Khóa luận tốt nghiệp đại học: Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

47
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận tốt nghiệp đại học này được thực hiện với mục tiêu nhằm tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD, ISSR; phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR; phân tích được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa trên sơ đồ phả hệ DNA. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 THÁI NGUYÊN, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THÁI THÙY Tên đề tài: XÁC ĐỊNH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CAM BỐ HẠ VỚI CÁC GIỐNG CAM KHÁC BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 47 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2015 - 2019 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Duy TS. Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN, 2019
i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này tôi nhận được sự chỉ dẫn tận tình của Thầy TS Nguyễn Văn Duy – Trưởng khoa CNSH-CNTP Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên về phương pháp nghiên cứu, phân tích kết quả,…và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn và tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: thầy giáo TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình hướng dẫn, trực tiếp chỉ bảo kĩ năng làm việc và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Tiến Dũng và cán bộ phòng thí nghiệm - Thực hành Sinh học phân tử và các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã hướng dẫn kĩ năng làm việc, tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Trong quá trình thực tập, cũng như trong quá trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót. Đồng thời do trình độ lí luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy, cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thái Thùy
ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn ................................................. 4 Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) .......................................................................................... 6 Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017) ..... 7 Bảng 3. 1: Kết quả thu thập mẫu................................................................................... 16 Bảng 3. 2: Trình tự các mồi ISSR sử dụng ................................................................... 17 Bảng 3. 3: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 17 Bảng 3. 4: Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong đề tài ........................................ 17 Bảng 4. 1: Hệ số tương đồng di truyền cuả 32 mẫu cam nghiên cứu ........................... 37
iii DANH MỤC HÌNH Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn). .......................................................................................................................... 7 Hình 3. 1: Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình trong PCR -ISSR............... 20 Hình 4. 1: kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các mẫu cam. ................................. 22 Hình 4. 2: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T1 .................................. 23 Hình 4. 3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T2 .................................. 24 Hình 4. 4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- ISSR mồi T3 .................................. 25 Hình 4. 5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPT-01 .................................... 26 Hình 4. 6: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPM-13 .................................. 27 Hình 4. 7: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-17 ................................... 28 Hình 4. 8: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPQ-18 ................................... 29 Hình 4. 9: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-08 ................................... 30 Hình 4. 10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPB-18 ................................. 31 Hình 4. 11: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPA-04 ................................. 32 Hình 4. 12: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPC-08 ................................. 33 Hình 4. 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPO-04 ................................. 34 Hình 4. 14: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR- mồi OPG-16 ................................. 35 Hình 4. 15 sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 32 mẫu cam nghiên cứu (coefficient: hệ số tương đồng di truyền) ........................................................................................................... 38
iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Bp Base pair - Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự CTAB Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FAO Food and Agriculture Organization ISSR Inter - simple sequence repeat NTSYSpc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple sequence repeat TAE Tris - acetate - EDTA TE Tris – EDTA
v LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... I DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................ II DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... IV PHẦN 1.............................................................................................................................1 MỞ ĐẦU ..........................................................................................................................1 1.1Đặt vấn đề .....................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu của đề tài .....................................................................................................2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát....................................................................................................2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................................2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ....................................................................................2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .....................................................................................2 PHẦN 2.............................................................................................................................3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................................3 2.1. Tổng quan về cây cam, quýt.......................................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại ...........................................................................................3 2.1.1.1. Nguồn gốc ...........................................................................................................3 2.1.1.2. Phân loại ...............................................................................................................3 2.1.2 Giá trị cây cam, quýt ................................................................................................4 2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới ................................................6 2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới .............................................6 2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam ........................................................7 2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền ................................8 2.3.1. kỹ thuật RAPD ........................................................................................................8 2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD ...............................................................................8 2.3.2. Kĩ thuật ISSR ..........................................................................................................9 2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR ..................................................................................9 2.3.3. Một số kĩ thuật khác ..............................................................................................10 2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước .........................................................................................................................................11 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................................11
vi 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..........................................................................13 PHẦN 3...........................................................................................................................15 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................15 3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .........................................................15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................15 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ...............................................................................................16 3.2. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ..................................................................16 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................16 3.2.2. Thiết bị nghiên cứu................................................................................................17 3.2.3. Hóa chất.................................................................................................................17 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................18 3.4. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................18 3.4.1. Phương pháp tách chiết DNA................................................................................18 3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số .........................19 3.4.3. Phương pháp RAPD, ISSR...................................................................................19 3.4.4 Phương pháp phân tích đa hình ..............................................................................20 3.5. Các phương pháp xử lý số liệu .................................................................................21 PHẦN 4...........................................................................................................................22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................................................22 4.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá cam ................................................................22 4.2. Phân tích các phân đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD, ISSR ......................22 4.2.1. Phân tích các đoạn DNA đa hình di truyền bằng RAPD với từng mồi. ................23 4.3. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống camnghiên cứu dựa trên giản đồ phả hệ DNA............................................................................................................................36 4.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loài cam dựa trên các giống đã nghiên cứu. ...........38 PHẦN 5...........................................................................................................................41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................41 5.1. Kết luận ....................................................................................................................41 5.2. Kiến nghị ..................................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................43 PHỤ LỤC I.....................................................................................................................47
1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L.) Osbeck) thuộc họ Prtaceae là một trong những loại cây ăn quả lâu năm có hương vị thơm ngon giá trị dinh dưỡng cao được nhiều người ưa chuộng. Trong thành phần quả cam chưa nhiều vitamin như: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ, các chất khoáng vi lượng; chứa chất chống oxy hóa có tác dụng lớn trong chống khối u, chống viêm [2]. Một số nghiên cứu của Bùi Huy Đáp (1960)[4], Trần Thế Tục năm 1977 [10], Nguyễn Minh Châu (2009)[2] đã cho thấy, Việt Nam có nguồn gen cây có múi khá đa dạng với nhiều vùng trồng cam nổi tiếng truyền thống như Tuyên Quang (cam sành Hàm Yên), Bắc Giang (cam sành Bố Hạ), Hà Giang (cam sành), Hòa Bình (cam Cao Phong), Nghệ An (cam Vinh), Hà Tĩnh (cam Bù), Yên Bái (cam canh),... Cam Bố Hạ từ lâu đã trở thành thương hiệu nổi tiếng được người tiêu dung trong cả nước biết đến và đã từng trở thành một trong những cây kinh tế mũi nhọn của tỉnh Bắc Giang. Tuy nhiên, qua thời gian vùng cam Bố Hạ với những giống cam quý đặc sản đang dần bị thoái hóa và bị mất đi do nhiều nguyên nhân, Nông trường cam Bố Hạ đã bị giải thể. Nhóm nghiên cứu đề tài “Bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, Bắc Giang” đã điều tra và thu thập được một số cây cam Bố Hạ tại khu vực trồng cam Bố Hạ trước đây. Việc đánh giá đa hình di truyền, xây dựng cây phát sinh chủng loài của các cây cam Bố Hạ này là cần thiết nhằm cung cấp các thông tin, ứng dụng trong công tác nghiên cứu bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen quý này, góp phần vào sự phát triển kinh tế, xã hội của người dân tỉnh Bắc Giang. Hiện nay, một số phương pháp đã được sử dụng rất phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền trên cam, quýt như ISSR, SSR, RAPD… Đây là cơ sở khoa học và thực tiễn để quan trọng để ứng dụng trong việc xác định mối quan hệ của cam Bố Hạ với các giống cam khác của đề tài:”Xác định mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam khác bằng chỉ thị phân tử”.
2 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định mối quan hệ di truyền giữa cam Bố Hạ, Bắc Giang với một giống cam khác bằng chỉ thị phân tử DNA. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể -Tách chiết được DNA tổng số từ lá cam, quýt đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD, ISSR. - Phân tích được các phân đoạn DNA của các giống cam nghiên cứu bằng kỹ thuật RAPD và ISSR. -Phân tích được mối quan hệ di truyền của cam Bố Hạ với các giống cam thu thập dựa triên sơ đồ phả hệ DNA. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về việc ứng dụng chỉ thị phân tử xây dựng cây phát sinh chủng loài cam. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm những tài liệu khoa học, phục vụ cho công tác giảng dạy cũng như nghiên cứu trên cây cam ở nước ta. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Xác định mối quan hệ di truyền cam Bố Hạ với các giống cam khác là cơ sở để thực hiện các biện pháp bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen cam Bố Hạ, khôi phục lại thương hiệu cam nổi tiếng này và góp phần nâng cao đời sống kinh tế, xã hội cho người dân tỉnh Bắc Giang.
3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về cây cam, quýt 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1. Nguồn gốc Cây cam đã được biết đến rất lâu khoảng 2200 năm trước công nguyên ở Trung Quốc nhưng một số người lại cho rằng cây cam có nguồn gốc từ dãy Himalayas (Ấn Độ). Cam được trồng phổ biến ở Ấn Độ, sau đó lan rộng về phía đông, và đến cả vùng Đông Nam Á. Vào khoảng thế kỷ thứ 3 trước công nguyên, cây cam được đưa đến Châu Âu và nó lan ra tới cả vùng Địa Trung Hải. Sau đó, cây cam được Columbus mang đến Châu Mỹ. Những năm sau đó, những người làm vườn ở Châu Mỹ và Châu Âu đã đem cây cam đến Châu Úc và Châu Phi. Ngày nay cây cam được trồng rất phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới [9]. Giống Cam ngọt (Citrus sinensis Osbeck) được xác định có nguồn gốc ở miền Nam Trung Quốc, Ấn Độ và miền nam Indonesia. Sau đó được mang đến trồng ở Châu Âu, Địa Trung Hải và Châu Phi vào thế kỷ 13 đến thế kỷ XVII [1]. Giống cam Washington Navel trên thế giới hay có tên gọi cam Navel ở Việt Nam được cho là dạng đột bến tự nhiên từ một giống cam ngọt, giống này được phát hiện ở Bhia Brail, lần đầu tiên được trông ở Úc năm 1928, ở Florida (Mỹ) năm 1835, ở California năm 1970 và nó nổi tiếng ở Washington D.C. Sau đó được trồng khắp các vùng trồng cam, quýt trên thế giới[8]. Theo một số tài liệu nghiên cứu, cam, quýt có nguồn gốc ở miền Nam châu Á, sự lan trải của cam, quýt trên thế giới gắn liền với lịch sử buôn bán đường biển và các cuộc chiến tranh trước đây. 2.1.1.2. Phân loại Cam quýt thuộc: Giới Plantae Bộ Rutales Họ Rutaceae Chi Citrus
4 Được phân chia làm 130 giống (genera) nằm trong các họ phụ khác nhau [9]. Hiện nay có hai hệ thống phân loại đang được nhiều người áp dụng. Theo Tanaka (Nhật Bản) cam quýt gồm 160-162 loài. Tanaka đã quan sát, ghi chép tỉ mỉ đặc điểm hình thái của các giống đã biến dị này và phân chúng thành một loài mới hoặc giống mới có tên khoa học được bắt đầu bằng tên giống hay tên loài đã phát sinh ra chúng và kết thúc bằng chữ ‘Horticuluture” [9]. Swingle lại chia cam quýt ra làm 16 loài [9]. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn phải sử dụng hệ thống phân loại của Tanaka để gọi tên các giống cam quýt vì bảng phân loại này chi tiết tới từng giống. Theo Tanaka có 10 nhóm quan trọng nhất trong nhóm True citrus group, đây là những loài được trồng phổ biến và có ý nghĩa với con người. Danh sách nhóm quan trọng này được trình bày trong bảng 2.1[9]. STT Tên loài Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt 1 C.sisnensis Osbeck Sweets Orange Cam ngọt 2 C.aurantium L. Sour Orange Cam chua 3 C.reticulata Blanco Mandarin Quýt 4 C.limon Osbeck Lemon Chanh núm 5 C.medica L. Citron Chanh yên 6 C.aurantifolia Swingle Lime Chanh vỏ mỏng 7 C.trifolia L. Trioliate Chanh đắng 8 C.grandis L. Shadock Bưởi 9 C.paradishi L. Pomelo Bưởi chùm 10 C.fortunenna. kumquat Quất Bảng 2. 1: các loài cam,quýt có ý nghĩa trong thực tiễn 2.1.2 Giá trị cây cam, quýt Cam,quýt là một trong những sản phẩm có giá trị và được nhiều người ưa chuộng, nó mang lại nguồn dinh dưỡng quý cho con người. Không chỉ có ý nghĩa về kinh tế, nguồn dinh dưỡng mà cam quýt còn có giá trị cao về dược liệu. Các sản phẩm của cây cam, quýt hiện nay cung cấp cho thị trường trong nước và ngoài nước góp phần vào tăng trưởng nền kinh tế.
5 Giá trị dinh dưỡng: Quả cây có múi có rất nhiều chất dinh dưỡng nên giá trị sử dụng rất cao. Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng Nước 88,8 g Vitamin E 0,18 mg Năng lượng 38 KJ Beta - caroten 71 µg Protein 0,9 g Alpha - caroten 11 µg Lipid 0,1 g Beta - cryptoxanthin 116 µg Glucid 8,3 g Lutein + Zeaxanthin 129 µg Celluloza 1,4 g Purin 19 mg Tro 0,5 g Lysin 43 mg Đường tổng số 9,35 g Methionin 12 mg Canxi 34 mg Tryptophan 6 mg Sắt 0,4 mg Phenylalanin 30 mg Magie 10 mg Threonin 12 mg Mangan 0,52 mg Valin 31 mg Phospho 23 mg Leucin 22 mg Kali 108 mg Isoleucin 23 mg Natri 4 mg Arginin 52 mg Kẽm 0,22 mg Histidin 12 mg Đồng 140 µg Cystin 10 mg Vitamin C 40 mg Tyrosin 17 mg Vitamin B1 0,08 mg Alanin 51 mg Vitamin B2 0,03 mg Acid aspartic 114 mg Vitamin PP 0,2 mg Acid glutamic 99 mg Vitamin B5 0,25 mg Glycin 83 mg Folat 30 µg Prolin 46 mg Vitamin H 0,89 µg Serin 23 mg
6 Bảng 2. 2: Thành phần dinh dưỡng của 100 gram cam tươi (Nguồn: Bộ y tế Viện dinh dưỡng, NXB Y học, năm 2007) Giá trị kinh tế: Cây ăn quả có múi là một trong những loại cây lâu năm, nhanh cho thu hoạch. Một số giống cho thu hoạch ngay ở năm thứ 2. Ở nước ta, năng suất trung bình của cam, quýt ở thời kỳ 8 tuổi có thể đạt tới 16 tấn/ha. Cây cam, quýt có thể sống và cho thu hoạch quả trong vòng 15-30 năm nên mang lại giá trị kinh tế cao [9]. Giá trị dược liệu và công nghiệp: Ở nhiều nước, người ta dùng các loại quả thuộc cho Citrus làm thuốc chữa bệnh. Thế kỷ XVI, người Trung Quốc và người Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da. Ở Mỹ, vào những năm 30 của thế kỷ XX, các thầy thuốc đã dùng quả cam quýt kết hợp với insulin để chữa trị bệnh đái tháo đường. Ở nước ta, nhân dân đã dùng cây ăn quả có múi để phòng và chữa trị một số bệnh từ lâu [9]. Giá trị về môi trường sinh thái: Trong quá trình sinh sống, các loại cam, quýt tiết ra oxy trong không khí làm không khí trở nên trong lành. Trong những chừng mực nhất định các chất bay hơi từ cây cam, quýt có tác dụng diệt một số loài vi khuẩn làm cho không khí trở nên sạch hơn, môi trường sống của con người tốt hơn. Cam, quýt trồng trên các đồi đất bên cạnh việc cho quả còn có tác dụng phủ xanh đất, giữ nước ngăn cản dòng chảy mạnh trên mặt đất sau các trận mưa lớn, do đó có ý nghĩa lớn trong việc làm giảm quá trình xói mòn, rửa trôi đất. Ở vùng trung du và miền núi cam, quýt được trồng trong các vườn rừng, vườn đồi trong các hệ thống VAC (vườn – ao – chuồng) và VACR (vườn – ao – chuồng – rừng) là phương thức canh tác được áp dụng rộng rãi tại các trang trại nông nghiệp và đã thể hiện nhiều ưu điểm trong việc thực hiện nền nông nghiệp bền vững [9]. 2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam quýt trên thế giới 2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cam, quýt trên thế giới Trong suốt mấy thế kỷ qua, ngành sản xuất cam quýt trên toàn thế giới không ngừng tăng nhanh và mức tiêu thụ quả của thị trường thế giới cũng ngày một cao hơn do trồng cam quýt chóng được thu hoạch và lãi suất luôn cao. Trên Thế giới, sản xuất cây có múi là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu
7 tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15kg quả/năm. Hiện có 75 nước trồng cam quýt với diện tích và sản lượng tăng đáng kể [9]. Hình 2. 1: : top 10 nước sản xuất cam lớn nhất thế giới năm 2018/19 (nguồn [5])(đơn vị:nghìn tấn). Brazil là nước sản xuất, xuất khẩu trái cam và nước cam hàng đầu trên thế giới, sản xuất khoảng 30% sản lượng của thế giới. 94% sản lượng cam của đất nước này tập trung ở bang Sao Paulo. Năm 2018/19 sản lượng cam của Brazil 16 triệu tấn, tiêu thụ tươi khoảng 5 triệu tấn và tiêu thụ khác khoảng 11 triệu tấn. Tiếp theo là Trung Quốc, EU, ba quốc gia hàng đầu này dự kiến sẽ tiếp tục mở rộng sản xuất nhưng với tốc độ chậm hơn. 2.2.2. Tình hình sản xuất cây cam, quýt ở Việt Nam Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển các cây có múi. Trong những năm gần đây Chính phủ, các địa phương, cũng đã có nhiều quan tâm đến sự phát triển của cây cam. Chỉ tiêu Năm 2015 Năm2016 Năm 2017 Diện tích trồng (x1000 ha) 78,5 85,4 97,5 Diện tích cho sản lượng (x1000 ha) 58,4 48,4 64,7 Sản lượng (x 1000 tấn) 758,9 727,4 799,5 Bảng 2. 3: Diện tích, sản lượng cam ở Việt Nam(Nguồn: Tổng cục thống kê 2017)
8 Theo Tổng cục Thống kê, năm 2017 sản lượng cây ăn quả tăng cả về diện tích và sản lượng. Sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%. Tốc độ và tỷ lệ % tăng trưởng trên thể hiện rõ ưu thế và xu hướng thị trường của cây cam và bưởi. Tuy nhiên, tổng sản lượng quả có múi cả nước mới đạt thấp, khoảng 1.519.400 tấn; tính bình quân đầu người năm 2017 mới đạt trung bình khoảng 16kg (tính trên dân số khoảng 95 triệu người) [14]. 2.3. Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1. kỹ thuật RAPD 2.3.1.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD Kĩ thuật RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên. Chỉ thị phân tử RAPD dựa trên kĩ thuật PCR với sự bắt cặp ngẫu nhiên của các đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước với mạch khuôn, nhân những đoạn có trình tự bổ sung với trình tự mồi. Mồi sử dụng cho phản ứng RAPD là các mồi ngẫu nhiên có nhiệt độ kéo dài mồi thấp từ 34 - 370C. Mặc dù là mồi ngẫu nhiên nhưng vẫn phải đủ 2 tiêu chí là tỉ lệ G/C tối thiểu là 40% và không có trình tự các base đầu xuôi và ngược giống nhau[7]. Kĩ thuật RAPD gồm 3 bước - Tách chiết DNA tổng số. - Thực hiện phản ứng PCR nhân gene, điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide. - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, phân tích nhóm UPGMA, lập sơ đồ cây) các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.Sản phẩm PCR - RAPD thường được điện di trên gel agarose 1,5 - 2% hay điện di trên gel polyacrylamide. 2.3.1.2. Những ưu điểm và nhược điểm của kĩ thuật RAPD so với các kĩ thuật sinh học phân tử khác Ưu điểm: Về mặt kĩ thuật: Kĩ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác
9 nhau với các mồi chung, thao tác đơn giản và dễ thực hiện, chất lượng. DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao [9]. Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kĩ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kĩ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao. Nhược điểm: Với những ưu điểm trên RAPD vẫn còn có những hạn chế nhất định như sản phẩm PCR không ổn định giữa những lần nghiên cứu do đặc điểm của mồi là ngẫu nhiên và ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được và chỉ tạo ra được các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể đồng hợp với các cá thể dị hợp[7]. 2.3.1.3. Ứng dụng của kĩ thuật RAPD Các nghiên cứu cho thấy kĩ thuật RAPD là một phương pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kĩ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, xác định sự đa hình di truyền của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay giữa các cá thể để phục vụ cho công tác lai tạo hoặc phân loại. Chỉ thị RAPD còn là công cụ hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay loài khác nhau. Sun và cs (2003) đã sử dụng 160 mồi RAPD để phân tích tính đa hình DNA của 35 giống lúa mì xuân kháng bệnh FHB (Fusarium hesd blight) và phát hiện ra 3 chỉ thị RAPD liên quan đến tính kháng bệnh FHB[16]. Orozco và cs (1994) đã ứng dụng kĩ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loài bố, mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo con lai có đặc tính quý[35]. 2.3.2. Kĩ thuật ISSR 2.3.2.1. Giới thiệu về kĩ thuật ISSR Kĩ thuật ISSR được định nghĩa là kĩ thuật dựa trên PCR dùng để nhân đoạn gene nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau. Kĩ thuật này sử
10 dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong kĩ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc 5 nucleotide. Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh. Kĩ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai[7]. Kỹ thuật ISSR có một số lợi thế hơn so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt được các kiểu gen gần và không cần thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu. Giống như RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh, dễ tiến hành. Nó ưu việt hơn RAPD là cho nhiều thông tin và có thể lặp lại ở các thí nghiệm do mồi dài hơn. Nhược điểm chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị đồng nhất của các sản phẩm nhân bản do sự di chuyển đồng thời [7]. 2.3.3. Một số kĩ thuật khác Kĩ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kĩ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp để nhân chọn lọc các phân đoạn DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50 đến 100 băng trong một phân tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kĩ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kì nguồn gốc nào. Kĩ thuật này có một số ưu điểm như: có độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của cơ thể nghiên cứu; cho nhiều thông tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp mồi trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh. Có thể dùng phân biệt các cá thể rất gần nhau, lập bản đồ genome[16]. Kĩ thuật đa hình tiểu vệ tinh được nhân bản ngẫu nhiên (Randomly Amplified Microsatellite Polymorphism - RAMP) Kĩ thuật này sử dụng mồi được đánh dấu chứa đầu 5' neo và đầu 3' lặp lại để nhân DNA genome với sự có mặt hoặc vắng mặt các mồi RAPD. Sản phẩm nhận
11 được phân tách trên gel polyacrylamide biến tính. Do mồi lặp lại được đánh dấu nên chỉ có sản phẩm của mồi neo được xác định. Nhiệt độ bắt cặp của mồi neo thường cao hơn mồi RAPD 10 - 15oC. Vì vậy, ở nhiệt độ bắt mồi cao chỉ có mồi neo được kéo dài hiệu quả. Ở các chu kì PCR với nhiệt độ bắt mồi thấp, cả hai mồi neo và mồi RAPD đều kéo dài. Do đó, chương trình PCR được thiết lập sao cho có sự chuyển giữa nhiệt độ bắt mồi cao xuống thấp trong quá trình phản ứng. Hầu hết các phân đoạn nhận được chỉ với các mồi RAMP sẽ biến mất khi có các mồi RAPD và các mẫu băng khác nhau nhận được bởi cùng một mồi RAMP và các mồi RAPD khác nhau cho thấy các mồi RAPD cạnh tranh với mồi RAMP trong chu kì nhiệt độ bắt mồi thấp. RAMP được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây như lúa mạch[35]và đào[37] Kĩ thuật đa hình độ dài các chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism - SSLP) Là kĩ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa hai gene. Các chuỗi có độ dài khác nhau là do số lượng trình tự lặp lại trong chuỗi khác nhau do trong quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép. Cả hai quá trình này đều có thể dẫn đến giảm hoặc tăng số lượng đơn vị lặp lại trong genome. Sự khác nhau về độ dài của SSLP được sử dụng để đánh giá sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài. Kĩ thuật SSLP được tiến hành bằng các cặp mồi đặc hiệu nhân bản các chuỗi đơn giản nằm giữa hai gene, sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide [7]. 2.4. Tình hình nghiên cứu về đa dạng di truyền ở cam, quýt trên thế giới và trong nước 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tính đa dạng di truyền của chi Citrusbằng các chỉ thị sinh học phân tử trên thế giới. Abkenar và cs (2003) sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đặc điểm phân tử và khoảng cách di truyền giữa các loài Citrus ở Nhật. Đối tượng nghiên cứu gồm 31 loài Citrus khác nhau, trong đó có 6 loài cam chua, 4 loài “Yuzu” và 21 loài họ hàng. Sử dụng 27 mồi kết quả có 108 chỉ thị được tạo thành, 76 chỉ thị là đa hình, trung bình là 2,8 chỉ thị trên một mồi. Cây phân loại cho thấy các loại cam chua rất
12 khác với các loài “Yuzu” và họ hàng của chúng. Các loài “Yuzu” có mối quan hệ gần gũi nhau, tuy nhiên sự đa dạng di trền ở các loài khá cao, biểu lộ các nguồn gốc khác nhau của chúng. Trong nghiên cứu này, một số mồi RAPD có thể giúp phân biệt giữa các loại cây trồng gần gũi như OPA-17, OPE-20 chỉ có ở “Kabosu” mà không có ở “Aka Kabosu”, mồi OPA-20, OPB-05 và OPE-16 phân biệt các cây chỉ có ở “Aka kabosu” mà không có ở “Kabosu” [15]. Dehesdtani và cs (2007) đánh giá đa dạng di truyền của các cây cam ngọt (Citrus sinensis Navel) trồng ở Mazandaran (Iran) bằng chỉ thị RAPD với 21 mồi ngẫu nhiên và 52 mẫu lá của các cây có ba hình thái quả khác nhau là: vỏ nhẵn, vỏ nhám và nửa nhám. Bốn mồi đã tạo ra các băng đa hình có tính lặp lại. Trong số các băng tạo ra từ 4 mồi có 70,13% là băng đa hình, sự đa hình di truyền cao nhất là ở nhóm vỏ nhẵn và vỏ nhám [20]. C. Martasari, Karsinah và Reflinur (2012) đã nghiên cứu mô tả 20 giống Siam của Indonesia từ 9 tỉnh bởi hình thái học và các dấu hiệu ISSR. Kết quả cho thấy có sự khác nhau về hình dạng, màu sắc, độ dầy của vỏ và hương vị của quả chín. Sơ đồ cây được tạo ra từ các băng DNA cho thấy một sự thoái hóa của 20 giống Siam đã chia thành bốn nhóm. Nhóm A bao gồm 9 giống (Lumajang, Banjar 2, Candi, Tulungagung, Mamuju, Tapin và Ponorogo). Nhóm B có 5 giống (Batola, Tlekung, Pontianak 2, Bangkinang và Madu). Nhóm C hình thành bởi 1 giống duy nhất là Banyuwangi. Nhóm cuối cùng D có 5 giống (Jember, Kintamani, Pati, Jambi, Banjar 2). Mỗi nhóm có sự giống nhau hình thái và quả [29]. Năm dòng khác nhau của loài cam chua (Citrus aurantium L.) biểu hiện những khác biệt có ý nghĩa về hình thái học đã được xác định bằng các chỉ thị phân tử phát triển từ kĩ thuật PCR là ISSR và RAPD. De Pasquale và cs (2006) đã phân tích các mẫu nghiên cứu với 11 mồi ISSR và 6 mồi RAPD (OPH04, OPAT14, OPH15, OPM04, OPO14 và OPN14)[22]. Naz và cs (2014) đã tiến hành nghiên cứu tính chất phân tử và mối quan hệ di truyền giữa các giống Citrus khác nhau ở Pakistan. Mối quan hệ di truyền giữa 17 giống cam, quýt thương mại quan trọng, bao gồm những giống địa phương và một số giống lai đã được đánh giá bằng kỹ thuật RAPD với 15 mồi được lựa chọn trong số 25 mồi. Tổng số 188 băng với 153 băng đa hình, trung bình 13 băng mỗi mồi. Hệ