Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam được thực hiện với mục tiêu nhằm nhân gen COI của một số vật nuôi: Bò, lợn, dê; diải trình tự gen COI; xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam; đánh giá và so sánh cơ sở dữ liệu DNA barcode của vật nuôi Việt Nam với cơ sở dữ liệu quốc tế. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI CỦA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Thái Nguyên, năm 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUỲNH THỊ THIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU DNA BARCODE CHO MỘT SỐ VẬT NUÔI CỦA VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: K47- CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2014 - 2019 Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Bằng Phương Thái Nguyên, năm 2019
i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm, cùng toàn thể quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy, hướng dẫn em cho tới ngày hôm nay. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phạm Bằng Phương người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em, cùng toàn thể các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã động viên giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị và các bạn làm việc tại Viện khoa học sự sống – ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, kỹ năng và tạo điều kiện để đề tài “Nghiên cứu xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam” được hoàn thành đúng tiến độ và có kết quả tốt. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện tốt nhất luận văn tốt nghiệp, nhưng trong quá trình thực hiện không thể tránh được những thiếu sót nhất định. Vì vậy, em rất mong được sự góp ý của các thầy, cô giáo và các bạn để khóa luận của em được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2019 Sinh viên Huỳnh Thị Thiệp
ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các mẫu thí nghiệm phục vụ quá trình nghiên cứu........................ 20 Bảng 3.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR .................................................... 21 Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị được sử dụng .............................................. 21 Bảng 3.4. Danh mục các loại hóa chất được sử dụng ..................................... 22 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 24 Bảng 4.1: Kết quả đo độ tinh sạch DNA......................................................... 26 Bảng 4.2. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 32 Bảng 4.3. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của 4 mẫu dê nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI ................. 33 Bảng 4.4. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu nghiên cứu và 6 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 36 Bảng 4.5. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 6 trình tự đã được công bố trên NCBI ............................. 37 Bảng 4.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu và 3 mẫu đã được công bố trên NCBI ....................... 40 Bảng 4.7. Hệ số tương đồng khi phân tích trình tự gen COI của mẫu nghiên cứu với 3 trình tự đã được công bố trên NCBI ............................. 41
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Lợn Landrace .................................................................................... 5 Hình 2.2. Bò Vàng ............................................................................................ 6 Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình............................................................................... 8 Hình 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai .................................. 26 Hình 4.2a. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu DH1, DH2,DN1, DN2..... 27 Hình 4.2b. Kết quả PCR chỉ thị COI của các mẫu B, L.................................. 27 Hình 4.3: Kết quả giải trình tự chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu theo giái trị QV ............................................................................................... 29 Hình 4.4: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Capra hircus đã công bố trên NCBI .......................................... 30 Hình 4.5. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của 4 mẫu nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI .......... 31 Hình 4.6: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu DH1 với chỉ thị COI của Gallus gallus đã công bố trên NCBI........................................... 34 Hình 4.7: Kết quả BLAST chỉ thị COI của mẫu L với chỉ thị COI của Sus scrofa đã công bố trên NCBI ...................................................... 35 Hình 4.8. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu L nghiên cứu với 6 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI ...... 36 Hình 4.9. Kết quả so sánh khác loài ................................................................ 38 Hình 4.10: Kết quả BLAST chỉ thị COI của Mẫu B với chỉ thị COI của Bos taurus đã công bố trên NCBI ...................................................... 39 Hình 4.11. So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide chỉ thị COI của mẫu B nghiên cứu với 3 chỉ thị COI đã công bố trên NCBI ...... 40 Hình 4.12: Kết quả so sánh trình tự khác loài................................................. 42
iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bp Base pair – cặp bazơ nitơ COI Cytochrome C oxidase Subutnit I Cytb Cytochrome b dATP DeoxyAdenine Triphosphate dCTP DeoxyCytosine Triphosphate ddATP DideoxyAdenine Triphosphate ddCTP DideoxyCytosine Triphosphate ddGTP DideoxyGuanine Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate ddTTP DideoxyThymine Triphosphate dGTP DeoxyGuanine Triphosphate DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate dTTP DeoxyThymine Triphosphate EDTA Etilendiamin tetraaxetic acit GPS Global Positioning System ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilo base – Kilo bazo nito matK Maturase K NCBI Nation Cetrer for Biotechnology Information (trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học) PCR Polymerase Chain Recation QV Quality value RPM Revolutions Per Minute SDS Sodium Dodecyl Sulfate
v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ ii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv MỤC LỤC ......................................................................................................... v Phần 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát ................................................................................... 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài...................................................................... 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam ....................................... 4 2.1.1. Tổng quan về lợn...................................................................................... 4 2.1.2. Tổng quan về bò vàng .............................................................................. 6 2.1.3 Tổng quan về dê ........................................................................................ 7 2.2. Cơ sở khoa học của đề tài .......................................................................... 9 2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA ........................................................................ 9 2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số....................................................... 11
vi 2.4. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose ........................................... 12 2.5. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 13 2.6. Phương pháp xác định các trình tự nucleotide ......................................... 14 2.7. Tình hình nghiên cứu DNA mã vạch trong và ngoài nước...................... 15 2.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 15 2.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................... 17 Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 20 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................. 20 3.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 21 3.2.1. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 21 3.2.2. Hóa chất................................................................................................. 22 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 22 3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23 3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23 3.5.1. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................. 23 3.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số.................................................... 23 3.5.3. Phương pháp PCR .................................................................................. 24 3.5.4. Phương pháp xác định trình tự các nucleotide ....................................... 25 3.5.5. Phân tích dữ liệu..................................................................................... 25 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 26 4.1. Kết quả tách DNA tổng số ....................................................................... 26
vii 4.2 Kết quả PCR khuếch đại chỉ thị COI ........................................................ 27 4.3. Kết quả phân tích các chỉ thị DNA bacoding .......................................... 28 4.3.1. Kết quả phân tích chất lượng giải trình tự ............................................. 28 4.4. Kết quả so sánh, phân tích chỉ thị COI các mẫu nghiên cứu ................... 30 4.4.1. Chỉ thị COI của mẫu dê.......................................................................... 30 4.4.2. Chỉ thị COI của mẫu lợn ........................................................................ 34 4.4.3. Chỉ thị COI của mẫu bò ......................................................................... 38 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 43 5.1. Kết luận .................................................................................................... 43 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44 PHỤ LỤC
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi ở Việt Nam là một bộ phận quan trọng cấu thành của nền nông nghiệp cũng như một bộ phận quan trọng của nền kinh tế Việt Nam. Tình hình chăn nuôi phản ánh thực trạng sử dụng, khai thác, chế biến và tiêu thụ các sản phẩm động vật. Các sản phẩm từ vật nuôi là một nguồn cung cấp thực phẩm với tỷ trọng cao, chất lượng tốt và giá trị dinh dưỡng lớn cho con người, các sản phẩm phụ như da, mỡ, thịt là nguồn cung cấp cho các ngành công nghiệp chế biến khác. Đồng thời phụ phẩm của ngành chăn nuôi là một nguồn cung cấp phân bón hữu cơ cho trồng trọt. Để phục vụ các nhu cầu ngày càng lớn của xã hội, việc chọn lọc và phát triển các giống vật nuôi ngày càng được chú trọng. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc, xác định giống vật nuôi bằng chỉ thị phân tử, trong đó có các nghiên cứu về phương pháp “DNA barcode” (mã vạch DNA). Đây là phương pháp xác định nhanh chóng cho một cơ thể sinh vật tới cấp độ loài. Về nguyên tắc mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong genome của sinh vật như là một chuỗi ký tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau. Phương pháp này đã được ví tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm khác nhau mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau. Như vậy, phương pháp mã vạch DNA là một phương pháp định danh có thể xác định giống vật nuôi tới cấp độ loài. Những nghiên cứu mã vạch DNA là cơ sở vững chắc đáng tin cậy cho những nghiên cứu phân loại dựa trên hình thái, là sự phát triển tất yếu và có tính kế thừa từ các nghiên cứu phân loại học trước đây.
2 Một trong những gen được sử dụng để xác định loài ở động vật có vú là gen COI. Gen COI có thể đóng vai trò là trình tự dùng để phân biệt các loài vật nuôi có quan hệ gần và đây cũng là trình tự bảo thủ giữa các thành viên của loài. Điều này gợi ý rằng sử dụng phương pháp mã vạch DNA sẽ có hiệu quả trên nhiều loài sinh vật. Xuất phát từ những giá trị khoa học và thực tiễn, dựa trên những cơ sở khoa học về trình tự gen đã biết, nhằm đóng ghóp, bổ sung những trình tự DNA phục vụ cho mục đích xác định loài vật nuôi, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xây dựng DNA barcode cho một số vật nuôi tại Việt Nam 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Nhân gen COI của một số vật nuôi: Bò, lợn, dê - Giải trình tự gen COI - Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số vật nuôi của Việt Nam - Đánh giá và so sánh cơ sở dữ liệu DNA barcode của vật nuôi Việt Nam với cơ sở dữ liệu quốc tế 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA barcode cho một số giống vật nuôi như bò, lợn, dê của Việt Nam.
3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo tồn nguồn gen động vật nuôi có giá trị của Việt Nam. - Tạo cơ sở dữ liệu cho các các nghiên cứu khoa học sau này.
4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đối tượng vật nuôi phổ biến ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghề chăn nuôi có vai trò rất quan trọng. Ở nhiều địa phương, đây là nghề đem lại thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình. Một số giống vật nuôi được người dân chăn nuôi trên các quy mô lớn, đem lại thu nhập ổn định cho người dân. Trong thời gian thực hiện đề tài, một số giống vật nuôi như: Lợn, bò, dê được lựa chọn để xây dựng DNA barcode (mã vạch DNA). 2.1.1. Tổng quan về lợn Lợn thuộc lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ lợn (Suidae), thuộc chi lợn (Sus), loài lợn rừng (Sus scrofa). Một trong các giống lợn được nuôi nhiều nhất ở Việt Nam là lợn Landrace. Lợn Landrace có nguồn gốc từ Đan Mạch được hình thành vào khoảng 1924–1925 do quá trình tạp giao giữa các giống lợn đến từ Anh, Tây Ban Nha, Ý, Bồ Đào Nha, Trung Quốc tạo thành. Theo nhiều tài liệu, chúng được tạo thành bởi quá trình lai tạo chính giữa giống lợn Youtland có nguồn gốc từ Đức với lợn Yorkshire có nguồn gốc từ Anh. Giống lợn này chủ yếu được nuôi nhiều ở Đan Mạch. Sau năm 1990, chúng được chọn lọc và có năng suất cao nên được nuôi nhiều ở các nước Châu Âu. Hiện nay giống lợn này được xuất đi khắp nơi để cải thiện giống lợn của nhiều nước và trở thành các giống “Lợn Landrace Mỹ”, “Lợn Landrace Anh”, “Lợn Landrace Pháp”, “Lợn Landrace Canada”, giống này cũng đã được nhập vào Việt Nam và nuôi trên diện rộng. Lợn Landrace được coi là giống lợn tốt nhất trên thế giới hiện nay và được nuôi rất phổ biến ở nhiều nơi, giống lợn này vừa có tỷ lệ nạc cao vừa có
5 thể để nái, rất thích hợp cho hộ chăn nuôi và trang trại. Giống lợn này được nhập vào Việt Nam vào khoảng năm 1970 qua Cuba. Giống lợn Landrace là một trong những giống tốt để thực hiên chương trình nạc hóa đàn lợn của Vệt Nam.[20] Ngoại hình lợn Landrace có màu trắng tuyền, đầu nhỏ, dài, tai to rủ xuống kín mặt, tai cúp về phía trước, cổ nhỏ và dài, vai-lưng-mông-đùi rất phát triển, mông đùi to, mõm thẳng, mông nở, ngoại hình thể chất vững chắc. Toàn thân có dáng hình thoi nhọn, do chúng nhiều hơn các giống lợn khác 1- 2 đôi xương sường nên thân hình rất dài. Đây là giống lợn tiêu biểu cho hướng nạc. Lợn có khả năng tăng trọng từ 750 – 800 g/ngày, 6 tháng tuổi lợn thịt có thể đạt 105 – 125 kg. Khi trưởng thành con được nặng tới 400 kg, con cái 280 – 300 kg. Lợn Landrace có khả năng sinh sản cao, mắn đẻ và đẻ nhiều trung bình đạt 1,8 – 2 lứa/năm. Mỗi lứa đẻ 10 – 12 con, trọng lượng sơ sinh (Pss) trung bình đạt 1,2 – 1,3 kg, trọng lượng cai sữa (Pcs) từ 12 – 15 kg. Sức tiết sữa từ 5 – 9 kg/ngày. Khả năng sinh trưởng của lợn rất tốt. Giống lợn này kén ăn và đòi hỏi nhu cầu dinh dưỡng cao và cũng đòi hỏi điều kiện chăm sóc tốt.[21] Hình 2.1. Lợn Landrace
6 2.1.2. Tổng quan về bò vàng Bò vàng là một giống bò u da lông vàng được tìm thấy ở Nam Trung Quốc, Việt Nam và Đài Loan. Chúng được tạo ra trong quá trình lai tạo giữa hai giống bò Bos taurus và Bos indicus. Chúng có tên là bò vàng vì màu sắc lông màu vàng. Đây là giống bò gốc làm nền để tạo ra rất nhiều giống bò khác nhau ở Trung Quốc, Việt Nam. Về phân loại động vật học, bò thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây sống (Chordata),lớp thú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (Bovidae), phân họ trâu bò (Bovinae), thuộc chi bò (Bos), loài Bos primigenius, phân loài (B.p.taurus, B.p.indicus). Bò vàng có một số ưu điểm nổi bật chịu đựng tốt với điều kiện nhiệt đới nóng ẩm, chịu đựng kham khổ tốt, thích nghi với nhiều vùng khí hậu, thích nghi được với phương thức chăn nuôi tận dụng, đầu tư ít. Bò có nhược điểm lớn nhất là tầm vóc nhỏ, không đáp ứng với yêu cầu chăn nuôi thâm canh, năng suất thịt và sữa rất thấp. Năng suất thịt không cao, tỉ lệ thịt xẻ 40- 44%. Tuổi phối giống lần đầu vào khoảng 20-24 tháng. Hình 2.2. Bò Vàng Bò vàng có khả năng sinh sản tốt, 18-24 tháng tuổi bò đã động dục và có khả năng phối giống, 30-34 tháng tuổi đẻ lứa đầu, nhịp đẻ năm một (1 năm
7 1 lứa) và 3 năm 2 lứa là phổ biến. Khả năng sinh sản tốt là đặc điểm có ích lớn nhất của bò vàng. 2.1.3 Tổng quan về dê Nhiều nhà khoa học ở các nước khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc của dê nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhưng đại đa số các nhà khoa học cho rằng dê là một trong những loại vật nuôi được thuần hóa sớm nhất. Người ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc khác nhau. Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính: + Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) được tìm thấy ở Iran và các nước vùng tiểu Á, là tổ tiên của phần lớn dê nhà đang được nuôi ở châu Á và châu Âu. Nó được coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà. Dê thuộc nhóm này có sừng thẳng nhưng xoắn vặn. + Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về phía sau và được coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi Hymalaya và đang được nuôi nhiều ở hai bên sườn phía Đông và Tây của dãy núi này. Nhóm Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir – Karakorum. Hiện nay, người ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nước Trung Đông, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nước châu Âu, châu Á và châu Phi. Khu vực nuôi dê mới nhất là Đông Nam Á. Về phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây sống (Chordata), phân ngành động vật có xương sống (Vertebrata), lớp động vật có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (bovidae), họ phụ dê cừu (capra rovanae), thuộc loài dê (Capra). Dê có đặc điểm màu lông không thuần nhất, có nhiều màu lông khác nhau nhưng tập trung chủ yếu ở một số màu lông chính như: Màu vàng (vàng
8 tro, vàng cánh gián, vàng nâu), màu đen (đen tuyền, xám đen), khoang trắng đen, trắng xám. Dê đực và dê cái đều có sừng và râu, tai nhỏ và hướng về phía trước hoặc sang ngang, đầu nhỏ, mình ngắn, bụng to, tầm vóc nhỏ. Khối lượng sơ sinh bình quân đạt từ 1,6 - 1,8kg, khối lượng trưởng thành của dê cái khoảng 25 - 30kg và dê đực là 30 - 45kg, con cái cao khoảng 50 - 54cm và con đực cao khoảng 55 - 58cm. Dê cỏ có khả năng sinh sản tốt, tuổi phối giống lần đầu là 6-7 tháng, đẻ 1,7 lứa/năm và 1,5 con/lứa, khoảng 2 năm đẻ 3 lứa, mỗi lứa 1-2 con. Dê cái mang thai trung bình từ 145 - 155 ngày là đẻ. Dê con lúc mới đẻ đến khi cai sữa mất khoảng 3 tháng. Dê cái non phải đạt 7 tháng tuổi và có trọng lượng xấp xỉ 24 kg mới cho phối giống lần đầu[7]. Hình 2.3: Dê Cỏ Ninh Bình
9 2.2. Cơ sở khoa học của đề tài 2.2.1. Công nghệ mã vạch DNA Năm 2003, Paul Hebert – nhà nghiên cứu đại học Guelph, Canada, sáng lập ra phương pháp “mã vạch DNA” dùng để nhận diện các loài [15]. Theo định nghĩa thông thường, mã vạch là phương pháp lưu trữ và truyền tải thông tin bằng một loại ký hiệu chuyên biệt, có quy ước. Khi nhìn vào dãy ký hiệu này người ta sẽ biết được nguồn gốc xuất xứ của sản phẩm. Tương tự, mã vạch DNA sử dụng trình tự nucleotide ngắn lấy từ một phần thích hợp trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi ký tự duy nhất giúp nhận diện và phân biệt các loài sinh vật với nhau [22]. Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của gen Cytochrome c oxidase 1 (COI) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là trình tự DNA có trong tất cả các loài động vật. Tuy nhiên trình tự các nucleotide của đoạn DNA này khác nhau giữa các loài. Hệ gen ty thể của động vật thích hợp để phân tích hơn là sử dụng bộ gen nhân vì không chứa các đoạn intron, 13 gen mã hóa protein trong ty thể động vật là những vùng gen có nhiều tiềm năng dùng để làm mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến sự thay đổi trong khung đọc rất hiếm xảy ra. Gen COI có đủ các yếu tố quan trọng để có thể sử dụng làm mã vạch DNA [16]. Một mã vạch DNA điển hình cần đáp ứng được các yêu cầu sau: (1) Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài. (2) Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất tái bản cao. (3) Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài. Có năm bước chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự mã vạch DNA. Đầu tiên, mẫu vật phải được thu nhận và xác định bởi các nhà phân loại. Một mẫu mô được lấy từ cơ thể vật nuôi và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau đó trình tự DNA đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR
10 (Polymerase chain reaction) và được giải trình tự để tạo ra một “mã vạch”. Cuối cùng, các mã vạch được nhập vào hệ thống các ngân hàng dữ liệu Barcode (BOLD). Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu thu thập, quản lý và phân tích mã vạch DNA. Mỗi mục được tổ chức trong BOLD có các thông tin như tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài đó đã được tìm thấy và trình tự mã vạch quy ước cho đối tượng. Thông tin này có thể được cung cấp cho bất cứ ai có nhu cầu thông qua BOLD và bất cứ nơi đâu trên thế giới [10]. Ví dụ, mã vạch DNA sẽ giúp định danh nhanh chóng các loài gây bệnh ở giai đoạn tiềm ẩn (giai đoạn ấu trùng), hỗ trợ chương trình kiểm soát sâu bệnh bảo vệ cây trồng. Gen COI có thể dùng để xác định động vật có xương sống và côn trùng. Gen COI của bọt biển và san hô rất bảo thủ, nhưng ở các loài lưỡng cư và giáp xác lại có sự biến đổi quá cao, trong khi ở các loài như giun tròn, sán lá và nhóm động vật cổ xưa “tardigrades” (gấu nước) thì vùng gen này có sự tái sắp xếp lớn nên sẽ là trở ngại cho việc sử dụng các cặp mồi phổ biến trong phản ứng PCR. Ngoài locut gen COI, các đoạn gen khác trong ty thể Cytb (Cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như DNA mã vạch trong nhận dạng ở động vật. [17] Với hàng triệu loài động vật luôn biến đổi không ngừng theo từng giai đoạn sống, việc phân loại và định danh các loài luôn gặp các thách thức không nhỏ. Nhiều sinh vật nhỏ hiện nay có thể vẫn chưa được biết đến. Tuy nhiên, ngay cả những loài động vật lớn hơn vẫn có những tranh luận về nhận dạng giữa các loài. Việc định danh loài thông qua các đặc điểm hình thái không còn thuyết phục. Vì vậy việc tìm ra phương pháp mã vạch DNA như một giải pháp mới và hữu ích cho việc phân loại là sự kiện quan trọng và có ý nghĩa thực tiễn.
11 2.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA từ mẫu thí nghiệm là việc cần thiết bởi các thí nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với DNA. Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết thành công DNA được công bố và báo cáo bởi nhiều nhà nghiên cứu. Đối với mỗi loại mô hay tế bào, quy trình tách chiết có thể sẽ khác nhau. Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản gồm: 1) Phá màng tế bào; 2) Loại bỏ protein; 3) Tủa và thu DNA. Nguyên lý tách chiết DNA cụ thể như sau: Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường tế bào, mô được nghiền trong nitơ lỏng -1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy rửa (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Khi đó màng tế bào, màng nhân sẽ bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trường và phân hủy các protein liên kết với DNA. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein, mẫu được lắc mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan DNA, sau khi li tâm sẽ tủa thành lớp nằm giữa hai lớp là nước và phenol/chloroform. Nước có chứa DNA được thu nhận lại. Bước 3: Tủa DNA nhằm thu nhận DNA dưới dạng cô đặc, một phần để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy các enzyme, mặt khác có thể hòa tan lại chúng trong dung dịch có nồng độ mong muốn. Có thể tủa DNA trong ethanol, môi trường có nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp, tuy nhiên cũng có thể tủa trong isopropanol (không cần muối). Sau khi thu nhận DNA, cặn tủa cần phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc isopropanol dính vào.