Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước

Chia sẻ: Nguyen Phuonganh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

226
lượt xem 41
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kể từ khi các kỹ thuật chuyển gene và kỹ thuật di truyền ra đời cho đến nay, nó tạo ra luồng tư tưởng nơi các nhà y sinh học là nhanh chóng ứng dụng các kỹ thuật này trong việc chẩn đóan, chữa trị các bệnh di truyền không chỉ ở mức độ nghiên cứu phòng thí nghiệm mà phải nhanh chóng đưa ra ứng dụng lâm sàng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước

Kỹ thuật liệu pháp gene mới: ứng dụng nuclease ngón tay kẽm được thiết kế trước Kể từ khi các kỹ thuật chuyển gene và kỹ thuật di truyền ra đời cho đến nay, nó tạo ra luồng tư tưởng nơi các nhà y sinh học là nhanh chóng ứng dụng các kỹ
thuật này trong việc chẩn đóan, chữa trị các bệnh di truyền không chỉ ở mức độ nghiên cứu phòng thí nghiệm mà phải nhanh chóng đưa ra ứng dụng lâm sàng. Đến nay nhiều kỹ thuật đã được áp dụng khá thành công ở các dòng tế bào nuôi cấy và thậm chí ở mô hình dùng chuột thí nghiệm các bệnh ở người, nhưng chúng cũng cho thấy một trở ngại thực sự lớn đó là làm sao chuyển chúng ra ứng dụng lâm sàng. Trên trang 646 tờ Nature 435, (2 June 2005), Urnov và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu theo đó một phương thức mới giúp
hiệu chỉnh sửa sai một đột biến di truyền ở tế báo người. Phương thức mới này ra đời từ sự kết hợp 2 quá trình sinh học cơ bản vốn dĩ rất bảo thủ về mặt tiến hóa: cắt xuyên sợi đôi DNA ở điểm đặc hiệu và sửa chữa sai sót sợi DNA bằng sự tái tổ hợp đồng dạng. Sự thành công của Urnov và cộng sự, về mặt lý thuyết, cho thấy hòan tòan có thể ứng dụng lâm sàng. Thành công của các tác giả là nhờ họ kế thừa và phát triển từ những nghiên cứu trước đó cũng trên nền tảng phương thức kết hợp hai quá trình sinh học nói trên. Đây thực sự một bước tiến đáng kể trên con đường ứng dụng kỹ thuật di truyền vào chữa trị bệnh cho
người. Trước hết cần nhắc lại là hầu hết các chiến thuật chuyển gene thực chất là liệu pháp thêm gene, nghĩa là một phiên bản gene bình thường (gene lành) của một gene nào đó sẽ được chuyển vào một dòng tế bào nào đó mà nhà nghiên cứu hay bác sỹ điều trị quan tâm, tại đây chúng sẽ tồn tại đồng thời với phiên bản đột biến chị em của nó. Nhưng mục đích sau cùng của việc đưa gene vào tế báo là chỉnh sửa đột biến, do vậy gene lành phải có khả năng tạo ra những protein bình thường dưới sự điều khiển của các dấu hiệu điều hòa nội tại.
Quá trình sửa chữa hay hiệu chỉnh đặc hiệu theo điểm của một đột biến nào đó có thể chia làm 3 bước: • Đầu tiên, điểm cần hiệu chỉnh phải được dò tìm trong 3 tỷ cặp base bộ gene người. • Kế đến, base đóng vai trò kẻ thay thế phải được đưa vào tế bào một cách hiệu quả • Cuối cùng, các yếu tố phản ứng phải được đưa vào dạng tế bào tương ứng trong cơ thể (ví dụ tế bào phổi ở bệnh nhân mắc chứng xơ hóa)
Để giải quyết vấn đề đầu tiên, Urnov và cộng sự đã lợi dụng các ZFN (zinc-finger nucleases- các nuclease ngón tay kẽm). Những protein tổng hợp này được mô tả đầu tiên từ 1996, sau đó chúng được cải biến phát triển thành các yếu tố phản ứng nhằm phân cắt DNA tại một điểm đặc hiệu, do vậy chúng bao gồm vùng gắn DNA và vùng phân cắt DNA. Vùng gắn DNA của ZFN bao gồm một sợi "ngón tay kẽm", sợi này gồm khỏang 30 amino acid được làm bền bằng một ion kẽm. Như tên gọi thì vùng gắn lên DNA sẽ gắn lên một trình tự DNA đặc hiệu
3 base. Trình tự amino acid trong ngón tay kẽm biến thiên tùy theo trình tự DNA mà nó sẽ gắn. Trong bộ gene người, người ta tìm thấy khỏang 900 protein mang ngón tay kẽm và danh sách này còn sẽ được bổ sung nữa trong tương lai. Vùng cắt DNA của ZFN bắt nguồn từ enzyme FokI và tự bản thân nó thì không mang tính đặc hiệu. Để có thể có chức năng phân cắt DNA, vùng này phải được nhị trùng hóa (dime). Do đó 2 ZFN phải gắn tại vị trí hoặc gần vị trí cần hiệu chỉnh. Bằng cách liên kết gắn 4 ngón tay
kẽm theo cách thức sóng đôi, hai ZFN này nối sau hai ZFN kia, khi đó chúng tạo ra một vị trí nhận diện đặc hiệu gồm 24 bp. Và với một trình tự 24 bp thì có thể xác định một trình tự duy nhất trong tòan bộ genome, cho phép dò tìm điểm cần hiệu chỉnh. Như vậy bước đầu tiên của quy trình 3 bước đã được giải quyết.
Chú thích: Những bệnh nhân mắc hội chứng SCID mang một vài đột biến đặc hiệu ảnh hưởng chức năng tế bào T. Urnov và cộng sự sử phương thức minh họa ở đây để hiệu chỉnh khiếm khuyết và thu được một tỷ lệ thành công đánh kể với những dòng tế bào nuôi cấy mang cùng đột biến. a, ZFN (Zinc-
finger nucleases) được thiết kế sao cho những vùng ngón tay kẽm sẽ nhận diện điểm đặc hiệu gần điểm đột biến. b, Vùng phân cắt sẽ tạo ra vết cắt xuyên sợi đôi DNA. c, Một trình tự dạng hoang dại (không đột biến) được đưa vào tế bào và và được sử dụng như khuôn mẫu cho quá trình sửa chữa DNA trong tế bào – tái tổ hợp đồng dạng diễn ra. d, Trình tự đột biến được sửa chữa.. Sau khi được nhị trùng hóa, enzyme này sẽ tạo ra một vết cắt xuyên sợi đôi DNA tại vị trí gần hoặc tại chính xác điểm đột biến. Khi đó, các cơ chế sửa sai của tế
bào sẽ được kích họat. Trong số các cơ chế sửa sai này, thì "sự tái tổ hợp đồng dạng" tức là quá trình sửa sai bằng cách sử dụng những trình tự tương tự có sẵn trong tế bào làm khuôn. Trình tự tương tự có thể dễ dàng tìm thấy trong genome, nhưng nó cũng có thể tìm thấy từ những vật liệu DNA được con người chủ động đưa vào trước đó. Như vậy bước thứ hai đã được giải quyết- thay đổi một base. Điểm đặc trưng đáng chú ý trong quy trình phức tạp trên là tần xuất diễn ra các sự kiện mong đợi. Urnov và cộng sự cho thấy là họ đã thành công khi hiệu chỉnh được
khỏang 15-20% các nhiễm sắc thể đột biến ở một dòng tế bào nuôi cấy theo chu kỳ. Hiệu suất này cho phép việc đưa hai ZFNs và khuôn DNA bình thường vào tế bào có thể đủ để thực hiện sự thay đổi điểm sai sót. Các tác giả còn thậm chí cho rằng họ đã thành công khỏang 5% khi tiến hành thực nghiệm trên tế bào T thu từ một bệnh nhân, cũng nên nhớ là hiệu quả cải biến di truyền trên dòng tế bào T thường cực kỳ thấp. Kết quả và sự giải thích này hòan tòan phù hợp với tốc độ tái tổ hợp đồng dạng, ở tế bào không có hiện tượng DNA bị cắt xuyên sợi thì tỷ lệ này chỉ khỏang 0,001%.
Đến đây thì một vấn đề đặt ra là công việc của Urnov và cộng sự có ý nghĩa thế nào trong việc chữa trị bệnh ở người. Trình tự DNA mà các tác giả đã sửa chữa là một trong những dạng đột biến gây ra hội chính suy giảm miễn dịch kết hợp trầm trọng - SCID (severe combined immunodeficiency ) — đây là một bệnh gây chết cho trẻ ở giai đọan rất sớm, và cho đến nay chưa có liệu pháp gene hay cấy gép tủy xương nào tỏ ra hữu hiệu. Vài năm trước, cũng đã có vài tác giả thành công trong các nghiên cứu chuyển gene ở bệnh nhân SCID. Họ sử dụng retrovirus để thêm một
gene bình thường vào tế bào đích (là những tế bào máu biểu hiện CD34) lấy từ bệnh nhân. Sau thời gian nuôi cấy, các tế bào này được được trở lại bệnh nhân. Và khỏang 20−40% tế bào hồi hương là có chứa gene bình thường. Ở bệnh nhân, tỷ lệ chuyển gene này thực sự là một con số có ý nghĩa vì ở những tế bào sau khi được xử lý chúng có điểm thuận lợi là chúng "khỏe mạnh" hơn tế bào đột biến in vivo. Do vậy nếu kết hợp nghiên cứu của tác giả trước và kết quả nghiên cứu của Urnov và cộng sự, khi đó các nhà nghiên cứu có thể hy vọng là họ sẽ phục hồi chức năng miễn dịch cho các bệnh nhân SCID.
Hơn nữa, hướng nghiên cứu này còn tránh được cái gọi là "quá trình tích hợp không mong muốn" vì phương thức này nhằm sửa chữa gene bệnh chứ không phải chèn một phiên bản bình thường. Ở những nghiên cứu trước „quá trình tích hợp không mong muốn“diễn ra khi mà quá trình chèn và tích hợp gene xảy ra ở một vị trí không mong đợi (ví dụ như gần gene thúc đầy tăng trưởng). Phương thức của Urnov và cộng sự đã giải quyết được vấn đề này, cho thấy khả năng hiệu chỉnh những sai hỏng mà không tạo ra các hiệu ứng phụ nghiêm trọng.
Một điểm lý thú nữa trong phương thức mà Urnov và cộng sự đã sử dụng đó là nó không đòi hỏi ZFNs và khuôn DNA phải hiện diện lâu trong tế bào. Mặc dù có những điểm ưu việt như đã phân tích ở trên, nhưng kỹ thuật mà Urnov và cộng sự đưa ra vẫn còn nhiều điểm cần hòan thiện trước khi nó thực sự ứng dụng lâm sàng trên người. Ví dụ như liệu rằng các phân tử ZFN cải biến có kích họat hệ thống miễn dịch khiến cho chúng bị đào thải ra khỏi cơ thể. Kế đến là sự giới hạn với dòng tế bào đang thực nghiệm. Kỹ thuật
này thực sự bị giới hạn bởi các dòng tế bào tách từ bệnh nhân, cải biến ex vivo và sau đó cho quay lại cơ thể, như vậy các kỹ thuật được sử dụng cho việc chuyển gene in vivo sẽ tỏ ra không hiệu quả. Cuối cùng, điều quan trọng là phải xác định tính đặc hiệu của ZFN trong tế bào như thế nào và liệu rằng sự dò tìm và tái sắp xếp DNA có thực sự diễn ra ở điểm đánh dấu hay không? Bằng cách sử dụng kỹ thuật Southern blot, Urnov và cộng sự cho thấy là không có sự nhầm lẫn khi đánh dấu DNA đích cần hiệu chỉnh và cũng không có sự tái sắp xếp bất thường. Do vậy cần phải có những nghiên cứu chi tiết hơn nữa
về những vấn đề nói trên.