LAI PHÂN TỬ (DNA Hybridization)

Chia sẻ: Vo Anh Hoang | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:50

Thêm vào BST

Báo xấu

417
lượt xem 79
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing). Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được phát triển.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LAI PHÂN TỬ (DNA Hybridization)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Lớp : DHO4SH BÀI THUYẾT TRÌNH LAI PHÂN TỬ (DNA Hybridization)
Thành viên : 1. Lê Duy Hoàng Chương 1. 2. Lê Vũ Hồng Hải 3. Nguyễn Thúy Hằng 4. Đặng Cao Hạnh 5. Vũ Quang Hiếu 6. Huỳnh Thanh Hồng 7. Trần Ánh Hồng 8. Nguyễn Thị Tuyết Nga 9. Mã Phạm Quế Mai
DÀN BÀI CHUNG DÀN I-Lịch sử lai phân tử II–Cơ sở của sự lai phân tử III-Các phương pháp lai phân tử IV-Ứng dụng của lai phân tử Tài liệu tham khảo Tài
I-Lịch sử lai phân tử: - 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing). Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được phát triển. - Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid).
Từ sự phát triển đó, việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng.  Mục đích : Sử dụng lai DNA như một kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng.
II–Cơ sở của sự lai phân tử : II–C 1–Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “ của DNA : Khi một phân tử DNA mạch đôi Khi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch.
Đường cong Tm
2–Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA : - Ảnh hưởng của các thành phần nh base trong phân tử DNA . - Ảnh hưởng của độ dài đoạn nh DNA . - Ảnh hưởng của các điểm bắt nh cặp sai lệch (các mismatch) . - Ảnh hưởng của môi trường nh phản ứng .
3-Khái niệm về lai phân tử : - Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách Sau rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột. - Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong Lúc môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được gíảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiiện tượng này được gọi là sự lai phân H  tử (molecular hybridization).
 Đặc điểm :  Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung.  Các trình tự bổ sung có thể là Các DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA.
4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử : 4-1 Nồng độ DNA và thời gian phản ứng - Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng ;  tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên. - Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp.
4-2 Nhiệt độ 4-2 Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%. 4-3 Độ dài của các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các trình tự bổ sung. 4-4 Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 -10 lần . Nồng độ NaCl > 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng.
III-Các phương pháp lai phân tử : III-Các Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, cơ bản có thể chia thành 3 nhóm lớn : - Lai trong pha lỏng Lai - Lai trên pha rắn Lai - Lai tại chỗ (in situ hybridization) Lai
1-Lai trong pha lỏng : 1-Lai 1-1 Nguyên tắc : - Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. - Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ.
1-2 Phân tích định lượng các phân tử 1-2 lai : 3 phương pháp thường được sử dụng: - Phương pháp dùng quang phổ kế - Phương pháp sử dụng nuclease S1 - Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite
i. Phương pháp dùng quang phổ kế i. - DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA DNA mạch đơn. - Sự chuyển từ mạch đôi sang dạng mạch chuy đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm. - Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử Giá mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect). ).
Hiiệu ứng siêu sắc : H Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút. Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm. Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi.
i. Phương pháp sử dụng nuclease S1 - Nuclease S1 là enzyme thủy giải các Nuclease nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm. - Dung dịch phản ứng lai được trích ra một Dung phần, đem xử lí với nuclease S1. - Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic Các acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng .
i. Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite i. - Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat Hydroxylapatite calci . -Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết. - Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng Sau được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600C trong một dung dịch đệm Natri phosphat. phosphat.