Khảo sát sự biểu hiện của gen mã hóa GmHK07 trong đáp ứng hormone aba và stress hạn ở hai giống đậu tương chịu hạn khác biệt-DT51 và MTD720

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 123­128<br /> Khảo sát sự biểu hi DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> ện của gen mã hóa GmHK07<br /> <br /> <br /> <br /> KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MàHÓA GmHK07 <br /> TRONG ĐÁP ỨNG HORMONE ABA VÀ STRESS HẠN <br /> Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN KHÁC BIỆT­DT51 VÀ MTD720 <br /> <br /> Nguyễn Bình Anh Thư, Đoàn Ngọc Hiếu, Nguyễn Phương Thảo*<br /> Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG HCM, *npthao@hcmiu.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Abscisic acid (ABA) la m ̀ ột phytohormone quan trọng tham gia đáp ứng chống chịu  <br /> stress phi sinh học  ở thực vật. Nghiên cưu s ́ ự biêu hiên đap <br /> ̉ ̣ ́ ứng gen vơi ABA có th<br /> ́ ể  giúp xác  <br /> định các gen tiêm năng có <br /> ̀ ứng dụng quan trọng trong công nghệ  gen nhằm cải tạo tính chống  <br /> chịu vơi stress phi sinh hoc <br /> ́ ̣ ở cây trồng. Trong nghiên cứu này, sự  điều hòa biểu hiện của gen  <br /> GmHK07  được xem xét   ở  hai giống đậu tương chịu hạn tốt DT51 và giống chịu hạn kém  <br /> MTD720 dưới điều kiện xử  lý ABA và điều kiện hạn. Kết quả  qRT­PCR của các mẫu thu từ <br /> cây   đậu  tương  12  ngày  tuổi   được  xử  lý  trong  dung  dịch  ABA  nồng   độ   100  µM  cho  thấy <br /> GmHK07  có sự  giảm biểu hiện đáng kể  cả   ở  mô chôi và r ̀ ễ  của giống MTD720 được xử  lý  <br /> ABA. Hơn nữa, GmHK07 còn có sự  tích lũy cao đáng kể, 158 và 85 lần, trong chôi c ̀ ủa giống  <br /> chịu hạn kém MTD720  ở  điều kiện thường và xử  lý ABA 10 giờ  so với giống chịu hạn tốt  <br /> DT51. Kết quả tương tự được quan sát ở rễ, GmHK07 tích lũy đáng kể tới 195 và 67 lần tương <br /> ứng  ở  giống MTD720 được xử  lý ABA 0 và 10 giờ  so với giống DT51. Dưới điều kiện hạn,  <br /> GmHK07  cũng cho thấy sự  tích lũy cao đáng kể  trong cả  hai mô của MTD720 so với các mô <br /> tương  ứng của DT51. Như vậy,  ở đậu tương, GmHK07 là nhân tố điều hòa âm tính tiềm năng  <br /> không chỉ  trong đáp  ứng hạn mà còn trong đáp  ứng với hormone ABA và có thể   ứng dụng để <br /> tăng tính chống chịu stress phi sinh học ở cây trồng nhờ công nghệ gen.<br /> Từ khóa: Abscisic acid, đậu tương, GmHK07, qRT­PCR, stress phi sinh học, stress hạn.<br /> <br /> MỞ ĐẦU Để  chống chịu hạn, một trong những đáp <br /> ứng sinh lý của thực vật là sự  đóng mở  khí  <br /> Hạn hán là một trong số  những stress phi  <br /> khổng. Hoạt động này của tế  bào khi không ́ ̉  <br /> ̣ chính   tác  động  đến  cây   trồng,   hơn  <br /> sinh   hoc <br /> giúp   điều   hòa   sư   trao   đổi   khí   và   mất   nước <br /> nữa, sự biến đổi khí hậu và sự suy giảm chất <br /> giữa thực vật và môi trường thông qua mạng <br /> lượng   nước   ngọt   đang   làm   gia   tăng   mối   lo <br /> lưới dẫn truyền tín hiệu. Cơ  chế  này không <br /> ngại đáng kể  cho sản xuất nông nghiệp toàn <br /> chỉ  được biết đến như  đáp  ứng của thực vật  <br /> cầu []. Đậu tương (Glycine max) được biết là <br /> với   hạn   thông   qua   sự     gia   tăng   tich ́   luỹ  <br /> một   trong   những   cây   trồng   có   giá   trị   dinh  <br /> hormone ABA mà còn đáp  ứng với các stress <br /> dưỡng cao và sản xuất đậu tương mang lại lợi <br /> ̣<br /> phi sinh hoc khác nh ư ánh sáng, mặn cũng như <br /> ích kinh tế  đáng kể   ở  nhiều quốc gia trên thế <br /> các   stress   sinh   học  ].   Trong   mạng   lưới   dẫn <br /> giới   do nhu  cầu  tiêu dùng  các  sản phẩm   từ <br /> truyền tín hiệu stress, mặc dù sự  phosphoryl  <br /> đậu tương đang ngày một gia tăng. Tuy nhiên,  <br /> hóa được điều khiển bởi hệ  thống hai thành <br /> đậu tương cũng là một trong những cây trồng  <br /> phần (TCS) là cơ chế chính trong sự đóng khí <br /> bị  tác động đáng kể  bởi hạn han, thiêt hai lên<br /> ́ ̣ ̣  <br /> không̉   cảm   ứng   bởi   ABA.   Tuy   nhiên,   vẫn <br /> đến 40% năng suất []. Do đó, nghiên cứu và <br /> không có nhiều bằng chứng về chức năng của <br /> phát triển các giống đậu tương chịu hạn thông <br /> hệ  thống này trong các  tế  bào khi không [ ́ ̉ ]. <br /> qua   kỹ   thuật   di   truyền   là   một   trong   những  <br /> Các thành phần thuộc hệ  thống này đã được  <br /> chiến  lược quan trọng  trong  phát  triển  nông <br /> xác   định   ở   một   số   loài   thực   vật   như <br /> nghiệp và bảo đảm an ninh lương thực.<br /> Arabidopsis, lúa và đậu tương bao gồm protein <br /> tiếp   nhận   tín   hiệu   (HK­histidine   kinase), <br /> <br /> 123<br />  Nguyen Binh Anh Thu et al.<br /> <br /> protein   chuyển   đổi   gốc   phospho   (HP­ con được xử lý hạn bằng cách ngưng t<br /> ̀ ưới <br /> phosphotransfer  protein)   và  nhân  tố   điều  hòa  nước trong thời gian 15 ngày như  nghiên cứu <br /> đáp ứng (RR­response regulator) []. Các nghiên  trước đây ­,].<br /> cứu trước đây của chúng tôi đã xác định vai trò <br /> điều hòa tiềm năng của một số thành viên họ  Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA <br /> TCS   dưới   điều   kiện   stress   hạn  trong  những  Các mẫu rễ và chôi  ̀ của hai giống từ 3 cây <br /> giống đậu tương khác nhau []. Do đó, để  xác  được xử  lý stress và 3 cây đối chứng (3 mẫu  <br /> định vai  trò  của gen này trong  điều  hòa  đáp  sinh học)  được thu nhận tách biệt và nghiền <br /> ứng ABA và đáp ứng hạn nhằm ứng dụng cho  trong nitơ lỏng. RNA tổng số được tách chiết <br /> tăng cường tính chống chịu stress phi sinh hoc̣   và thu nhận bằng bộ  kit GenJET Plant RNA  <br /> ở đậu tương, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR  Purification Mini Kit (Thermo Scientific), đồng <br /> ̣<br /> đinh l ượng để xac đ ́ ịnh mưc đô bi<br /> ́ ̣ ểu hiện của   thời   được   tinh   sạch   loại   bỏ   DNA   bằng <br /> GmHK07 ở giống chịu hạn tốt DT51 và giống  DNaseI   (RapidOut   DNA   removal,   thermo <br /> chịu hạn kém MTD720 được xử lý ABA và xử  scientific). Các mẫu RNA được kiểm tra nồng  <br /> lý hạn sinh lý. Sự  giảm biểu hiện đáng kể  và  độ  bằng máy đo quang phổ  UV­Vis (Biotek,  <br /> sự  tích lũy biểu hiện thấp của GmHK07 ở  rễ  Hoa Kỳ) và được tổng hợp cDNA một mạch  <br /> ̀ ủa giống đậu tương chịu hạn kém khi <br /> và chôi c từ   1   µg   RNA   với   bộ   kit   tổng   hợp   cDNA <br /> xử lý ABA và dưới điều kiện hạn là cơ sở cho  (thermo scientific).<br /> việc   xác   định   vai   trò   điều   hòa   của   gen   này  Phân tích PCR định lượng <br /> trong   việc   ứng   dụng   tạo   giống   đậu   tương <br /> Trình tự  mồi đặc hiêụ  cho GmHK07 được <br /> chống chịu stress hạn cũng như chống chịu cać  <br /> sử dụng theo nghiên cứu của  ]. Nồng độ mồi <br /> ́ ́ ́ ợi phi sinh hoc b<br /> yêu tô bât l ̣ ằng công nghệ gen.<br /> là  0,4 µM  trong thể  tích phản  ứng là   12,5  µl. <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Gen  Fbox  được sử  dụng làm gen tham khảo <br /> để định lượng tương đối biểu hiện gen đích ]. <br /> Vật   liệu   là   hai   giống   đậu   tương   DT51  ̣<br /> Chu ky nhiêt cua<br /> ̀ ̉  phản  ứng PCR định lượng là <br /> (được   cung   câṕ   từ  trung   tâm   nghiên   cứu   và  10 phút  ở  95°C, 40 chu kỳ của 95°C (15 giây)  <br /> phát triển đậu đỗ) và MTD720 (được cung câṕ   và   60°C  (1  phút)   (Realplex  Eppendorf,   Đức). <br /> từ Trung tâm Nghiên cứu đậu tương, trường  Để kiểm tra số lượng sản phẩm được khuếch <br /> Đại   học   Cần   Thơ)   đã   được   phân   tích   đặc  đại,   thực   hiện   phân   tích   đường   cong   nóng <br /> điểm sinh lý tăng trưởng trong nghiên cứu của   chảy bằng cách giữ  15 giây  ở  95°C trước khi <br /> [].  gia tăng từ  60°C lên 95°C. Phương pháp delta <br /> Ct được sử dụng để so sánh tương đối mức độ <br /> Xử lý hormone ABA biểu hiện gen các mô, và giữa các điều kiện <br /> ̣ ương được trông trong đi<br /> Đâu t ̀ ều kiện ánh  xử  lý. Trinh t<br /> ̀ ự  va hiêu qua khuêch đai phan<br /> ̀ ̣ ̉ ́ ̣ ̉  <br /> sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 28­30 C, quang kỳ 12 <br /> o<br /> ứng   Real­time   (E)   cuả   hai   căp<br /> ̣   môì  Fbox  và <br /> giơ tôi/sang. Sau giai đo<br /> ̀ ́ ́ ạn 12 ngày tuổi, cây con  GmHK07  được   phân   tich ́   băng̀   phân ̀   mêm<br /> ̀  <br /> được thu nhận, rửa sạch đất và nuôi trong dung  LinRegPCR 2012.0 (bang 1). ̉<br /> dịch ABA nồng độ  100 µM trong 0 giờ và 10 <br /> giơ (28<br /> ̀ oC, độ ẩm 60%, ánh sáng 200 µMm­2s­1).<br /> Xử lý hạn<br /> ̣ ương được trông trong đi<br /> Đâu t ̀ ều kiện ánh <br /> sáng tự  nhiên, nhiệt độ  từ  28­30oC, quang kỳ <br /> 12 giơ tôi/sang. Sau giai đo<br /> ̀ ́ ́ ạn 12 ngày tuổi, cây<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự mồi đặc trưng va hiêu qua khuêch đai cua các gen đ<br /> ̀ ̣ ̉ ́ ̣ ̉ ược sử dụng trong phân tích  <br /> qRT­PCR<br /> <br /> <br /> 124<br />  Khảo sát sự biểu hiện của gen mã hóa GmHK07<br /> <br /> <br /> ST E<br /> Gen Mồi xuôi (5' 3') Mồi ngược (5' 3')<br /> T<br /> 1 Fbox AGATAGGGAAATTGTGCAGGT CTAATGGCAATTGCAGCTCTC 1,9<br /> 2 GmHK07 TCTCATGCCTCATCACCAT GACCGTATTTGTTTCCCCA 1,9<br /> <br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN GmHK07  dưới điều kiện xử  lý ABA và mức <br /> độ  chống chịu hạn kém của giống đậu tương <br /> Đánh giá sự  biểu hiện gen GmHK07 trong  MTD720 được khảo sát. Dưới điều kiện hạn, <br /> mô   rễ   và   chôì   của   hai   giống   đậu   tương  ở mô rễ và chôi c ̀ ủa hai giống không cho thấy <br /> DT51 và MTD720 dưới  điều kiện hạn và  sự  thay đổi biểu hiện đáng kể  (hình 2).  Dư ̃<br /> xử lý ABA ̣ ̉<br /> liêu cua Le et al. (2011) [3] cung cho thây s ̃ ́ ự <br /> Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi,  ̉<br /> biêu hiên cua  ̣ ̉ gen GmHK07  ở  mô rê cua giông ̃ ̉ ́  <br /> dựa trên sự  đánh giá sinh lý rễ  và chôi, ch ̀ ỉ số  ̣ ương Williams 82 được xử ly mât n<br /> đâu t ́ ́ ươc  ́ ở <br /> chịu hạn và hàm lượng nước tương đối, DT51  2 giơ ̀ và10 gi   ơ ̀ không co s ́ ự  khac biêt so v<br /> ́ ̣ ơí <br /> và   MTD720   đã   được   xác   định   như   những  đôi ch́ ưng ́  0 giơ, tuy nhiên <br /> ̀ ở  mô  chôì  co s ́ ự <br /> giống chịu hạn tốt và kém tương ứng trong số  ́ ̣<br /> khac biêt đang kê 2,5 lân khi x́ ̉ ̀ ử  lý 10 giơ ̀ so <br /> 14 giống đậu tương được khảo sát. Dựa trên  vơi  ́ 0 giơ. Nh ̀ ư  vây, cung v<br /> ̣ ̀ ơi nghiên c<br /> ́ ưu nay,<br /> ́ ̀  <br /> hai giống đậu tương này, chúng tôi tiếp tục  chung tôi ghi nhân<br /> ́ ̣  gen  GmHK07  không  có  sự <br /> phân tích biểu hiện của gen  GmHK07 dưới xử  ̉<br /> biêu hiên đap  ̣ ́ ưng v<br /> ́ ơi stress <br /> ́ ở  mô rê. S ̃ ự  biêủ  <br /> lý hormone ABA vốn là hormone đóng vai trò  ̣<br /> hiên gia tăng cua gen nay  ̉ ̀ ở  mô chôì khi xử  lý <br /> quan trọng trong điều hòa đáp ứng hạn để xác  mât n ́ ươc cho thây s<br /> ́ ́ ự  biêu hiên cua gen nay la<br /> ̉ ̣ ̉ ̀ ̀ <br /> định vai trò của gen này trong sự  dẫn truyền  ̣<br /> phu thuôc mô, ph ̣ ụ  thuộc vào giông đâu t ́ ̣ ương <br /> tín hiệu ABA. Kết quả cho thấy sự giảm biểu   ̀ ương phap x<br /> va ph ́ ử ly han.<br /> ́ ̣<br /> hiện của GmHK07 được quan sát trong cả mô  Trong cơ chế đáp ứng hạn, thực vật có hai <br /> rễ  (6,4 lần) và chôi (2,5 l<br /> ̀ ần) của giống đậu  con đường chính để  dẫn truyền tín hiệu đến <br /> tương chịu hạn kém MTD720 dưới điều kiện  điều   hòa   biểu   hiện   gen   đích,   bao   gồm   con <br /> xử  lý ABA 10 giờ so với 0 giờ (hình 1A, 1B).  đường phụ thuộc ABA và con đường độc lập <br /> Trong   khi   ở   giống   đậu   tương   chịu   hạn   tốt  ABA   [].   Như   vậy,   dựa   trên   những   kết   quả <br /> DT51,  GmHK07  không   có   sự   thay   đổi   biểu  trên, có thể  xác định  GmHK07  là yếu tố  phụ <br /> hiện đáng kể ở mô rễ và chôi đ ̀ ược xử lý ABA  thuộc ABA do sự  biểu hiện thay đổi của nó <br /> ở  10 giờ so với 2 giơ. K ̀ ết quả cũng cho thấy  dưới điều kiện xử lý ABA.<br /> rằng, có sự  tương quan giảm biểu hiện của  <br /> <br /> Hình   1.  Sự   biểu   hiện   tương   đối <br /> của  gene  GmHK07  so với  Fbox  ở <br /> mô   rễ   (a)   và   mô   thân  (b)   của   hai <br /> giống MTD720 và DT51 dưới điều <br /> kiện xử  lý ABA  0 giơ ̀ và  10 giơ.̀ <br /> Nồng độ  ABA là 100 µM được xử <br /> lý   khi   cây   tăng   trưởng   được   12 <br /> ngày tuổi. Sự  biểu hiện có ý nghĩa <br /> thống kê được xác định với * (P