Khảo sát sự biến đổi gen NAT2 và GSTP1 mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết là mô tả tỷ lệ xuất hiện một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát. Bước đầu xác định mối liên quan giữa một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 với vô sinh nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khảo sát sự biến đổi gen NAT2 và GSTP1 mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic nam giới vô sinh

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI GEN NAT2 VÀ GSTP1 MÃ HÓA ENZYM CHUYỂN HÓA XENOBIOTIC NAM GIỚI VÔ SINH Vũ Thị Huyền*; Nguyễn Thị Trang*; Uông Ngọc Nguyên*; Trần Đức Ph n* TÓM TẮT Mục tiêu: khảo sát đột biến GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) liên quan gây vô sinh (VS) nam. Đối tượng và phương pháp:ADN của 200 đối tượng nghiên cứu (100 nam giới VS và 100 người bình thường) được nhân lên và xác định đột biến gen bằng kỹ thuật ARMS - PCR. Kết quả: các kiểu gen CT và TT của gen NAT2 (481C>T), (OR 3,12; 95%CI: 1,72 - 5,68, p < 0,001) và GA + AAcủa gen GSTP1(G313A) (OR 5,25; 95%CI: 2,71 - 10,19, p < 0,001) có nguy cơ cao gây VS nam. Kết luận: nghiên cứu thí điểm này cho thấy các đa hình GSTP1 (G313A) vàNAT2 (481C>T) là dấu hiệu di truyền mới liên quan với stress oxy hóa và tình trạng VS nguyên phát. * Từ khóa: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Vô sinh nam; Đột biến. Identification of Genetics Polymorphism of Xenobiotic Metabolic Enzymes NAT2 and GSTP1 in Infertile men by ARMS-PCR Method Summary Objectives: To investigate whether two common single-nucleotide polymorphisms (SNP) of the NAT2 gene (481C>T (L161L) and GSTP1 (313G>A (I105V)) were associated with susceptibility to male infertility. Subjects and methods: A total 200 DNA samples (100 infertile patients and 100 fertile men) were genotyped for the polymorphisms by ARMS - PCR. Results: There was a significant association between the NAT2 variant genotypes (CT + TT (481C>T), (OR 3.12; 95%CI: 1.72 - 5.68, p< 0.001) and or NAT2 variant genotypes GSTP1 (G313A), (OR 2.95; 95%CI: 1.51 - 5.79, p < 0.001) with idiopathic infertility risk. Conclusions: This pilot study found that the polymorphisms GSTP1 (481C>T) and NAT2 (590G>A) were some novel genetic markers for susceptibility to idiopathic male infertility, but the risk is potentiated by exposure to various environmental oxidants. * Keyworks: GSTP1; NAT2; Xenobiotic; Infertile men; Mutation. ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh nói chung và VS nam giới nói riêng là một vấn đề sức khỏe sinh sản, gây ảnh hưởng lớn tới chất lượng cuộc sống của nhiều cặp vợ chồng trên toàn thế giới. Một trong những nguyên nhân gây VS mà hiện nay đang được đề cập nhiều đó là sự mất cân bằng trong chuyển hóa các chất của cơ thể, trong đó có chuyển hóa xenobiotic. * Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Vũ Thị Huyền (drhuyenvu@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 29/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017 292 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Xenobiotic là chất hóa học lạ đối với cơ thể, bao gồm các chất được đưa vào cơ thể hàng ngày như thuốc, rượu, thuốc lá, mỹ phẩm, chất bảo quản, thuốc bảo vệ thực vật...Khi quá trình chuyển hóa xenobiotic ở trạng thái cân bằng sẽ giúp cơ thể đào thải, khử độc và tránh được tác động không tốt của xenobiotic đối với cơ thể [1 . Khi quá trình chuyển hóa xenobiotic bị rối loạn, xuất hiện tình trạng tích tụ các xenobiotic và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong cơ thể, bao gồm các gốc tự do không có lợi. Đó là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh, trong đó có VS [2]. Trong quá trình chuyển hóa xenobiotic, NAT2 và GSTP1 là các gen có vai trò quan trọng trong việc mã hóa enzym liên quan đến biến đổi xenobitic ở giai đoạn II, biến đổi thành chất dễ thải trừ ra môi trường. Gen GSTP1 nằm trên NST 11q13.3 và có một số alen phổ biến như GSTP1*A, GSTP1*B, GSTP1*C, GSTP1*D. Thay thế G thành A tại vị trí 313 của exon 5 dẫn đến làm thay thế axít amin isoleucin thành valin tại vị trí 105. Đột biến điểm trên exon 5 này ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu quả của enzym GSTP1[3 . Gen Arylamine N-acetyltransferase 2 (NAT2) nằm trên NST số 8 (8p22), là gen mã hóa enzym NAT2 của giai đoạn II chuyển hóa xenobiotics có vai trò giải độc một số hóa chất như arylamine, hydrazines, các amin thơm và dạng dị vòng để tạo thành các chất trung gian thông qua phản ứng của N-acetyl hóa và O-acetyl hóa. Khi bị đột biến sẽ dẫn đến rối loạn chức năng enzym giải độc, dẫn đến ung thư hoặc VS ở nam giới [4 . Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến gen NAT2 và gen GSTP1 đối với VS ở nam giới được tiến hành ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá sự ảnh hưởng của những gen này. Mục tiêu nghiên cứu:Mô tả tỷ lệ xuất hiện một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 ở nam giới VS nguyên phát. Bước đầu xác định mối liên quan giữa một số đột biến gen NAT2 và GSTP1 với VS nam. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Bệnh nhân nam VS không rõ nguyên nhân trong độ tuổi sinh sản (20 - 50) đã làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại Trung tâm Tư vấn - Di truyền, Đại học Y Hà Nội từ 2015-2017. * Tiêu chuẩn lựa chọn: - Nhóm bệnh: 100 nam giới VS không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng (< 15 triệu, WHO 2010). - Nhóm chứng: 100 nam giới khỏe mạnh, có ít nhất 1 con. * Tiêu chuẩn loại trừ: nam giới VS đã được chẩn đoán xác định nguyên nhân: viêm cơ quan sinh dục, giãn tĩnh mạch tinh, tắc nghẽn đường sinh dục, mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể Y, nhiễm sắc đồ bất thường, nội tiết tố bất thường, bị các bệnh ung thư, cấp tính, tâm thần… 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Tách chiết mẫu ADN từ máu ngoại vi (chống đông EDTA) bằng kit tách ADN Express (Lytech, Nga). Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định đa hình gen GSTP1 (313G>A (I105V), NAT2 (481C>T (L161L) với trình tự mồi: 293 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Bảng 1: Trình tự mồi để khuếch đại 2 gen. Gen GSTP1 Tr nh tự mồi Polymorphism F: 5'- TGGGAGGGATGAGAGTAGGA -3' (313G>A (I105V) NAT2 (exon 5) R: 5'- CAGGGTCTCAAAAGGCTTCAGT-3' 481 С/Т F: 5'-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3' L161L R: 5'-TTGGGTGATACATACACAAG-3' (exon 2) Kỹ thuật ARMS - PCR thực hiện với thể tích 50 μl phản ứng có chứa 5µl (50100 ng) ADN di truyền, trong mỗi ống (allen bình thườnghoặc allen đột biến) 17,5 µl đệm PCR, 2,5 µl primer mix (mồi bình thường hoặc mồi đột biến), 0,2 Taq ADN polymerase và 25 µl dầu khoáng (Lytech, Nga) với chu trình luân nhiệt: 930C/1 phút; 35 chu kì (93oC/10s, 64oC/10s, 72oC/20s), 72oC/10 phút. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên thạch agarose 3% để xác định kiểu gen của đối tượng nghiên cứu. * Xử lý số liệu:số liệu được thu thập và xử lý trên phần mềm SPSS 16.0. * Đạo đức nghiên cứu: BN hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen. Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật. KÊT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Ph n bố tuổi của nhóm nghiên cứu. Bảng 2: Phân bố nhóm tuổi của nhóm bệnh và nhóm chứng. Nhóm chứng Tuổi Nhóm bệnh p % n % 20 - 29 40 40,0 27 27,0 30 - 39 42 42,0 53 53,0 40 - 49 15 15,0 20 20,0 50 - 59 3 3,0 0 0 X ± SD 31,88 ± 6,33 33,95 ± 7,19 p > 0,05 > 0,05 Ở cả hai nhóm bệnh và nhóm chứng, nam giới trong độ tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ cao nhất. Độ tuổi chiếm tỷ lệ thấp nhất 50 - 59 tuổi. Tỷ lệ phân bố nhóm tuổi ở cả 2 nhóm bệnh và chứng không có sự khác biệt. 294 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 2. Đặc điểm nội tiết tố ở nhóm nam giới VS. Bảng 3: Đặc điểm nội tiết của nhóm bệnh và nhóm chứng. Nhóm X ± SD (IU/L) n FSH LH Testosteron Nhóm bệnh 100 17,34 ± 3,27 16,33 ± 2,53 13,02 ± 1,62 Nhóm chứng 100 11,62 ± 12,60 6,56 ± 4,19 15,86 ± 5,50 5 - 20 5 - 20 10 - 35 Giới hạn bình thường Giá trị trung bình FSH, LH và testosterone của BN nhóm bệnh và nhóm chứng trong giới hạn bình thường. 3. Kết quả ph n tích đ t biến gen NAT2 C481T ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Bảng 4: Kết quả phân tích gen đột biến gen NAT2 C481T. NAT2 481C>T Nhóm bệnh (n = 100) Nhóm chứng (n = 100) CC 49 (49%) 75 (75%) Chi-squared 14,35 p < 0,001 OR 95%CI 0,32 0,18 - 0,58 3,12 1,72 - 5,68 0,02 - 50,89 CT 51 (51%) 25 (25%) TT 0 (0%) 0 (0%) 1,0 CT+TT 51 (51%) 25 (25%) 3,12 1.72 - 5.68 Tỷ lệ mang người mang kiểu gen CT ở nhóm bệnh là 51%, nhóm chứng là 25%. Không gặp trường hợp nào mang gen TT ở cả hai nhóm. Trường hợp CT+TT gặp ở nhóm bệnh và nhóm chứng lần lượt là 51% và 25% và có nguy cơ cao gây VS nam (OR = 3,12; CI = 1,72 - 5,68). 4. Kết quả ph n tích đ t biến gen GSTP1G313A ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Bảng 5: Kết quả phân tích gen đột biến gen GSTP1 G313A. GSTP1 G313A Nhóm bệnh (n = 100) Nhóm chứng (n = 100) GG 50 (50%) 84 (84%) GA 36 (36%) 16(16%) AA 14 (14%) 0 (0%) GA+AA 50 (50%) 16 (16%) Chi-squared 30,32 p < 0,001 26,14 p < 0,001 OR 95%CI 0,19 0,10 -0,7 2,95 1,1 - 5,79 33,69 1,8 -573,6 5,25 2,1 -10,9 Tỷ lệ người mang kiểu gen GA ở nhóm bệnh là 36%, nhóm chứng 16%. 14% ở nhóm bệnh mang kiểu gen AA, không gặp trường hợp nào mang kiểu gen AA ở nhóm chứng. Kiểu gen GA+AA gặp ở nhóm bệnh và nhóm chứng lần lượt là 50% và 16% có nguy cơ cao gây VS nam với (OR = 5,25; CI = 2,71 - 10,19; p < 0,001). 295 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 BÀN LUẬN Nghiên cứu cho thấy: ở nhóm chứng nam giới VS, tuổi thấp nhất 22, tuổi cao nhất 50, độ tuổi trung bình 31,88 ± 6,33. Trong đó, nhóm tuổi 30 - 39 chiếm tỷ lệ cao nhất (42%). Ở nhóm bệnh, người có độ tuổi thấp nhất 22, cao nhất 49, độ tuổi trung bình 33,95 ± 7,19. Độ tuổi trung bình của 2 nhóm không khác biệt về ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, độ tuổi trung bình ở nhóm nghiên cứu của chúng tôi cao hơn một chút so với nghiên cứu của tác giả Yufeng Quin (2013) tại Trung Quốc (28,41 ± 4,61)[5] và thấp hơn so với các nghiên cứu ở các nước ở phương Tây (Sonia Brahem (2011): 37,65) [6]. Điều này có thể do độ tuổi kết hôn ở Việt Nam thấp hơn so với các nước phương Tây, việc quan tâm đến sức khỏe người dân đãtốt hơn trước. Vì vậy, họ đi khám sớm hơn. Ở phương Tây, nam giới lập gia đình muộn hơn so với Việt Nam, do đó nam giới đi khám và điều trị VS cũng muộn hơn. Trong 100 BN trong nhóm bệnh và nhóm chứng được làm xét nghiệm nội tiết tố. Kết quả cho thấy: nồng độ FSH huyết thanh (17,34 ± 3,27 IU/L) và (11,62 ± 12,60 IU/L), LH huyết thanh (16,33 ± 2,53 IU/L) và (6,56 ± 4,19 IU/L),testosterone huyếtthanh (17,02 ± 5,23 IU/L) và (15,86 ± 5,50 IU/L) trong giới hạn bình thường. Nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù hợp với các tác giả Ngô Xuân Bái (2010) [7 , Shalender Bhashin (2007) [8 . Điều này có thể nghĩ tới giả thiết những trường hợp vô tinh, không có tinh trùng ở nam giới VS có thể là hậu quả của rối loạn về 296 di truyền, trong đó có bất thường về gen. Do đó, ảnh hưởng tới chức năng sản xuất tinh trùng ở ống sinh tinh, trong khi đó hoạt động sản xuất hormon FSH và LH ở tuyến yên, testosteron ở tế bào Leyding vẫn bình thường. Giả thiết này phù hợp với mục đích nghiên cứu của chúng tôi. Mặt khác, đối tượng nghiên cứu trong nhóm bệnh của chúng tôi là những nam giới VS nguyên phát, đã được loại trừ nguyên nhân: viêm cơ quan sinh dục, giãn tĩnh mạch tinh, tắc nghẽn đường sinh dục, mất đoạn nhỏ trên NST Y, nhiễm sắc đồ bất thường, nội tiết tố bất thường... Như vậy, kết quả trên thể hiện các BN trong nhóm bệnh phù hợp với tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu của chúng tôi. Đánh giá đột biến gen NAT2 (C481T) ở nhóm bệnh với kiểu gen dị hợp tử CT (51%) cao hơn ở nhóm chứng (25%) cho thấy nguy cơ VS tăng đáng kể ở những người mang kiểu gen này OR = 3,12; CI = 1,72 - 5,68, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Không gặp trường hợp nào mang kiểu gen đồng hợp tử (TT) ở cả hai nhóm. Nghiên cứu của Yarosh và CS (2014) [9] trên 203 BN VS nam và 227 nam giới bình thường cho kết quả: Ở nhóm bệnh có 46,8% trường hợp dị hợp tử, 34,5% bình thường, 18,7% đồng hợp tử đột biến. Ở nhóm chứng: 51,5% trường hợp dị hợp tử, 34,8% bình thường và 14,1% đồng hợp tử đột biến. Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ phân bố genotype và alen giữa hai nhóm bệnh và nhóm chứng không khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Tuy nhiên, theo