity by DPPH and MDA methods. Oral acute toxicity in<br /> <br /> <br /> *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoid99@gmail.com<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 195<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> mice was studied on death rate within 72 hours after being dosed. Hepatoprotective effects were evaluated<br /> against CCl4 induced hepatitis. Mice were pre-treated orally with extracts or silymarnin for 14 days<br /> followed by a single dose of CCl4 on 15th day. On day 16, liver enzymes AST, ALT activities were estimated<br /> in serum. Glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) levels in liver homogenate were determined.<br /> Liver histopathological changes were also studied.<br /> Results: 50% alcoholic and flavonoids extracts, luteonin had no cytotoxicity in HepG2 cells while apigenin<br /> inhibited cells growth. Two extracts and luteonin had in vitro antioxidant activity with respective IC50 of 110.78;<br /> 29.82; 58.03 μg/ml in DPPH method; 25.61; 19.88; 10.16 μg/ml in MDA assay. Minimum lethal dose of<br /> alcoholic extract was 16 g/kg while flavonoid one had no oral acute toxicity at Dmax of 2.24 g/kg. Two these extracts<br /> attenuated liver damage due to CCl4 administration as indicated by significant reduction in elevated levels of<br /> ALT, AST and MDA; increase in GSH content; improvement of hepatitis level in histopathological analysis.<br /> These effects of alcoholic extract were similar to that of silymarin while flavonoid extract exhibited better<br /> hepatoprotection.<br /> Conclusion: Alcoholic and flavonoid extracts of S. barbata D. Don had antioxidant and<br /> hepatoprotective effects in vitro as well as in vivo. This effect may be due to antioxidant activity of luteonin<br /> present in the medicinal plant.<br /> Key words: Scutelaria barbata D. Don, HepG2 cells, acute toxicity, antioxidant, hepatoprotective effect<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ khuẩn...(1,2,5,12). Hiện nay, ở Việt Nam có các<br /> nghiên cứu về thành phần hóa học, khả năng<br /> Gan là một cơ quan lớn, thực hiện nhiều kháng lại NF-kB của Bán chi liên nhưng chưa<br /> chức năng đặc biệt của cơ thể. Do gan ở vị trí cửa có nghiên cứu hay chứng minh về tác dụng<br /> ngõ, dễ bị ảnh hưởng bởi các chất độc nên bệnh chống oxy hóa trên của cao toàn phần, cao<br /> gan đa dạng, phức tạp và ngày càng gia tăng gây flavonoid, một số chất phân lập từ dược liệu<br /> ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Xu này như apigenin, luteolin(7). Từ những cơ sở<br /> hướng hiện nay là phát triển, sử dụng thuốc từ<br /> trên, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Khảo<br /> dược liệu giúp bảo vệ gan, kiểm soát và điều trị<br /> sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của<br /> kịp thời nhờ ưu điểm có thể sử dụng lâu dài,<br /> Bán chi liên (Scutelaria barbata D. Don)”.<br /> tính an toàn cao.<br /> VẬTLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don), họ<br /> Lamiaceae được dùng trong y học cổ truyền Cao dược liệu: cao cồn 50% toàn phần, cao<br /> nhờ có vị hơi đắng, tính mát, tác dụng thanh flavonoid, apigenin, luteonin từ Bán chi liên<br /> nhiệt giải độc, lợi tiểu, tiêu sưng, giảm đau(11). được kiểm nghiệm, cung cấp bởi BM. Hóa<br /> Từ xưa, Bán chi liên được dùng chữa đinh phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược, ĐH Y<br /> nhọt, viêm gan viêm vú, viêm mủ da, sâu Dược Tp. HCM.<br /> quảng, rắn độc cắn, bệnh phụ khoa(11). Bán chi Hóa chất: DPPH, quercetin, MDA chuẩn,<br /> liên cũng có trong bài thuốc chữa ung thư GSH chuẩn (Sigma-Aldrich, Mỹ), methanol, acid<br /> phổi, gan, trực tràng giai đoạn đầu. Một số thiobarbituric (Merck, Đức), silymarin (Madaus,<br /> nghiên cứu trên thế giới báo cáo cao toàn Đức), formalin (Trung Quốc). Các loại hóa chất<br /> phần, hoặc các dịch chiết khác nhau như nước, sử dụng đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết phân tích<br /> alkaloid, flavonoid… hay các chất phân lập PA (Pure for analysis).<br /> được từ Bán chi liên như apigenin, scutellanin, Động vật nghiên cứu: Chuột nhắt Swiss<br /> luteolin… có hoạt tính kháng ung thư trực albino, 6-7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22-<br /> tràng, u xơ tử cung, ung thư gan, tác dụng 25 g, do Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha<br /> chống oxy hóa, kháng viêm, kháng<br /> <br /> <br /> 196 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Trang cung cấp. Chuột đực và cái, khoẻ mạnh, tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng -<br /> không có biểu hiện bất thường, nuôi ổn định ODthử)/ ODchứng] × 100. Mẫu chứng (có DPPH,<br /> trong môi trường thí nghiệm 3 - 5 ngày. Chuột không có mẫu thử) và mẫu đối chiếu quercetin<br /> được nuôi trong lồng kích thước 25x35x15 cm (6 được tiến hành song song. Xác định IC50 (nồng<br /> chuột/lồng) và cung cấp thức ăn, nước uống đầy độ có HTCO bằng 50%) của mẫu thử.<br /> đủ trong thử nghiệm. Phương pháp định lượng MDA(9): Malonyl<br /> Phương pháp nghiên cứu dialdehyd (MDA) sinh ra trong quá trình peroxy<br /> Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư gan hóa lipid phản ứng với acid thiobarbituric tạo<br /> phức trimethin màu hồng có đỉnh hấp thu cực<br /> HepG2 (1)<br /> đại ở 532 nm, sử dụng quercitin làm chất đối<br /> Tế bào HepG2 (2,5 × 104/cm2) nuôi cấy trong<br /> chứng. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml mẫu thử<br /> môi trường EMEM, bổ sung 10% huyết thanh<br /> ở các nồng độ khác nhau, 0,5 ml dịch đồng thể<br /> thai bò, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin,<br /> gan 10% (kl/tt), đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2<br /> 100 μg/ml streptomycin trên đĩa 96 giếng, ủ<br /> ml. Ủ hỗn hợp 15 phút ở 37˚C và dừng phản ứng<br /> 37°C, 5% CO2. Sau 18 giờ, xử lý tế bào với mẫu<br /> bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Ly tâm, lấy 1 ml<br /> thử ở các nồng độ khác nhau hoặc đối chứng<br /> dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid<br /> doxorubicin trong 24 giờ. Ủ ở 37oC, 5% CO2, thực<br /> thiobarbituric 0,8% ở 100˚C trong 15 phút. Làm<br /> hiện test MTT xác định tỷ lệ tế bào sống. Dung<br /> lạnh, đo OD ở 532 nm. Thực hiện 3 lần, lấy giá trị<br /> dịch mẹ pha trong dimethyl sulfoxid (DMSO).<br /> trung bình. Tính hoạt tính chống oxy hóa<br /> Tiến hành song song với mẫu chứng DMSO có<br /> (HTCO) theo công thức: HTCO% = [(ODchứng -<br /> nồng độ tương đương.<br /> ODthử)/ODchứng] x 100, trong đó ODchứng và ODthử<br /> Xác định tỷ lệ tế bào sống bằng test MTT: [3- lần lượt là độ hấp thu của mẫu chứng (không có<br /> (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl mẫu thử) và mẫu thử. Xác định IC50 (nồng độ có<br /> tetrazolium bromid)] (MTT) chuyển thành tinh HTCO = 50%) của mẫu thử.<br /> thể formazan nhờ enzym succinat<br /> Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột<br /> dehydrogenase (SDH) chỉ có trong ty thể tế bào<br /> nhắt trắng (3)<br /> sống. Formazan tan trong isopropanol tạo dung<br /> dịch màu tím, đo OD ở 570 nm phản ánh số Cao cồn pha trong nước cất, cao flavonoid<br /> lượng tế bào sống trong mẫu. Tiến hành song pha trong hỗn hợp gồm tween 80 5% (tt/tt) và<br /> song với mẫu không xử lý và mẫu đối chứng nước cất.<br /> doxorubicin. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, 6 mẫu cho Cho chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi<br /> 1 điều kiện nuôi cấy (ứng với 1 nồng độ). cho uống 0,2 ml/10g cao Bán chi liên liều duy<br /> Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro nhất hỗn dịch có nồng độ tối đa có thể qua<br /> kim. Tiến hành song song với chuột chứng<br /> Phương pháp DPPH(9): 1,1-diphenyl-2-<br /> uống nước cất hoặc tween 5% (tt/tt). Theo dõi<br /> picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do ổn định,<br /> và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về<br /> không tự kết hợp để tạo nhị phân tử. Gốc tự do<br /> hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và<br /> có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi.<br /> số lượng chuột chết trong 72 giờ. Nếu chuột<br /> Mẫu thử có hoạt tính chống oxy hóa làm giảm<br /> không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp<br /> màu của DPPH vì gốc tự do DPPH kết hợp với<br /> tục theo dõi trong 14 ngày. Nếu có chuột chết,<br /> một H của mẫu thử tạo thành DPPH dạng<br /> giảm liều, tìm liều tối thiểu gây chết 100%<br /> nguyên tử. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu<br /> chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột<br /> thử tỷ lệ thuận với độ mất màu của DPPH xác<br /> (LD0) và liều gây chết 50% chuột (LD50).<br /> định bằng cách đo độ hấp thu OD ở bước sóng<br /> 517 nm. Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) được<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 197<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan phosphat-EDTA và 0,2 ml thuốc thử, ủ ở nhiệt<br /> trên chuột nhắt trắng (4,6) độ phòng 3 phút, đo OD ở 412 nm để định lượng<br /> Chia chuột ngẫu nhiên thành 9 lô (8 hoặc 10 GSH. Hàm lượng MDA và GSH (nmol/ml dịch<br /> chuột/lô): lô sinh lý và lô chứng bệnh: uống nước đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy<br /> cất; lô tween 5% và lô chứng bệnh + tween 5%: uống của MDA hoặc GSH chuẩn.<br /> tween 80 pha trong nước cất ở nồng độ 5% (tt/tt); Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê<br /> lô đối chiếu: uống silymarin 100 mg/kg; 2 lô cao Kết quả được xử lý bằng phần mềm<br /> cồn: uống cao cồn liều 800 mg/kg và 1600 mg/kg; Microsoft Excel, trình bày dưới dạng giá trị<br /> 2 lô cao flavonoid: uống cao flavonoid liều 80 trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình<br /> mg/kg và 160 mg/kg. (Mean ± SEM), đánh giá ý nghĩa thống kê<br /> Thời gian cho uống hằng ngày trong bằng phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-<br /> khoảng 8 - 10 giờ sáng, thể tích uống 0,1 ml/10 Whitney trên phần mềm SPSS 20.0. Sự khác<br /> g, liên tục trong 14 ngày. Vào ngày thứ 15, biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.<br /> chuột được tiêm phúc mô dầu oliu (lô sinh lý, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> lô tween 5%) hoặc dung dịch CCl4 0,2% pha<br /> trong dầu oliu (tt/tt) cho các lô còn lại, thể tích Khả năng độc tế bào<br /> tiêm 0,1 ml/10 g chuột. Chuột được cho nhịn Kết quả khảo sát hoạt tính độc tế bào gan<br /> đói qua đêm. Vào ngày thứ 16 (24 giờ sau khi HepG2 của các cao Bán chi liên, luteonin,<br /> tiêm phúc mô), mổ lấy máu tim xác định hoạt apigenin so với chất đối chiếu doxorubicin 10<br /> tính ALT, AST bằng phương pháp đo động μg/ml được trình bày trong Bảng 1. Cao<br /> học enzym tại Trung tâm xét nghiệm Medlatex flavonoid nồng độ 65 và 125 μg/ml không làm<br /> và tách gan để quan sát mô bệnh học (đại thể, thay đổi tỷ lệ tế bào sống. Cao flavonoid ở nồng<br /> vi thể) cũng như định lượng MDA, GSH. độ 250, 500, 1000 μg/ml, apigenin 25, 40, 100 μM<br /> Định lượng malonyl dialdehyd (MDA) và và doxorubicin 10 μg/ml ức chế sự tăng trưởng<br /> tế bào (p < 0,01); nồng độ càng cao sự ức chế<br /> glutathion (GSH) trong gan<br /> càng mạnh. Cao cồn ở nồng độ 65, 125, 250, 500,<br /> Sau khi quan sát đại thể, một phần gan được<br /> 1000 μg/ml, luteonin nồng độ 25, 100, 200, 400<br /> cố định trong formol 10% để nhuộm<br /> μM và apigenin 400 μM kích thích sự tăng<br /> hematoxylin-eosin (HE), phân tích vi thể; phần<br /> trưởng của tế bào HepG2 so với mẫu chứng<br /> gan còn lại được nghiền đồng thể trong dung<br /> tương ứng (p < 0,01). Như vậy, cao cồn ở nồng<br /> dịch KCl 1,15% theo tỉ lệ 1g:10 ml ở 0-4°C. Lấy 2<br /> độ 65 - 1000 μg/ml, cao flavonoid 65, 125 μg/ml<br /> ml dịch đồng thể, thêm 1 ml đệm Tris-HCl ủ<br /> và luteonin ở nồng độ 25- 400 μM không thể<br /> 37°C trong 60 phút. Thêm 1 ml acid tricloacetic<br /> hiện hoạt tính độc tế bào. Do đó, chọn 3 mẫu thử<br /> 10%, ly tâm 15 phút 10000 vòng/phút ở 4°C. Lấy<br /> này để khảo sát khả năng chống oxy hóa và bảo<br /> 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid<br /> vệ gan trong các thử nghiệm sau.<br /> thiobarbituric 0,8% ở 100°C trong 15 phút, đo<br /> OD ở 532 nm để định lượng MDA; hoặc lấy 1 ml<br /> dịch trong cho phản ứng với 1,8 ml đệm<br /> Bảng 1: Hoạt tính độc tế bào gan HepG2 của các cao Bán chi liên, luteonin và apigenin sau 24 giờ<br /> Lô Nồng độ OD trung bình ± SEM<br /> 0,25% 0,212 ± 0,005<br /> % tăng số lượng tế bào sống so với<br /> DMSO 0,5% 0,197 ± 0,005 Mẫu chứng<br /> mẫu chứng<br /> 1% 0,181 ± 0,001<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 198 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Lô Nồng độ OD trung bình ± SEM<br /> 65 µg/ml 0,243 ± 0,007** 0,212 14,60<br /> 125 µg/ml 0,252 ± 0,015* 0,212 18,84<br /> Cao cồn toàn phần 250 µg/ml 0,236 ± 0,011 0,212 11,30<br /> 500 µg/ml 0,233 ± 0,004** 0,197 18,37<br /> 1000 µg/ml 0,208 ± 0,009** 0,181 15,13<br /> 65 µg/ml 0,216 ± 0,005 0,212 1,57<br /> 125 µg/ml 0,226 ± 0,005 0,212 6,28<br /> Cao flavonoid 250 µg/ml 0,181 ± 0,001** 0,212 -14,85<br /> 500 µg/ml 0,155 ± 0,005** 0,197 -21,37<br /> 1000 µg/ml 0,127 ± 0,002** 0,181 -29,50<br /> 25 µM 0,236 ± 0,003** 0,212 11,30<br /> 50 µM 0,235 ± 0,009 0,212 10,83<br /> Luteolin 100 µM 0,230 ± 0,003* 0,212 8,16<br /> 200 µM 0,224 ± 0,004** 0,197 13,63<br /> 400 µM 0,206 ± 0,004** 0,181 13,84<br /> 25 µM 0,175 ± 0,003** 0,212 -17,74<br /> 50 µM 0,167 ± 0,005** 0,212 -21,27<br /> Apigenin 100 µM 0,191 ± 0,007* 0,212 -10,05<br /> 200 µM 0,182 ± 0,011 0,197 -7,37<br /> 400 µM 0,199 ± 0,020 0,181 10,15<br /> Doxorubicin 10 µg/ml 0,151 ± 0,002** 0,212 -28,73<br /> * p < 0,05 và ** p < 0,05 so với mẫu chứng tương ứng Phương pháp định lượng MDA: Các gốc tự<br /> Hoạt tính chống oxy hoá in vitro do gây peroxy hóa lipid tạo sản phẩm MDA<br /> phản ứng với acid thiobarbituric cho phức<br /> Phương pháp DPPH: Thuốc thử DPPH là gốc<br /> trimethin màu hồng. Mẫu thử có hoạt tính chống<br /> tự do có màu tím nhờ vào điện tử N không ghép<br /> oxy hoá làm giảm lượng MDA sinh ra. Kết quả<br /> đôi, khi gặp chất chống oxy hoá có khả năng<br /> cho thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán<br /> nhường điện tử cho N thì màu tím mất đi. Kết<br /> chi liên có nồng độ càng lớn, độ hấp thu của<br /> quả cho thấy khi tác dụng với mẫu cao hoặc hoạt<br /> dung dịch sản phẩm càng giảm. Như vậy, các<br /> chất nồng độ càng lớn, màu tím của DPPH càng<br /> mẫu thử từ Bán chi liên có hoạt tính chống oxy<br /> giảm. Điều đó chứng tỏ các cao cồn, cao<br /> flavonoid, luteolin từ Bán chi liên có hoạt tính hoá in vitro, ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế<br /> bào. Phương trình tuyến tính về hoạt tính chống<br /> chống oxy hoá in vitro theo cơ chế bắt gốc tự do,<br /> oxy hoá theo nồng độ mẫu thử và IC50 được trình<br /> phản ứng với DPPH làm giảm màu của gốc tự<br /> bày trong Bảng 2.<br /> do này.<br /> Bảng 2: Phương trình tuyến tính và giá trị IC50 của mẫu thử và chất đối chứng quercetin<br /> 2<br /> Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị R Giá trị IC50 (μg/ml)<br /> Phương pháp DPPH<br /> Cao cồn toàn phần y = 0,344x + 11,89 0,991 110,78<br /> Cao flavonoid y = 1,469x + 6,19 0,975 29,82<br /> Luteolin y = 1,699x + 16,22 0,979 58,03<br /> Quercetin y = 8,544x – 4,66 0,978 6,38<br /> Phương pháp định lượng MDA<br /> Cao cồn toàn phần y = 0,297x + 17,23 0,986 25,61<br /> Cao flavonoid y = 1,699x + 16,22 0,979 19,88<br /> Luteolin y = 1,699x + 16,22 0,979 10,16<br /> Quercetin y = 2,920x - 20,32 0,958 25,61<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 199<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> <br /> Kết quả thử nghiệm DPPH và MDA cho cao flavonoid, khi cho uống 0,2 ml/10 g hỗn<br /> thấy cao cồn, cao flavonoid, luteolin từ Bán chi dịch nồng độ tối đa qua kim 122 mg cao/ml<br /> liên có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế bắt (tương đương liều 2,24 g/kg), tất cả 12 chuột<br /> gốc tự do, hạn chế quá trình peroxyd hóa lipid. đều sống khỏe mạnh, không có dấu hiệu bất<br /> Tác dụng này phù hợp với nghiên cứu trước đây thường trong 72 giờ cũng như trong 14 ngày.<br /> báo cáo dịch chiết cồn Bán chi liên có hoạt tính Chuột chết trong thử nghiệm và sống sau 14<br /> chống oxy hóa với IC50 là 78,8 μg/ml(7). Báo cáo ngày được gây mê bằng đá CO2, mổ, quan sát<br /> cũng cho thấy chất barbatin B và scutebarbatin A cho thấy không có sự thay đổi về đại thể của các<br /> trong Bán chi liên thể hiện hoạt tính chống oxy cơ quan phổi, tim, gan, thận, hệ tiêu hóa.<br /> hóa cao với giá trị IC50 lần lượt là 10,42 và 2,8 Như vậy, cao cồn có LD0 là 16 g cao/kg và<br /> μg/ml. Trong đề tài này, cao cồn có hoạt tính cao flavonoid không có độc tính cấp đường uống<br /> chống oxy hóa thấp hơn cao flavonoid và ở liều Dmax là 2,24 g cao/kg. Từ đó, chọn khảo sát<br /> luteonin. tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột<br /> Độc tính cấp đường uống của cao cồn và nhắt với liều của cao cồn là 800 mg/kg và 1600<br /> cao flavonoid từ Bán chi liên mg/kg (1/20 và 1/10 LD0); cao flavonoid là 80<br /> Chuột chứng uống nước cất hoặc tween 80 mg/kg và 160 mg/kg (nhỏ hơn 1/5 Dmax) do cao<br /> nồng độ 5% (tt/tt) đều sống khỏe mạnh, ăn cám flavonoid có hiệu xuất chiết từ cao cồn là 10%.<br /> viên, uống nước, tiêu tiểu, cử động bình thường Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo<br /> trong 72 giờ và trong 14 ngày. Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao<br /> Ở liều tối đa có thể cho uống 20 g cao Bán chi liên trên chuột nhắt gây tổn thương gan<br /> cồn/kg, có 2/6 chuột chết và 4/6 chuột sống sau bằng carbon tetraclorid 0,2% (tt/tt) pha trong dầu<br /> 72 giờ. Ở liều 10 g cao/kg, không có chuột chết. ô liu.<br /> Tiến hành với 4 liều 12, 14, 16 và 18 g/kg (6 Tác động trên hoạt tính men gan ALT, AST<br /> chuột/liều) cho thấy ở các liều 12, 14 và 16 g/kg<br /> Kết quả khảo sát hoạt tính men gan ALT,<br /> không chuột nào chết. Ở liều 18 g/kg, có 1/6<br /> AST được trình bày trong Bảng 3.<br /> chuột chết và 5/6 chuột sống sau 72 giờ. Kết<br /> quả ở liều 17 g/kg tương tự liều 18 g/kg. Với<br /> Bảng 3: Chỉ số ALT và AST của các lô chuột thử nghiệm<br /> Lô Số chuột ALT (U/L) AST (U/L)<br /> Sinh lý 10 52 ± 5,0 196,8 ± 19,9<br /> Tween 5% 8 62,4 ± 3,8 200,5 ± 24,5<br /> ### ###<br /> Chứng bệnh 10 392,2 ± 41,5 610,1 ± 96,7<br /> ### ###<br /> Chứng bệnh + tween 5% 8 426,5 ± 43,6 503,7 ± 34,4<br /> Đối chiếu silymarin 100 mg/kg 10 59,8 ± 5,0*** 152,9 ± 11,8***<br /> ##@ @<br /> Cao cồn 1600 mg/kg 10 81,3 ± 5,7*** 211,6 ± 20,7***<br /> ##@@<br /> Cao cồn 800 mg/kg 10 90,1 ± 8,7*** 216,0 ± 21,7***<br /> Cao flavonoid 160 mg/kg 10 65,6 ± 5,3*** 243,7 ± 22,9***<br /> Cao flavonoid 80 mg/kg 10 71,5 ± 5,9*** 207,3 ± 25,6***<br /> ##<br /> p < 0,01; ###p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5%; ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5%<br /> @p < 0,05; @@ p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin<br /> Hoạt tính ALT, AST khác biệt không có ý Ở lô chứng bệnh, ALT tăng gấp 7,5 lần và<br /> nghĩa thống kê giữa lô sinh lý với lô tween 5% AST tăng gấp 3,1 lần so với lô sinh lý (p < 0,001).<br /> hay giữa lô chứng bệnh với lô CCl4+ tween 5%; Chứng tỏ CCl4 0,2% (tt/tt) trong dầu ô liu đã gây<br /> chứng tỏ tween 5% không gây tổn thương gan. tổn thương tế bào gan thành công làm phóng<br /> <br /> <br /> <br /> 200 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> thích ALT, AST ra dịch ngoại bào, làm tăng nồng liều 80 mg/kg giảm 2,4 lần. Như vây, cao cồn Bán<br /> độ trong máu. chi liên giảm hoạt tính ALT kém hơn còn cao<br /> Hoạt tính ALT, AST ở chuột uống cao thử và flavonoid làm giảm hoạt tính ALT tương đương<br /> silymarin giảm có ý nghĩa thống kê so với lô silymarin giúp các chỉ số này trở về gần mức của<br /> chứng bệnh hoặc lô chứng bệnh uống tween 5% chuột sinh lý.<br /> (p < 0,001). Cụ thể: ALT của lô silymarin liều 100 Tác động trên hàm lượng MDA, GSH<br /> mg/kg làm giảm 6,6 lần, lô cao cồn liều 1600 trong gan<br /> mg/kg giảm 4,8 lần, liều 800 mg/kg giảm 4,4 lần<br /> Dựa vào phương trình tuyến tính của MDA<br /> so với lô chứng bệnh; cao flavonoid liều 160<br /> chuẩn y = 0,09x + 0,092 (R2: 0,983); GSH chuẩn<br /> mg/kg giảm 6,5 lần, liều 80 mg/kg giảm 6,0 lần so<br /> y = 0,003x + 0,049 (R2: 0,990), hàm lượng MDA,<br /> với lô CCl4 + tween 5%. Tương tự, với AST,<br /> GSH của chuột được xác định và trình bày ở<br /> silymarin 100 mg/kg làm giảm 4,0 lần, cao cồn<br /> Bảng 4.<br /> liều 1600 mg/kg và 800 mg/kg đều làm giảm 2,9<br /> lần; cao flavonoid liều 160 mg/kg giảm 2,0 lần,<br /> Bảng 4: Hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột của các lô thử nghiệm<br /> Lô Số chuột MDA (nmol/g protein) GSH (nmol/g protein)<br /> Sinh lý 10 182,9 ± 8,1 732,5 ± 27,3<br /> Tween 5% 8 163,3 ± 9,6 664,3 ± 23,7<br /> ### ###<br /> Chứng bệnh 10 271,6 ± 16,4 488,7 ± 35,2<br /> ### ###<br /> Chứng bệnh + tween 5% 8 257,6 ± 6,7 409,5 ± 11,0<br /> ***###<br /> Đối chiếu silymarin 100 mg/kg 10 192,2 ± 8,1*** 555,1 ± 29,3<br /> **@<br /> Cao cồn 1600 mg/kg 10 171,9 ± 8,3*** 650,3 ± 34,9<br /> **##<br /> Cao cồn 800 mg/kg 10 183,6 ± 9,5*** 590,6 ± 31,8<br /> ***<br /> Cao flavonoid 160 mg/kg 10 157,1 ± 7,0*** 674,2 ± 26,6<br /> **<br /> Cao flavonoid 80 mg/kg 10 152,5 ± 6,5*** 655,2 ± 32,5<br /> ##<br /> p < 0,01; ###p < 0,001 so với lô sinh lý/tween 5% ***p < 0,001 so với lô chứng bệnh/chứng bệnh + tween 5%<br /> @p < 0,05; @@ p < 0,01 so lô cao cồn với lô đối chiếu silymarin<br /> Kết quả cho thấy lượng MDA, GSH khác biệt lượng GSH, cao flavonoid làm tăng 1,6 lần, cao<br /> không có ý nghĩa thống kê giữa lô sinh lý với lô cồn làm tăng 1,2-1,3 trong khi silymarin làm tăng<br /> tween 5% cũng như giữa lô chứng bệnh với lô 1,1 lần. Điều này bước đầu cho thấy cao<br /> chứng bệnh + tween 5%. Điều đó chứng tỏ uống flavonoid có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ<br /> tween 5% không ảnh hưởng đến hàm lượng gan tốt hơn silymarin.<br /> MDA, GSH trong gan. Khi tiêm CCl4 0,2%, ở lô Về đại thể, tất cả gan chuột sinh lý hoặc<br /> chứng bệnh lượng MDA tăng gấp 1,5 lần; GSH chuột uống tween 5% có màu đỏ, mặt nhẵn, mật<br /> giảm gấp 1,5 lần so với lô sinh lý (p < 0,001). Như độ mềm, không phù nề, không sung huyết.<br /> vậy, CCl4 đã gây tổn thương tế bào gan làm tăng Chuột ở lô chứng bệnh và lô chứng bệnh uống<br /> sinh các gốc oxy tự do. tween 5%, gan nhạt màu, phù nề, sung huyết, bề<br /> Ở các lô cao thử và silymarin, hàm lượng mặt có chỗ bạc màu hoặc không trơn láng, có<br /> MDA thấp hơn và lượng GSH trong gan cao hơn chấm xuất huyết hoặc chấm trắng nhô lên.<br /> có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh hoặc lô Chuột uống cao toàn phần và cao flavonoid Bán<br /> chứng bệnh uống tween 5% (p < 0,001). Cao cồn chi liên, silymarin, có gan màu đỏ, bề mặt nhẵn,<br /> và cao flavonoid đều làm giảm hàm lượng MDA không phù nề, không sung huyết.<br /> khoảng 1,6 lần so với lô chứng bệnh hoặc lô Cao cồn 50% và cao flavonoid Bán chi liên<br /> chứng bệnh uống tween 5% trong khi lô làm giảm tổn thương gan trên vi thể ở chuột gây<br /> silymarin làm giảm khoảng 1,4 lần. Đối với hàm viêm gan bằng CCl4 (Hình 1). Kết quả vi thể<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 201<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> ngẫu nhiên 6 mẫu gan mỗi lô được trình bày trong Bảng 5.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Nhu mô gan bình thường Tĩnh mạch trung tâm bình thường Khoảng cửa bình thường<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hoại tử trong tiểu thùy Hoại tử quanh khoảng cửa Viêm quanh khoảng cửa<br /> Hình 1: Hình ảnh vi thể tế bào gan chuột (nhuộm HE)<br /> Bảng 5: Kết quả phân tích vi thể tế bào gan của các lô chuột thử nghiệm<br /> Lô Kết quả phân tích vi thể<br /> 4/6 mẫu nhu mô gan bình thường<br /> Sinh lý<br /> 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> 3/6 mẫu bình thường<br /> Tween 5% 2/6 viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> 1/6 rải rác có vài ổ bị vôi hóa, hoại tử trong tiểu thùy<br /> 2/6 mẫu bình thường<br /> Chứng bệnh 4/6 mẫu viêm gan (hoạt tử và thoái hóa tĩnh mạch trung tâm, viêm gan cấp tính áp xe hóa trên nền<br /> viêm gan tối thiểu)<br /> CCl4 + tween 5% 6/6 mẫu viêm gan (hoại tử và thoái hóa quanh tĩnh mạch trung tâm)<br /> Silymarin 4/6 mẫu bình thường<br /> 100 mg/kg 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> Cao cồn 3/6 mẫu bình thường<br /> 1600 mg/kg 3/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> 2/6 mẫu bình thường<br /> Cao cồn<br /> 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu<br /> 800 mg/kg<br /> 2/6 viêm gan (hoại tử và thoái hóa ở quanh tĩnh mạch trung tâm)<br /> Cao flavonoid 4/6 mẫu bình thường<br /> 160 mg/kg 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> Cao flavonoid 4/6 mẫu bình thường<br /> 80 mg/kg 2/6 mẫu viêm gan mức độ tối thiểu (viêm quanh khoảng cửa, hoại tử trong tiểu thùy)<br /> Như vậy, cao cồn, cao flavonoid của Bán chi ở các lô thử nghiệm. Điều này hoàn toàn phù<br /> liên trong đề tài này đã cho tác động chống oxy hợp với báo cáo trước đây về tác động chống oxy<br /> hóa, bảo vệ gan hiệu quả. Kết quả làm giảm tình hóa, bảo vệ gan của Bán chi liên(5). Về cơ chế, tác<br /> trạng tăng hoạt tính ALT, AST huyết tương và động này của các cao Bán chi liên có thể giải<br /> lượng MDA sinh ra trong gan, làm tăng lượng thích do trong thành phần hoạt chất có hàm<br /> GSH gan trở phù hợp với những quan sát đại thể lượng lớn các flavonoid, nhóm chất có khả năng<br /> và phân tích vi thể cấu trúc tế bào gan của chuột chống oxy hóa mạnh, theo nhiều cơ chế khác<br /> <br /> <br /> <br /> 202 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> nhau như đánh bắt gốc tự do trực tiếp, thông 5. Lin CC, Shieh DE (1997). Hepatoprotective effect of the<br /> fractions of Ban-zhi-lian on experimental liver injuries in<br /> qua oxid nitric sau đó đánh bắt oxid nitric, ức rats, Journal of Ethnopharmacology, 56, 193 - 200.<br /> chế hoạt động của xanthin oxidase, giảm bạch 6. Nguyễn Bảo Trân, Trần Quang Vinh, Nguyễn Ngọc Khôi<br /> (2011). Tác dụng chống oxy hoá và bảo vệ gan của lá cây<br /> cầu bám dính, ảnh hưởng đến những enzym<br /> chùm ngây (Moringa oleifera Lam. Moringaceae), Tạp chí<br /> khác… (8,10). Dược học, 421: 25-29.<br /> 7. Nguyễn Văn Hùng, Phạm Văn Cường, Đoàn Thị Mai<br /> KẾT LUẬN Hương, Trịnh Thị Thanh Vân, Nguyễn Thị Thu Hà, Đỗ Thị<br /> Thảo, Trần Văn Hiệu (2009). Nghiên cứu thành phần hóa<br /> Cao Bán chi liên không có độc tính cấp<br /> học và hoạt tính sinh học cây Bán chi liên Scutellaria barbata<br /> đường uống ở liều tối đa Dmax là 25,68 g cao/kg D.Don. Tạp chí Hóa học, 47(6): 192-198.<br /> tương đương 51,37 g nấm khô/kg. Uống cao với 8. Pietta PG (2000). Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod.,<br /> 63(7): 1035-42.<br /> liều 5 g/kg trong 7 ngày cho tác động chống oxy 9. Prio RL, Wu X, Schaich K (2005). Standardized methods for<br /> hóa, bảo vệ gan hiệu quả giúp phòng ngừa the determination of antioxydant capacity and phenolics in<br /> những tổn thương do CCl4 0,2% (v/v) gây ra trên food and dietary supplement, J. Agric. Food Chem., 55: 2698A<br /> - J.<br /> chuột nhắt trắng tương đương đối chứng 10. Robert JN, Elsvan N (2001). Flavonoids: a review of probable<br /> silymarin. mechanisms of action and potential applications. Am J Clin<br /> Nutr, 74: 418-25.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 11. Viện dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt<br /> 1. Dai ZJ, Gao J (2011). In Vitro and In Vivo Antitumor Activity Nam, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập I, tr. 172-173.<br /> of Scutellaria barbata Extract on Murine Liver Cancer, 12. Yoichi S, Shiho S (2000). Phytochemical flavones isolated<br /> Molecules, 16: 4389-4400. from Scutellaria barbata and antibacterial activity against<br /> 2. Dai ZJ, Lu WF (2013). Protective Effects of Scutellaria barbata methicillin resistant Staphylococcus. Journal of<br /> Against Rat Liver Tumorigenesis, Asian Pacific J Cancer Prev, Ethnopharmacology, 72: 483-488.<br /> 14(1): 261-265.<br /> 3. Đỗ Trung Đàm (2014). Phương pháp xác định độc tính cấp Ngày nhận bài báo: 30/10/2015<br /> của thuốc, NXB Y học - Hà Nội. Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/11/2015<br /> 4. Đoàn Thị Nhu, Đỗ Trung Đàm, Phạm Duy Mai, Nguyễn Ngày bài báo được đăng: 20/02/2016<br /> Thượng Dong, Nguyễn Thị Thu Hương. Phương pháp<br /> nghiên cứu tác động dược lý của thuốc từ dược thảo, NXB<br /> Khoa Học và Kỹ Thuật, 2006, tr.279-294.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 203<br />