Khảo sát hoạt tính kháng nấm đạo ôn pyricularia oryzae của bộ ư tập vi khuẩn lên men lactic phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống

Chia sẻ: Lý Mân Hạo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày về Vi khuẩn Lactobacillus thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae tiết ra độc tố như acid α – pycolinic (C6H5NO2 ) và pyricularin (C18H14N2O3 ) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn sau 16 giờ cũng thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae từ khi khảo sát bằng phương pháp cấy đối kháng trên đĩa thạch. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát hoạt tính kháng nấm đạo ôn pyricularia oryzae của bộ ư tập vi khuẩn lên men lactic phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM ĐẠO ÔN PYRICULARIA ORYZAE CỦA BỘ Ư TẬP VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG Nguyễn Bảo Trân, Hồ Thị Dưỡng*, Nguyễn Tấn Lộc, Trần Quang, Nguyễn Hoàng Anh Viện Khoa học Ứng dụng (HUTECH), Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Vi khuẩn Lactobacillus thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae tiết ra độc tố như acid α – pycolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Dịch nuôi cấy các chủng vi khuẩn sau 16 giờ cũng thể hiện khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae từ khi khảo sát bằng phương pháp cấy đối kháng trên đ a thạch. Từ khoá: Hoạt tính kháng nấm, nấm Pyricularia oryzae, phương pháp cấy đối kháng, vi khuẩn lên men lactic. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lactobacillus spp. là vi khuẩn gram dương, hình que hoặc hình cầu, không sinh bào tử, sinh acid lactic tạo thành một phần chính của vi khuẩn đường ruột thông thường ở người và động vật. Chúng đẩy mạnh sự kháng lại những sinh vật ngoại sinh nhất là sinh vật mang mầm bệnh, hình thành các hợp chất đối kháng: bacteriocin đồng thời có khả năng ức chế sự phát triển của nấm đạo ôn sinh độc tố acid α – pycolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3). Nấm Pyricularia oryzae là tác nhân gây bệnh đạo ôn, nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 24 – 28oC và ẩm độ không khí là 93% trở lên. Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử là 10 – 30oC. Ở 28oC cường độ sinh bào tử nhanh và mạnh nhưng sức sinh sản giảm dần sau 9 ngày, trong khi đó ở 16oC, 20oC và 24oC sự sinh sản tăng và kéo dài tới 15 ngày sau đó mới giảm xuống. Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy quá trình sinh sản bào tử của nấm. Bào tử nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24 – 28oC và có giọt nước. Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và ánh sáng. Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24oC và ẩm độ bão hòa là thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây. Trong quá trình gây bệnh nấm tiết ra một số độc tố như acid α – picolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa. Do đó việc phát hiện kịp thời, chính xác tác nhân gây bệnh trên lúa giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp thời để có hiệu quả tốt. 309
Hiện nay, việc sử dụng thuốc hóa học rộng rãi để điều trị bệnh đạo ôn trên cây lúa trong nông nghiệp với những ưu điểm tác dụng nhanh, tương đối đơn giản, đem lại hiệu quả kinh tế cao,... nhưng các hợp chất hóa học dần có những điểm yếu độc hại với môi trường gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, hình thành các loài kháng thuốc, ảnh hưởng đến quần thể sinh vật và đặc biệt ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Việc sử dụng các hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho con người đang là một hướng mở rộng và một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acid lactic [1,2]. Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae của bộ sưu tập sẵn có vi khuẩn lên men lactic của phòng thí nghiệm. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm khoa Vi sinh thuộc Trường Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh. Ký hiệu chủng Nguồn phân lập KC1A Kim chi L5, L3, L1, L10L, L2N Nem chua C1 Cơm mẻ Nấm Pyricularia oryzae phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh đạo ôn là quà tặng của Đại học Cần Thơ. Daconil từ nhà sản xuất Công ty TNHH Việt Thắng. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát tính thuần khiết và đặc điểm nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37 oC trong 16 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37 oC sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy bằng các thí nghiệm sinh lý, sinh hoá gồm: Nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử nghiệm catalase, thử nghiệm khả năng sinh acid lactic (ARNOLD J. P., 1987, [3]), khả năng lên men đường và khả năng di động. 2.2.2 Khảo sát khả năng lên men lactic Nuôi cấy trong môi trường MRS Broth trong vòng 16 giờ, chuẩn độ acid tổng bằng NaOH 0,1N, chỉ thị phenolphtalein đến màu hồng nhạt. Xác định hàm lượng acid tổng quy ra acid lactic theo công thức [3]. V 1.K %Acid lactic  .100 V2 trong đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml). V2: Thể tích nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml). K: Thể tích nuôi cấy đem đi chuẩn độ (Acid lactic là 0,009). 310
2.2.3 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của chủng Lactobacillus spp. L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 với Pyricularia oryzae Chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37 oC trong 24 giờ, tỷ lệ cấy giống là 5%. Môi trường sử dụng là PSA. Chủng nấm lần lượt được đục từ môi trường PSA đã cấy trước đó 3 ngày và đặt vào tâm đ a. Dịch nuôi cấy được cấy 2 đường cách mép đ a 15 mm với 1 nghiệm thức là cấy đồng thời. Theo dõi đường kính phát triển của nấm. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Tính tỷ lệ kháng nấm. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát đặc điểm nuôi cấy Khảo sát tính thuần khiết và đặc điểm nuôi cấy của các chủng vi khuẩn giữ trong bộ sưu tập là cần thiết trước khi thử hoạt tính sinh học của chúng. Trên MRS agar, các chủng Lactobacillus spp. L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 đều thuần khiết, có khuẩn lạc tròn lồi, mép nhẵn, trắng sữa. Các đặc điểm nuôi cấy khác được trình bày ở Bảng 1, cho thấy là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, không có khả năng di động, catalase âm tính, có khả năng sinh acid lactic, lên men đồng hình. Bảng 1: Kết quả hình thái, sinh lý, sinh hoá của chủng Lactobacillus spp. L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 Đặc điểm L5 L3 L1 L2N L10L KC1A C1 Mô tả hình thái Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que dài Nhuộm gram + + + + + + + Nhuộm ào tử - - - - - - - Khả năng di động - - - - - - - Thử nghiệm Catalase - - - - - - - Khả năng sinh acid + + + + + + + lactic (thuốc thử Uffelmann) Lên men đường * + + + + + + + (*glucose, fructose, galactose, mannose, sucrose, lactose, maltose) Các thử nghiệm cho thấy, chủng L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 là giữ đặc điểm của chi Lactobacillus dựa trên Khóa phân loại Bergey. 311
Hình 1: Khuẩn lạc chủng L10L trên môi trường MRS agar và tế bào C1 nhuộm Gram 3.2 Khảo sát khả năng lên men lactic Các chủng vi khuẩn L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 được nuôi cấy trong môi trường MRS Broth trong vòng 16 giờ để xác định hàm lượng acid tổng. Dựa vào Bảng 2, ta thấy chủng L2N sinh acid nhiều nhất 1,63% và chủng C1 có mật độ sinh khối cao nhất là ODhc600nm = 9,036. Bảng 2: Nồng độ acid tổng và sinh khối sau lên men 16 giờ trong môi trường MRS Stt Chủng ật độ (tb/ml) % cid tổng 1 KC1A 3,2.107 1,41 2 C1 4,4.107 1,46 3 L5 2,5.107 1,91 4 L3 4,6.107 1,68 5 L1 3,7.107 1,89 6 L2N 5,1.107 1,63 7 7 L10L 4,4.10 1,68 Bảng 3: Tỷ lệ ức chế nấm (%) của các chủng Lactobacillus spp. với nấm Pyricularia oryzae Cấy khuẩn đồng thời cấy nấm (chi u ngang-chi u dọc) Tỷ lệ ức chế nấm Chủng Lactic (mm) (%) L3 [33 – 36] 47,2 L5 [28,5 – 35,5] 54,4 L2N [31 – 39] 50,4 L10L [28,5 – 32] 54,4 KC1A [33 – 36] 47,2 C1 [30,5 – 35] 51,2 L1 [29,3 – 33] 53,1 Daconil [62,5 – 63,5] 0 312
Đối chứng âm L5 L10L L1 Hình 3: Thí nghiệm đối kháng của Lactobacillus sp. L5, L10L, L1 với nấm Pyricularia oryzae sau 14 ngày đồng nuôi cấy Bảng 3 cho thấy hai chủng L5 và L10L kháng nấm Pyricularia oryzae tốt nhất. 4 KẾT LUẬN Tất cả 7 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. L5, L3, L1, L2N, L10L, KC1A, C1 đều có khả năng kháng nấm ngay cả khi cấy đồng thời. Bản chất các hợp chất kháng nấm trong các chủng là khác nhau. Nghiên cứu kháng nấm in vivo đang được tiến hành. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Laitila A, Alakomi H-L, Raaska L, Mattila-Sandholm T and Haikara A 2002. Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting of barley. Findland : VTT Biotechnology. [2] Kim Jeong Dong A. 2005. Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatus. Inha University, Incheon: Institute of Industrial Biotechnology. [3] ARNOLD J. P, M.D. 1987. ‚A New Test For Lactic Acid In The Gastric Contents And A Method of Estimating Approximately The Quantity Present‛. The Journal of the American Medical Association (JAMA) Vol XXIX, No.08. pp. 371. 313